Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 6
1.1 .Многолетние кормовые злаковые травы и их грибы- симбионты 6
1.2.Методы обнаружения грибов-эндофитов 8
1.3. История изучения грибов-эндофитов мнолетних злаковых трав 9
1.4.Таксономическое положение грибов-эндофитов злаковых трав 10
1.5. Эволюция грибов-эндофитов рода Neotyphodium.{ Gams W.A., Schardl C.L, Christensen M.J.) 11
1.6. Особенности роста и развития грибов рода Neotyphodium 12
1.7. Проблема токсикозов травоядных животных 13
1.7.1. Эрготалкалоиды 13
1.7.2. Индол-детерпены 14
1.7.3. Насыщенные аминопирролизидины 15
1.7.4. Методы исследования алкалоидов 17
1.8. Преимущества «эндофитинфицированных» трав 18
1.8.1. Повышение засухоустойчивости злаковых трав 18
1.8.2. Устойчивость «эндофитинфицированных» трав к отрицательным температурам 19
1.8.3. Влияние грибов-эндофитов на вегетационное развитие «эндофитинфицированных» растений 20
1.8.4. Влияние грибов-эндофитов на число побегов и рост корней
1.8.5. Влияние грибов-эндофитов на эффективность усвоения углеводов
1.8.6. Накопление зеленой массы у «эндофитинфицированных» растений
1.8.7. Влияние грибов-эндофитов на семенную продуктивность многолетних кормовых злаковых трав 22
1.8.8. Влияние грибов-эндофитов на устойчивость «эндофитинфицированных» растений злаковых трав к нематодам, насекомым-вредителям и патогенам 22
1.9. Заключение 23
Глава 2. Исходный материал и методы исследования 24
2.1. Объект исследования 24
2.2. Методы исследования 25
2.2.1. Микроскопия 25
2.2.1.1. Световая микроскопия 25
2.2.1.2. Выращивание колоний 25
2.2.1.3. Стереомикроскопия 26
2.2.1.4. Электронная трансмиссионная микроскопия 26
2.2.2.1. Анализ эрготных алкалоидов 27
2.2.2.2. Анализ индол-детерпенов (лолитрема) 28
2.2.2.3. Анализ насыщенных пирролизидинов (лолина) 28
2.2.3. Метод тестирования морозостойкости 29
2.2.4. Электрофорез проламинов овсяницы луговой 29
2.3. Оборудование 29
2.4. Математическая обработка результатов 31
Глава 3. Полученные результаты 31
3.1.Результаты микроскопического исследования 31
3.1.1.Световая микроскопия 31
3.1.2.Выращивание колоний 32
3.1.3. Стереомикроскопия колоний 33
3.1.4. Электронная микроскопия колоний гриба-эндофита 34
3.1.5. Характеристика образцов коллекции овсяницы луговой из коллекции ВИР по результатам микроскопических исследований 35
3.2. Результаты анализа алкалоидов в семенах образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР 37
3.3. Исследование морозостойкости «инфицированных» и «неинфицированных» образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР 40
3.4. Исследование полиморфизма электрофоретических спектров проламина «инфицированных» и «неинфицированных» образцов овсяницы луговой 50
Глава 4. Влияние процесса репродукции и условий хранения на «инфицированность» образцов луговой коллекции ВИР 55
Глава 5. Статистическая обработка результатов 57
Обсуждение 64
Заключение 69
Выводы 70
- Влияние грибов-эндофитов на вегетационное развитие «эндофитинфицированных» растений
- Характеристика образцов коллекции овсяницы луговой из коллекции ВИР по результатам микроскопических исследований
- Исследование морозостойкости «инфицированных» и «неинфицированных» образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР
- Исследование полиморфизма электрофоретических спектров проламина «инфицированных» и «неинфицированных» образцов овсяницы луговой
Введение к работе
Актуальность темы. Получение новых высокоурожайных и устойчивых к биотическим
абиотическим стрессам сортов многолетних кормовых злаковых трав остается важным
направлением селекции. Для этих целей за рубежом уже два десятилетия используется
естественная симбиотическая ассоциация трав с грибами-эндофитами рода Neotyphodium
(=Acremonium) семейства Clavicipitaceae [1, 8, 22, 60, 73].
По литературным данным 95 % образцов овсяницы луговой (Festuca pratensis Huds.) и тростпиковидпой (F. arundinaceae Schreb.) в США, более 60 % в Новой Зеландии и до 52 % в Восточной Европе содержат мицелий гриба рода Neotyphodium [22, 28, 36, 44, 55, 67, 78]. В симбиоз с эндофитами вступают злаковые травы, которые согласно классификации Н. Н. Цвелева [18] являются представителями главным образом следующих триб семейства злаков (Poaceae Barnh.): Triticeae Dum. (роды Elymus L. и Hystrix Moench), Bromeae Dum. (род Bromus L.), Aveneae Dum. (роды Agrostis L., Calamagrostis Adans.j, Phleeae Dum. (род Phleum L.), Poeae R. Br. (роды Dactylis L., Festuca L., Lolium L. и Poa L.). Наиболее широко распространенными и практически востребованными в качестве сельскохозяйственных культур являются овсяницы луговая (F. pratensis) и тростниковидная (F. arundinaceae) и плевел многолетний (Lolium perenne L.) [22, 27, 67, 78].
В результате симбиоза многолетних злаковых трав и грибов-эндофитов значительно повышается устойчивость растений-хозяев к биотическим и абиотическим стрессовым факторам, в частности к различным насекомым-вредителям (личинка аргентинского долгоносика, злаковая тля, полосатая хлебная блошка и др.) и температурным колебаниям. Кроме того, инфицированные эндофитными грибами злаковые травы обнаруживают повышенную семенную продуктивность, ускорение колошения, а также увеличение выхода зеленой массы растений. Существует мнение, что грибы-эндофиты повышают способность своих растений-хозяев к адаптации их к неблагоприятным условиям окружающей среды, в том числе влияя на степень генетического разнообразия растений-хозяев [52, 59]. Наряду с улучшением ряда хозяйственно-ценных признаков, эти симбионты могут придавать растениям-хозяевам и отрицательные свойства. Грибы-эндофиты синтезируют ряд алкалоидов, которые могут вызвать интоксикацию у животных [20, 58, 70, 86].
Следовательно, одним из перспективных направлений работы с мировым генофондом многолетних кормовых злаковых трав является исследование их симбиотических отношений с грибами-эндофитами рода Neotyphodium. Важным представляется выяснение механизмов повышения устойчивости растений-хозяев к неблагоприятным факторам среды и увеличения
их продуктивности, а также сведение к минимуму отрицательных проявлений, обусловленных присутствием симбиотических грибов и их жизнедеятельностью [28, 29, 38, 52, 53, 59].
Целью Целью настоящей работы явилось изучение образцов коллекции овсяницы луговой, содержащих грибы-эндофиты рода Neotyphodium, для дальнейшего использования эндофит-содержащих образцов в селекции этой культуры, (далее говоря о присутствии мицелия грибов-эндофитов в растении мы будем иногда использовать термин -«инфекция».)
В связи с этим мы поставили перед собой следующие задачи:
• выделить из коллекции образцы, содержащие (Е+ образцы) и не содержащие (Е-образцы) грибы-эндофиты рода Neotyphodium;
• изучить коллекцию овсяницы луговой по признаку присутствие (Е+ образцы) или отсутствие (Е- образцы) грибов-эндофитов рода Neotyphodium;
• осуществить видовую идентификацию грибов-эндофитов в образцах овсяницы луговой;
• исследовать в Е+ образцах содержание и состав алкалоидов;
• исследовать содержание и состав алкалоидов в семенах Е+ и Е- образцов овсяницы луговой;
• выяснить степень влияния грибов-эндофитов на морозостойкость растения-хозяина овсяницы луговой;
• изучить полиморфизм запасных белков — проламинов у Е+ и Е- образцов. Научная новизна. В нашей стране систематические исследования симбиотических
отношений многолетних кормовых злаковых трав и их грибных симбионтов не проводились.
Впервые образцы овсяницы луговой (F. pratensis) из коллекции отдела генетических ресурсов кормовых растений ВИР были изучены нами на наличие грибов-эндофитов. Проведена идентификация гриба-эндофита, обнаруженного в образцах семян овсяницы луговой. Дана характеристика Е+ образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР по биохимическим показателям (содержанию и составу алкалоидов), связанным с жизнедеятельностью грибов-эндофитов рода Neotyphodium. На примере овсяницы луговой, было изучено их влияние на адаптивные способности растений-хозяев (морозостойкость). Изучен полиморфизм запасных белков - проламинов у Е+ и Е- образцов.
Практическая значимость работы. В результате проведенного исследования в коллекции овсяницы луговой отдела генетических ресурсов кормовых культур ВИР были
определены Е+ образцы. У Е+ образцов в незначительных количествах были найдены алкалоиды опасные для травоядных животных. В выявленных Е+ образцах было подтверждено отсутствие алкалоидов, опасных для травоядных животных. Подтверждено положительное влияние грибов-эндофитов на адаптивные способности растений-хозяев (в частности, на морозостойкость).
Подтверждены преимущества Е+ образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР по сравнению с образцами, не имеющих грибов-симбионтов. В Е+ образцах овсяницы луговой обнаружено присутствие алкалоида лолина, влияющего на устойчивость растений-хозяев насекомым-вредителям. Е+ образцы овсяницы луговой оказались более устойчивыми к низким температурам по сравнению с образцами, не содержащими гриб-эндофит. Намечены перспективы использования молекулярных подходов к оценке адаптивных свойств Е+ популяций.
Проведенные исследования свидетельствуют в пользу актуальности и целесообразности изучения имеющегося в России генофонда многолетних злаковых трав в аспекте их симбиотических отношений с грибами-эндофитами в связи с перспективами более широкого использования этого феномена в отечественной селекции, которая должна быть направлена на использование потенциала микробно-растительпых взаимодействий в том числе на поиск оптимальных сочетаний генотипов гриба и растения хозяина.
Апробация работы. Результаты работы доложены на научно-практических конференциях аспирантов и молодых ученых ВНИИР им. Н.И. Вавилова в 2001 и 2003 гг. и на Международной научно-практической конференции (Санкт-Петербург, 2001, 2002), на Международном Микробиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 2003), на IX съезде Русского ботанического общества (Новосибирск, 2003) на конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2004), конференции молодых ученых (Пушкин, 2005).
Публикации. Опубликовано 7 печатных работ, 2 в печати.
Влияние грибов-эндофитов на вегетационное развитие «эндофитинфицированных» растений
Проблеме влияния грибов-эндофитов на устойчивость злаковых трав, содержащих эти грибы-эндофиты к насекомым-вредителям и нематодам были посвящены работы многих исследователей[23, 29, 85]. В работах К. D. Gwinn и др. сообщается, что Е- сеянцы овсяницы луговой были более восприимчивы к нематодам вида Rhizostonia zea по сравнению Е+ сеянцами [41]. Устойчивость к R. zeae повышалась с ростом уровня «инфицированности» рассады грибами-эндофитами [93]. Было высказано, предположение, что под влиянием грибов-эндофитов в растении происходят следующие изменения: утолщаются клеточные стенки корней, что приводит к затруднению питания нематод, повышается синтез таких ферментов, как хитиназа, который связан с оборонительной реакцией растения в ответ на воздействие нематод и др.[41, 93]. В 1990 году СР. West и др. обнаружил, что около Е+ растений кладка яиц нематод была значительно меньше, чем около Е- растений [90, 116]. Таким образом, Е+ сорта стали рекомендовать к посеву в районах, где велика угроза заражения нематодами.
Большую пользу приносят многолетним кормовым злаковым травам грибы-эндофиты, защищая их от насекомых-вредителей. В Новой Зеландии, Е+ овсяница и Е+ райграсс защищены от настоящего бича пастбищ - личинок аргентинского стебелькового долгоносика Listonotus bonariensis [119]. J.F.White и др. в 1996 году установили, что между уровнем содержания эндофитов в райграссе и выживаемостью личинок аргентинского стебелькового долгоносика существует обратная связь. С увеличением содержание грибов-эндофитов количество личинок снижалось, а выживаемость побегов овсяницы и райграсса наоборот повышалась [119].
Совка травяная Balanoccocus роае и тля семейства Homoptera: Phopolosium padi, которые паразитируют на овсянице и являются основными распространителями вируса желтой карликовости, отдают предпочтение в питании Е- растениям, т.к. выживаемость их личинок на Е+ растениях значительно ниже. L.P. Bush и др. в 1993 году продемонстрировали, что Е+ растения только наполовину поражались вирусом желтой карликовости, переносимого тлей. По наблюдениям H.L. Eichenseer и др. на пастбищах с Е+ многолетними кормовыми злаковыми травами видовое разнообразие насекомых-вредителей было значительно ниже по сравнению с пастбищами, состоящими из Е- трав. Присутствие грибов-эндофитов защищает многолетние кормовые злаковые травы также и от злаковой тли Schizapis graminum, черного таракана Heteronychus arato, совки травяной Graphania mutans [29,44,93].
Возбудитель корончатой ржавчины злаков Puccina coronata является наиболее частым грибным патогеном овсяниц [102]. Развитие новых рас головни, вызванное быстрым мутационным процессом, затрудняет работу по выведению устойчивых к ним культур. В 1991 году было решено исследовать влияние присутствия грибов-эндофитов на устойчивость растений-хозяев к корончатой ржавчине. В ходе эксперимента было установлено, что большая часть Е+ рассады овсяницы сорта «Kentucky 31», инокулированной урединоспорами корончатой ржавчины злаков, осталась непораженной по сравнению с Е- рассадой; т.о. Е+ растения оказались более устойчивыми к такому патогену, как P. coronata. Поэтому был сделан вывод о том, что грибы-эндофиты влияют на восприимчивость злаков к корончатой ржавчине.
Исходя из выше сказанного ясно, что грибы-эндофиты оказывают положительное влияние на хозяйственно-ценные свойства своих растительных хозяев. Следовательно, образцы Е+ многолетних кормовых злаковых трав могут быть использованы как исходный материал при создании новых устойчивых к неблагоприятным факторам среды сортов и улучшении старых. Очевидно, что на первом этапе необходим скрининг генофонда многолетних кормовых злаковых трав для выявления Е+ материала. Приоритетность в изучении различных видов многолетних злаковых трав зависит от практической важности того или иного вида для страны. Из упомянутых выше представителей кормовых злаковых трав к таковым для России относятся овсяницы.
Актуальным остается изучение генетических ресурсов злаковых трав в плане понимания природы и механизмов их взаимоотношений с эндофитными грибами. На основании анализа литературных данных очевидно, что важным элементом в понимании механизмов взаимоотношений грибов-эндофитов и растения-хозяина является изучение метаболитов грибов, в первую очередь алкалоидов, продуцируемых грибами-эндофитами. Грибы-эндофиты очевидно повышают «фепотипическое выражение разнообразия ответной реакции овсяницы на стресс» [23, 56], поэтому популяции Е+ растений фенотипически более полиморфны [28, 68]. У растения-хозяина при взаимодействии с микроорганизмами (грибами рода Neotyphodium) проявляются признаки, которыми оно не обладало в свободноживущем состоянии (засухоустойчивость, морозостойкость, токсичность для травоядных животных и по отношению к насекомым-вредителям) [23, 56, 68, 71, 87]. Появление этих признаков является результатом комплементарного взаимодействия растительных и микробных генов, ходе которого осуществляется их тонкая перекрестная регуляция [7]. Поэтому актуальным является также изучение процессов, происходящих в популяциях растений-хозяев в результате инфицирования грибами-эндофитами.
В исследование взяли семена 270 образцов овсяницы луговой (F. pratensis Huds) коллекции отдела генетических ресурсов многолетних кормовых культур ГНЦ РФ ВИР им. Н.И.Вавилова (ВИР). Поскольку отсутствовала какая-либо информация о степени и характере распространения грибов-эндофитов рода Neotyhpodium в образцах кормовых злаковых трав коллекции ВИР, принципиальное значение для данной работы имел подбор материала для исследований. Так в исследования были взяты образцы репродуцированные в разные годы на Павловской опытной станции (ПОС) ВИР, а также оригинальные образцы, собранные экспедициями ВИР в разных регионах России и мира (таб. 1 приложения).
Образцы для исследований были подобраны по принципу максимальной географической представленности данного вида. 214 из них были представлены образцами разных лет репродукции ПОС ВИР (159 дикорастущих и 55 сортовых образцов), а 56 оригинальными образцами, собранными экспедициями ВИР в разных регионах России и мира (23 дикорастущих и 33 сортовых образца). 166 образцов происходили из различных регионов России и 104 - из зарубежных стран. По природным зонам образцы распределялись следующим образом: 109 образцов происходили из зоны лесов, 63 - из зоны тайги, 59 - из зоны степей, 16 - из зоны тундры и 2 образца - из зоны альпийских лугов. Большая часть образцов - 255, происходила из мест с умеренным климатом, 12 образцов из зоны с субтропическим климатом и 3 образца из зоны с субарктическим климатом (рис.4, рис.5 приложения).
Характеристика образцов коллекции овсяницы луговой из коллекции ВИР по результатам микроскопических исследований
По результатам световой микроскопии было установлено, что мицелий гриба-эндофита присутствовал в семенах 53 образцов овсяницы луговой, что составляло 20 % от общего числа изученных образцов. Среди Е+ образцов 81 % образцов имели российское происхождение, а 19 % - зарубежное.
Анализ распределения Е+ образцов по природным зонам показал, что большинство их (78 %) происходило из таёжной, лесной и лесостепной зон (рис.10). 18 Е+ образцов было из приходилось 6 % Е+ образцов (3 образца), на лесостепную зону - 21 % (11 образцов) и на степную зону - 13 % (7 образцов). Один образец овсяницы луговой происходил из тундры и один из зоны альпийских лугов. Из 53 Е+ образцов овсяницы луговой: 31 относился к дикорастущим и 22 к культурным образцам (рис.9), 39 образцов имели оригинальное происхождение, а 14 были репродуцированы на ПОС ВИР. За исключением одного (к-25237, сорт Хибинская из Мурманской области - субарктическая климатическая зона), все Е+ образцы произрастали в природных зонах с умеренным климатом (рис.4 приложения). зонам. мицелий гриба) овсяницы луговой варьировал от 2 % до 100 %. По уровню «инфицированное» Е+ образцы овсяницы луговой разделили на три группы (таб. 2 приложение), что соответствует распределению образцов по уровню «инфицированное», приведенному в ряде публикаций [33, 53, 76]: группа с низкими показателями «инфицированности» (2 % - 20 %); группа со средними показателями «инфицированности» (21 % - 60 %); группа с низкими показателями «инфицированности» (61 % - 100 %). Первая группа образцов (с низким уровнем «инфицированности») состояла из Е+ 9 образцов. Вторая группа (со средним уровнем «инфицированности») и третья (с высоким уровнем «инфицированности») содержали по 22 Е+ образца. Внутри каждой из групп Е+ образцы распределялись по природным зонам, следующим образом. В первой группе преобладали Е+ образцы из зоны тайги (4 образца) и леса (3 образца). Вторая группа состояла в основном из образцов происходивших из зоны лесостепи (7 образцов) и леса (6 образцов). Третья группа Е+ образцов в основном состояла из образцов, происходивших из таежной зоны (10 образцов). В первой группе 5 образцов были дикорастущими, а 4 культурными; 5 образцов было репродуцировано на ПОС ВИР, а 4 образца были оригинальными. Во второй группе 13 образцов были культурными, а 9 -дикорастущими; 16 образцов были оригинальными, а 6 - репродуцированы на ПОС ВИР. Третья группа была представлена 17 дикорастущими Е+ образцами и 5 - культурными; 19 оригинальными образцами и 3 образца репродукциями ПОС ВИР.
По результатам проведенного анализа можно заключить, что среди Е+ образцов овсяницы луговой большую часть составляли образцы со средним и высоким уровнем «инфицированное» - 44 образца (83 % от общего числа Е+ образцов). Среди Е+ образцов с высоким уровнем «инфицированности» преобладали образцы из таежной природной зоны. Основную часть образцов этой группы составили образцы оригинального происхождения. Также большинство образцов этой группы были дикорастущими.
Большая часть Е+ образцов была представлена дикорастущими образцами оригинального происхождения, что видимо связано с тем, что в ходе хранения и репродукции овсяницы луговой на ПОС «инфицировашюсть» образцов грибами-эндофитами рода Neotyphodium не контролировалась.
Содержание и состав алкалоидов грибов-эндофитов рода Neotyphodium были изучены в 270 образцах овсяницы луговой из коллекции ВИР. Из группы эрготных алкалоидов определяли эрговалин по методу, указанному выше. Перед анализом было установлено, что образцы семян овсяницы луговой не поражены Claviceps sclerotia, т.к. присутствие этого гриба влияет на результаты анализа эрготных алкалоидов. Концентрацию эрговалина в образцах семян овсяницы луговой рассчитывали по следующей формуле.у=13,4-106-х+0,45. Где: у - концентрация эрговалина в образце, в мкг/г сухого веса семян образца; 13,4-106 и 0,45 - стандартные коэффициенты, устанавливаемые экспериментально; х - площадь пика эрговалина анализируемого образца. Время выхода эрговалина было 4,65±0,2 мин от начала анализа. При подсчетах учитывали возможность образования изомеров, поэтому конечный результат представлял собой сумму изомеров эрговалина (эрговалина и эрговалинина). Из группы индол-детерпенов определяли лолитрем В. Исследование образцов проводилось по методу, описанному выше. Концентрацию лолитрема В в образцах семян овсяницы луговой рассчитывали по следующей формуле: у=3,2-106-х+4486,4-106. Где: у -концентрация лолитрема В в образце, в мкг/г (сухого веса семян образца); 3,2-106 и 4486,4-106 - стандартные коэффициенты, устанавливаемые экспериментально; х - площадь пика лолитрема В анализируемого образца. Время выхода лолитрема В составляло 8,73±0,2 мин от начала анализа.
Из группы насыщенных аминопирролизидинов определяли N-ацетиллолин. Исследование образцов проводили по методу, описанному выше. Концентрацию N-ацетиллолина в образцах семян овсяницы луговой рассчитывали по следующей формуле: у=2214,5-106-х+116,5-106. Где: у - концентрация N-ацетиллолина в образце, в мкг/г(сухого веса семян образца); 2214,5-106 и 116,5-106 - стандартные коэффициенты, устанавливаемые экспериментально; х - площадь пика N-ацетиллолина анализируемого образца. Время выхода N-ацетиллолина составило 14,87±0,2 мин (рис.11).
В семенах всех Е+ образцов овсяницы луговой был обнаружен алкалоид лолин. Его содержание составило от 0,11 мкг/г до 2,32 мкг/г. В среднем значение содержания долина составило - 0,74 мкг/г, при среднем отклонении 0,41 мкг/г. Эрговалин был найден только у 14 Е+ образцов (26 % от общего числа Е+ образцов). Его содержание колебалось от 0,02мкг/г до 0,69мкг/г. Лолитрем В был найден у 22 образцов (41,5 % от общего числа Е+ образцов) и его содержание составило от 0,013 мкг/г до 0,46 мкг/г. В Е- образцах алкалоиды обнаружены не были (таб. 3 приложения). Следовательно, в Е+ образцах в значительных количествах был найден только алкалоид лолин (характерный для гриба-эндофита N. uncinatum). Концентрация других алкалоидов лолитрема В и эрговалина у Е+ образцов была менее 0,50мкг/г и 0,70мкг/г соответственно, что гораздо ниже порогового уровня токсичности для травоядных животных -1,80-2,00 мкг/г.
По содержанию лолина Е+ образцы овсяницы луговой можно разделить на две группы: образцы с содержанием лолина менее 0,6 мкг/г и образцы с содержанием лолина более 0,6 мкг/г (по данным литературы, такое содержание лолина является достаточным для защиты растения-хозяина от насекомых вредителей) [41, 53, 97]. В первой группе было 22 образца (41,5 % от числа всех Е+образцов). Содержание лолина в этой группе колебалось в пределах - от 0,11 мкг/г до 0,55 мкг/г (среднее значение лолина было 0,37 мкг/г, среднее отклонение было 0,11 мкг/г).
Исследование морозостойкости «инфицированных» и «неинфицированных» образцов овсяницы луговой из коллекции ВИР
Известно, что условия хранения семян сказываются на жизнеспособности мицелия грибов-эндофитов [74, 75]. Из 270 изученных нами образцов овсяницы луговой 56 были оригинальными (нерепродуцированными) образцами. Среди них «эндофит-инфицированными» оказались образцов. Из остальных 214 репродуцированных на ПОС ВИР «инфицированными» оказалось только 14 образцов. Таким образом, основную часть «инфицированного» материала составили образцы оригинального происхождения (таб. 2, приложение).
Для того, чтобы ответить на вопрос как влияли условия хранения образцов на жизнеспособность гриба-эндофита мы изучили 10 оригинальных (хранившихся 20 лет и более) образцов овсяницы, в семенах которых был найден мицелий N. uncinatum и 10 этих же образцов, репродуцированных на ПОС ВИР в 2000 г. (таб. 9). В результате изучения репродуцированных образцов было установлено, что мицелий гриба-эндофита N. uncinatum присутствовал в семенах только двух из них: к-37107 (дикорастущий образец) и к-40884 (Кубанская-2). Таким образом, из десяти исходно «инфицированных» и хранившихся в коллекции образцов после их репродукции «инфицированными» оказались только два, которые мы протестировали на жизнеспособность мицелия гриба-эндофита. Для этого семена проращивали и 10-дневные проростки изучали на предмет обнаружения мицелия гриба-эндофита N. uncinatum. По результатам световой микроскопии установили, что мицелий N. uncinatum отсутствовал в зеленых частях растения. Следовательно, мицелий N. uncinatum, обнаруженный в семенах этих двух репродуцированных образцов овсяницы луговой, оказался нежизнеспособным. В противном случае его можно было бы обнаружить в листовых влагалищах проростков, т.к. мицелий гриба развивается вместе с тканями растения, как было описано выше. Полученные результаты можно объяснить тем, что на жизнеспособность грибов-эндофитов существенно (в данном случае - негативно) повлияли условия хранения семян [74]. Известно, что для поддержания жизнеспособности мицелия грибов-эндофитов в семенах необходимо соблюдение ряда условий хранения, в частности влажность не должнапревышать 6% [33, 75]. При несоблюдении этих условий мицелий грибов-эндофитов может потерять свою жизнеспособность уже через б месяцев. При оптимальных условиях мицелий может оставаться жизнеспособным гораздо дольше [33]. Таким образом, результаты нашего эксперимента подтверждают вывод о том, что при несоблюдении условий хранения мицелий гриба-эндофита теряет свою жизнеспособность и доля Е+ образцов может сокращаться.
Статистическая обработка данных была проведена с использованием методов многомерной статистики — дисперсионного и кластерного анализов. Указанные методы мы применили для оценки степени влияния такого фактора как инфицированность на содержание в семенах алкалоидов, а также связи последнего фактора с уровнем морозостойкости соответствующих образцов.
Дисперсионный анализ (ANOVA) позволил выявить связь между: наличием грибов-эндофитов и содержанием лолина, а также между наличием грибов-эндофитов и уровнем морозостойкости (показатель LT50), что продемонстрировано на диаграммах размаха -отрезках (рис.13, 14). Величина доверительных интервалов значений, полученных в результате проведенных исследований такова, что доверительные интервалы Е+ и Е- групп образцов не пересекают друг друга. Таким образом, Е+ и Е- образцы по показателям содержания лолина и морозостойкости являются отличными друг от друга группами. Проведенная статистическая обработка полученных данных показала, что достоверное влияние на уровень морозостойкости и содержание лолина оказывал только один фактор, а именно - присутствие гриба-эндофита в растении, что подтверждается значениями доверительной вероятности (Р=0,05) и коэффициента Фишера (F=102, 94).
На первой гистограмме (рис.15) показано распределение проанализированных образцов по содержанию лолина. Е- образцы овсяницы луговой сгруппировались в районе нулевой отметки, а Е+ образцы равномерно распределились на графике в зависимости от уровня содержания долина в них. Большая часть образцов, содержащих лолин (Е+ образцов) оказалась в части графика, где содержание долина было равно и превышало 0,6 мкг/г. На рисунке 16 приведена гистограмма, которая отражает распределение образцов по результатам теста на определение морозостойкости. Характер распределения образцов соответствует распределению Пуассона [111]. Кривая распределения была сдвинута относительно значения -12 С и имела два подъема: один на уровне значений LT50 -10С - -12 С и другой при LT50 -16 С - -18 С. Основная часть Е- образцов была сосредоточена в районе нулевой отметки. В диапазоне значения LT50 0 С —10 С доля устойчивых Е-образцов превышала таковую Е+ образцов. В тоже время, доля Е+ образцов, устойчивых к температуре ниже -10 С была больше таковой Е- образцов, т. е значения LT50 Е+ образцов сосредоточены главном образом в диапазоне температур от -10 С и ниже.
На секторных диаграммах (рис.17) наглядно продемонстрирован характер распределения образцов овсяницы луговой, в том числе Е+ образцов, по природным зонам на фоне всех исследованных нами образцов. «Инфицированные» образцы встречались практически во всех зонах кроме зоны пустыни и полупустыни. Е+ образцы были лучше представлены в зонах тайги, лесотундры и лесостепи (более 15 % от числа всех исследованных образцов). В зонах тундры, степи и леса доля их присутствия составляла менее 15 % и в зоне альпийских лугов доля присутствия Е+ образцов была равна 15 %. Из вышесказанного следует, что результаты приведенного статистического анализа в основном подтверждают сделанные нами ранее выводы о распределении Е+ образцов по природным зонам.
Для Е+ образцов была отмечена обратная корреляционная связь между уровнем «инфицированное» и значениями LT 50 (морозостойкостью) (г=-0,5), а также между показателями морозостойкости и содержанием лолина в образцах (г=-0,6). Между показателями «инфицированности» и содержанием алкалоидов корреляционная связь отсутствовала (г=0,05). Эти данные подтверждают сделанные нами ранее выводы о связи показателей «инфицированности» и содержания лолина с устойчивостью Е+ растений к отрицательным температурам.
Исследование полиморфизма электрофоретических спектров проламина «инфицированных» и «неинфицированных» образцов овсяницы луговой
Получение новых высокоурожайных и устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам сортов многолетних кормовых злаковых трав остается важным направлением селекции. Уже более двух десятилетий в Европе, Канаде, США и Новой Зеландии применяется новый подход в селекции сортов многолетних кормовых злаковых трав. Он заключается в использовании естественной симбиотической ассоциации злаковых трав с грибами-эндофитами представителями рода Neotyphodium [22, 61, 75].
Уже более двух десятилетий в ряде стран Европы, Канады, США и Новой Зеландии «инфицированный» эндофитами генофонд активно используется в селекции многолетних злаковых трав. По данным зарубежных исследователей «инфицированность» овсяниц, райграса и др. составляет в Восточной Европе 52 %, в США - 95 % и в Новой Зеландии -60% [22, 28, 56, 59, 106]. Выше мы уже говорили о том, что обширные исследования проводились и проводятся по изучению влияния симбиотических грибов рода Neotyphodium на проявление селекционных признаков у растений-хозяев [22, 26]. В частности, исследования К.Дж. Олдрич выявили, что грибы-эндофиты влияют на устойчивость Е+ растений к засухе [27]. В результате исследований проведенных N.S.Hill, A.Sakai и др. было подтверждено, что Е+ травы более устойчивы к отрицательным температурам [50, 99]. В 1997 г. C.L. Sharld [100] и др. установили, что грибы-эидофиты ускоряют сроки колошения и увеличивают количество побегов. T.L. Holder и др. [58] в 1985 г была обнаружена повышенная активность фермента (глютаминсинтетазы) у Е+ растений по сравнению с таковым Е-. Зависимость урожая зеленой массы и семян от уровня «инфицированное» грибами-эндофитами была исследована J.S. Rais, М.Р. Rolston и др. [91, 94, 103]. Данные о повышенной устойчивости Е+ злаковых трав к насекомым-вредителям, нематодам и грибным патогенам были получены C.L. Sharld, Q. Yue и др. [100, 116, 124]. Исследованиями G.F.White и др. [117] было установлено, что влияние грибов-эндофитов на рост и развитие растений-хозяев скорее всего связано с их влиянием на синтез фитогормонов таких как ИУК и абсцизовая кислота.
После обнаружения связи между алкалоидами, вырабатываемыми грибами-эндофитами рода Neotyphodium, и токсикозами травоядных животных исследователи направили свои усилия на изучение этой проблемы. Известны работы B.L. Berde, L.P. Bush и др. [25, 26, 29, 59, 89], где приведены методы анализа содержания основных значимых алкалоидов грибов-эндофитов, определены предельно допустимые концентрации (ПДК) для эрготных алкалоидов и лолитрема В [72, 84, 87, 88].
В настоящее время за рубежом (США, Канада, Новая Зеландия и др.) Е+ сорта составляют большую часть широко используемых кормовых злаковых трав. Проблема изучения этой группы грибов-симбионтов продолжает быть актуальной. Во многих генных банках мира «инфицированный» эндофитами материал активно используется для создания новых стойких к стрессовым факторам сортов кормовых культур.
В этой связи изучение грибов-эндофитов многолетних кормовых злаковых трав является актуальным и для нашей страны. В качестве объекта для наших исследований была выбрана одна из наиболее широко распространенных и практически востребованных в России и северо-западном регионе кормовая культура - овсяница луговая. Подбор материала из коллекции отдела генетических ресурсов кормовых растений ВИР был осуществлен в соответствие с задачами исследования. Было подобрано 270 образцов семян разных лет репродукций ПОС и оригинальных образцов, собранных экспедициями ВИР в разных регионах России и мира.
Анализ данных световой и электронной микроскопии позволил нам сделать вывод о том, что мицелий, обнаруженный в семенах образцов овсяницы луговой из коллекции ВНИИР им. Н.И.Вавилова, принадлежит грибу-эндофиту вида N. uncinatum. Такое сочетание растения-хозяина (в данном случае овсяницы луговой) и вида гриба (в данном случае N. uncinatum) было ранее неоднократно описано в работах других исследователей [31, 34, 35, 101]. При исследовании образцов овсяницы луговой методом световой микроскопии помимо мицелия Neotyphodium также определялся мицелий р-эндофитов. По данным C.L. Sharld, M.J. Christensen и др. при световой микроскопии овсяницы луговой кроме грибов-эндофитов рода Neotyphodium могут определяться другие грибы, имеющие похожую структуру мицелия, а именно: эндофиты, имеющие сходную морфологию с Phialophlora, что известно из литературы [31, 46, 101]. Эти грибы объединены под названием р-эндофитов. Их отличительной чертой является сильное ветвление гифов в пределах всей растительной ткани и более интенсивная окраска мицелия красителями, указанными выше. Для овсяницы луговой европейского происхождения характерно присутствие р-эндофитов [31, 67]. Таким образом, при изучении семян овсяницы луговой необходимо учитывать возможность присутствия мицелия р-эндофитов. При исследовании колоний гриба-эндофита, полученных их зеленых частей растений Е+ образцов овсяницы луговой коллекции ВИР, нами также были выявлены признаки, характерные для колоний гриба N. uncinatum. Из литературы известно, что для колоний грибов-эндофитов рода Neotyphodium характерно формирование воздушных гиф, поэтому колонии имеют вид сходный с волокнами хлопка. Отличительной чертой разных видов грибов-эндофитов рода Neotyphodium является особенность взаимного расположения фиалид (конидиофор) и отрастающих от них конидий. Образование прямых и изогнутых фиалид, постепенно сужающихся на конце, и образование «крючковатых» конидий, является признаком характерным для мицелия гриба N. uncinatum. Для других грибов-эндофитов рода Neotyphodium (N. lolii и N. coenophialum), характерны более короткие, чем у N. uncinatum, конидии и Т-образное соединение фиалид и конидий [33, 46]. Для подтверждения видовой принадлежности гриба-эндофита нами было проведена электронная микроскопия, по результатам которой было окончательно установлено, что образцы семян овсяницы луговой из коллекции ВИР содержат мицелий гриба-эндофита N. uncinatum. Сопоставление наших данных с литературными дает нам основание утверждать, что нами были выделены образцы семян овсяницы луговой из коллекции ВИР, содержащие мицелий гриба-эндофита, идентифицированного как N. uncinatum. Из литературы следует, что для симбионта луговой овсяницы характерны, как было сказано выше, прямые и изогнутые фиалиды, длиной 4-17 нм, шириной 0,8-1,6 нм, фиалиды постепенно сужаются к концу до 0,6-0,9 нм. Каждая фиалида образует единичную "крючковатую" конидию, длиной 5-12 нм и шириной 1,0-1,6 нм. У N. lolii и N. coenophialum конидии более короткие - 5-8 нм [37, 46, 86]. При анализе результатов электронной микроскопии необходимо учитывать, что условия выращивания растения-хозяина могут оказать влияние на параметры мицелия гриба-эндофита и скорость его развития. Медленный рост рассады в контейнерах с ограниченным объемом, при сокращенном периоде освещения и пониженном питании приводит к образованию мицелия, гифы которого имеют диаметр менее 1,0 нм и появляются в листовых влагалищах рассады только на 8-10 неделе развития проростков. В растениях, выросших при хорошем освещении и в большом объеме высокопитательной почвы, гифы грибов-эндофитов достигают диаметра 2-3 нм и появляются в листовых влагалищах проростков уже на 6-8-ой неделе [24, 34, 46]. При проведении исследования мы строго соблюдали условия выращивания: достаточный объем питательной почвы и оптимальный световой режим.
