Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Простейшие и бактерии как экологическая компонента биологических ресурсов водоемов 12
1.2. Лизоцим как биотический фактор, регулирующий взаимодействия простейших и бактерий в водных экосистемах 16
1.3. Тяжелые металлы как загрязнители водной среды 20
1.4. Мониторинг загрязнения водоемов как приоритетная задача охраны биологических ресурсов 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Микробиологические методы 32
2.1.1. Определение общей численности микроорганизмов в воде 32
2.1.2. Определение общего числа сапрофитных бактерий в воде 33
2.1.3. Определение количества и уровня активности антилизоцимактивных бактерий 33
2.1.4. Определение количества лизоцимактивных бактерий. 34
2.2. Методы выделения и оценки биологического разнообразия простейших 34
2.2.1. Выделение и определение численности простейших.. 34
2.2.2. Идентификация простейших 35
2.2.3. Оценка биологического разнообразия простейших 36
2.2.4. Вычисление обилия и постоянства видов 36
2.2.5. Определение сходства протозойних сообществ 36
2.2.6.Содержание культуры инфузорий в лабораторных условиях 37
2.2.7.0пределение литической активности гомогенатов простейших 37
2.2.8. Определение спектра антимикробного действия гомогенатов простейших 38
2.2.9. Методика проведения токсикологических исследований с использованием сообщества простейших 39
2.2.10. Методы сокультивирования простейших и бактерий и учет результатов их взаимодействия 41
2.3. Статистическая обработка результатов 43
Глава 3. Природные условия и гидрохимическая характеристика водных ресурсов р. Урал ... 44
3.1. Природные условия района исследования 44
3.2. Гидрохимическая характеристика 45
Глава 4. Состояние и динамика развития биоре сурсов простейших и бактерий в биоцено зах р. урал в районе г. Оренбурга 53
4.1. Характеристика биологического разнообразия простейших в биоценозах р. Урал в районе г. Оренбурга: видовое разнообразие, сезонная и пространственная динамика 53
4.2. Характеристика микробоценозов р. Урал в районе г. Оренбурга 71
4.2.1. Динамика общей численности и количества сапрофитных бактерий 72
4.2.2. Лизоцим-антилизоцимное микробное сообщество в биоресурсах р. Урал в районе г. Оренбурга 80
Глава 5. Лизоцим - антилизоцимная система как один из механизмов управления протисто-бактериальными ресурсами водных экосистем 87
5.1. Механизмы межпопуляционных взаимодействий простейших и бактерий 87
5.2. Спектр антимикробного действия гомогенатов простейших . 106
5.2.1. Действие лизоцимной активности гомогенатов простейших на грамположительные микроорганизмы 107
5.2.2. Действие лизоцимной активности гомогенатов простейших на грамположительные микроорганизмы с известным уровнем антилизоцимной активности 109
5.2.3. Действие лизоцимной активности гомогенатов простейших на грамотрицательные микроорганизмы 112
Глава 6. Охрана природных водоемов от антропогенного загрязнения: простейшие как индикаторы степени загрязнения тяжелыми металлами сточных вод 114
6.1. Экспериментальное исследование по выявлению чувствительности и устойчивости сообщества простейших к токси ческому действию кадмия, свинца и никеля 115
6.1.1. Оценка токсического действия кадмия 117
6.1.2. Оценка токсического действия свинца 131
6.1.3. Оценка токсического действия никеля 142
6.2. Биоиндикаторы превышения предельно допустимых концентраций хрома, цинка и меди 154
Заключение 162
Выводы 177
Практические рекомендации 179
Список литературы 189
Приложение 206
- Лизоцим как биотический фактор, регулирующий взаимодействия простейших и бактерий в водных экосистемах
- Определение количества и уровня активности антилизоцимактивных бактерий
- Характеристика микробоценозов р. Урал в районе г. Оренбурга
- Спектр антимикробного действия гомогенатов простейших
Введение к работе
В современных условиях развитие производительных сил сопровождается вовлечением в переработку огромной массы природных ресурсов и увеличением выбросов нерециклируемых отходов производства (в том числе и тяжелых металлов) в биосферу.
Данные обстоятельства делают особо актуальными в вопросах природопользования максимальное сохранение экологического равновесия как на планете в целом, так и в ее отдельных регионах. Исходя из сказанного, одной из актуальных проблем использования и сохранения природных ресурсов является защита среды обитания от загрязняющих веществ, поскольку загрязнения - это часто ресурсы оказавшиеся не на своем месте (Одум Ю., 1986).
Ценой загрязнения водных ресурсов может стать потеря биологических ресурсов водных экосистем. А потому изучение состояния микробных, животных и растительных сообществ, их динамика в водных экосистемах, механизмов управления их жизнедеятельностью, охраны и воспроизводства, весьма актуально, т.к. полученные данные дают ключи к сохранению их биологического разнообразия в водных экосистемах.
Актуальность темы. Природными ресурсами для человечества являются абсолютно все ресурсы биосферы, а биологические (бактериальные, растительные и животные), являющиеся предметом потребления и обладающие мощнейшей средообразующей и средорегулирующей функцией, занимают среди них особое место (Николайкин Н.И., 2003). Данные обстоятельства - делают особо актуальными в вопросах природопользования максимальное сохранение экологического равновесия биоресурсного потенциала как в целом в биосфере, так и в отдельном регионе. Однако решение данной проблемы возможно лишь при условии изучения биоразнообразия и выяснения механизмов управления биоресурсным потенциалом.
Живые организмы существуют в тесной связи друг с другом, находясь в симбиотических отношениях (Бухарин О.В., 1999). Своеобразие биоресурсов различных биотопов, обусловлено совокупным действием комплекса абиотических факторов (Шварц С.С., 1980; Одум Ю., 1986) и биологическими особенностями членов сообщества, определяющими характер взаимоотношений между ними, которые сложились в процессе эволюции (Бульон В.В., 1998, 2002; Копылов А.И., 2000). Хотя простейшие и бактерии являются неотъемлемой частью природных водоемов, механизмы формирования протисто-бактериальных ресурсов в них наименее изучены (Сомов Г.П., 1988; Плотников А.О., 2002).
Одним из экологически значимых факторов, принимающих участие в формировании биоресурсов водоемов является лизоцим (Багнюк В.М., 1980; 1983; Устинова Г.М., 2004; Шостак Е.И., 2004). Показано существование в пресных водных экосистемах особой функциональной системы «лизоцим гидро-бионтов - антилизоцим бактерий» (Соловых Г.Н., 1995; Немцева Н.В., 1998), способствующей формированию простых и сложных сетевых связей между гидробионтами.
Однако до сих пор остается недостаточно изученной роль функциональных связей типа «лизоцим простейших - антилизоцим бактерий» в механизмах формирования протисто-бактериальных ресурсов водоемов. Мало данных о таксономическом спектре простейших, динамики их развития во времени и географии водоема, а также их роли в формировании бактериоресурсного потенциала р. Урал и особенно в отношении автохтонных бактерий, которые как известно определяют процессы самоочищения водоемов (Романенко В.И., Кузнецова СИ., 1974).
В условиях развития производительных сил происходит вовлечение в переработку огромной массы природных ресурсов и выброс нерециклируемых отходов производства (в том числе и тяжелых металлов) в водоемы. Ценой поступающего в водные ресурсы загрязнения может стать потеря биологических ресурсов экосистем. На данном этапе развития биосферы наиболее остро стоит проблема ее загрязнения тяжелыми металлами (Иллялетдинов А.Н., 1984). Несмотря на то, что в процессе эволюции живые организмы приспособились к наличию тяжелых металлов в окружающей среде и выработали механизмы регуляции к их усвоению, в условиях растущего техногенного загрязнения остаются некоторые допустимые количества поглощения тяжелых металлов, выше которых регуляторные механизмы не справляются с проявлением негативного воздействия их на организм. Выявление чувствительных к действию определенных концентраций металла гидробионтов, позволит использовать их в качестве биоиндикаторов загрязнения водоемов.
Таким образом, важное значение протисто-бактериальных ассоциаций для водоемов, а также отсутствие сведений о механизмах управления их биоресурсным потенциалом в водных экосистемах, свидетельствует об актуальности проведения данного исследования.
Цель работы — изучение биологического разнообразия и динамики развития простейших, оценка их роли в механизмах управления бактериоресурс-ным потенциалом р. Урал и разработка принципов охраны водоемов от антропогенного загрязнения тяжелыми металлами.
Задачи исследования.
1. Определить биологическое разнообразие и динамику развития ресурсов простейших в р. Урал в районе г. Оренбурга.
2. Оценить значение системы «лизоцим простейших — антилизоцим бактерий» в механизмах управления процессами формирования бактериоресурсного потенциала водных экосистем автохтонного и аллохтонного происхождения.
3. В условиях эксперимента и натурных исследований выявить чувствительные к токсическому загрязнению тяжелыми металлами виды простейших и обосновать методические подходы к их использованию в охране водных ресурсов от загрязнения металлами.
Научная новизна. Проведена оценка состояния биоразнообразия простейших в р. Урал в районе Оренбурга, выявлены доминирующие виды и получены данные о сходствах и различиях в географии протистооресурсов на исследованных участках реки. Впервые установлено литическое действие простей ших как на грамположительные так и на грамотрицательные бактерии аллох тонного и автохтонного происхождения. Обосновано представление о том, что сохранение численности, разнообразия бактериальных ресурсов в водоемах определяется уровнем антилизоцимной активности бактерий, которая осуществляет деградацию лизоцима фагосом простейших. Отсутствие антилизоцимной активности или ее низкий уровень (2-4 мкг/мл) определяют чувствительность к лизоциму простейших и как следствие их элиминацию из биоресурсов, а высокий уровень (6-8 мкг/мл) - устойчивость к его действию и незавершенность процесса фагоцитоза бактерий, т.е. их сохранению в биоценозе. Предложена модель системы управления видовым разнообразием и численностью протисто-бактериальных ресурсов водных экосистем, основанная на взаимодействии «лизоцимной активности простейших - антилизоцимной активности бактерий». В условиях эксперимента и натурных исследований в р. Урал и очистных сооружений, по результатам оценки изменения плотности сообщества простейших и отдельных видов, индекса видового разнообразия, показателей постоянства и обилия видов под токсическим воздействием металлов в биоценозе, выявлены виды устойчивые и чувствительные к различным концентрациям кадмия, свинца, никеля, хрома, цинка и меди. Определены индикаторные виды микроорганизмов на превышение предельно допустимых концентраций по хрому, цинку и меди и использованы при обосновании методических принципов в контроле за степенью очистки сточных вод от данных металлов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют теоретические представления о биоразнообразии и эколого-функциональных взаимоотношениях простейших и бактерий в р. Урал в районе Оренбурга. В результате проведенных исследований обоснована система управления механизмами формирования протисто-бактериальными ресурсами водных экосистем - «лизоцим простейших - антилизоцим бактерий».
Практическое значение исследования заключается в возможности использования простейших, как индикаторов загрязнения тяжелыми металлами водо емов. Выявлены виды микроорганизмов чувствительные к превышению ПДК по кадмию, свинцу, никелю, хрому, цинку и меди.
Разработан «Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди», основанный на констатации исчезновения из биоценозов очистных сооружений Vorticella microstoma и Litonotus lamella, что свидетельствует о превышении ПДК по хрому; Colpidium colpoda, Notommata ansata, Cathypna luna, Monostula cornuta о превышении ПДК по цинку; Epystilis plicatilis, Vorticella campanula о превышении ПДК по меди (положительное решение о выдаче патента Российской Федерации от 20 января 2005г. (заявка №2003126248/13 (028088)). Способ обеспечивает охрану водных ресурсов от антропогенного загрязнения тяжелыми металлами.
Результаты исследования легли в основу создания «Методического пособия по использованию гидробионтов активного ила в процессах биологической индикации степени очистки сточных вод очистных сооружений», предназначе-ного для лаборантов лабораторий очистных сооружений, а также для экологов и санитарных врачей (Оренбург, 2003).
Реализация результатов исследования. «Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди» внедрен в работу Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центра гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» (акт внедрения от 18.04.2005), лабораторий городских очистных сооружений г. Оренбурга (акт внедрения от 21.03.05).
«Методическое пособие по использованию гидробионтов активного ила в процессах биологической индикации степени очистки сточных вод очистных сооружений» внедрено в работу комитета по природоохранной деятельности и мониторингу окружающей среды администрации Оренбургской области (акт внедрения от 30.03.2004); лабораторий городских очистных сооружений г. Оренбурга (акт внедрения от 19.04.2004); Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центра гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» (акт внедрения от 25.04.2005).
Полученные данные применяются в системе вузовского образования студентов на кафедре общей и коммунальной гигиены с экологией человека Оренбургской государственной медицинской академии (акт внедрения от 09.04.03), а также включены в лекционный курс «Зоология беспозвоночных» для студентов специальностей «биология» и «экология» ОПТУ (акт внедрения от 05.05.05).
Апробация диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002; II международной конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий», Оренбург, 2002; региональных научно-практических конференциях молодых ученых, Оренбург, 2003, 2004, 2005; международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и биологии», Оренбург, 2003; I международной научно-практической конференции «Биолементы», Оренбург, 2004; II Всероссийской конференции «Экосистемы малых рек: биоразнообразие, экология, охрана» на базе ИБВВ РАН Ярославская обл. п. Борок 2004; областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2005», Оренбург, 2005; Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2005, Москва, 2005.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 1 журнальная статья, 1 методическое пособие и получено положительное решение о выдаче Патента РФ на изобретение от 20 января 2005г. (заявка №2003126248/13 (028088)).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение. Указатель литературы содержит 141 отечественных и 34 зарубежных источника литературы. Текст иллюстрирован 17 таблицами, 33 рисунками, 18 фотографиями.
Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование выполнено в ГОУ ВПО «Оренбургской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» в соответствии с открытым планом научно-исследовательской работы (государственный регистрационный номер темы 01.2.00 316166).
Положения выносимые на защиту.
1. Состояние и динамика протисторесурсов р. Урал в районе Оренбурга.
2. «Лизоцим простейших - антилизоцим бактерий» - система управления механизмами регуляции протистобактериальными ресурсами водных экосистем.
3. В целях охраны водных ресурсов предложен способ биологического контроля за степенью очистки сточных вод от хрома, цинка и меди по исчезновению определенных видов микроорганизмов, чувствительных к превышению ПДК по металлу.
Лизоцим как биотический фактор, регулирующий взаимодействия простейших и бактерий в водных экосистемах
Известно, что лизоцим является одним из экологически значимых факторов, принимающих участие в формировании биологических ресурсов гидробиоценозов и имеет первостепенное значение в ряду биологически активных веществ (Багнюк В.М., 1980, 1983).
Под термином лизоцим в микробиологии, биохимии и медицине подразумевают обширную группу бактериолитических ферментов, способных гидро-лизовать муреиновый каркас клеточных стенок бактерий, главным образом грамположительных (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974; Кокряков В.Н., 1999). Это довольно разнообразная по происхождению группа катионных белков, обладающих как сходством, так и отличиями в физико-химических свойствах и антибактериальной активности. Все ферменты этой группы термостабильны и обладают высоким положительным зарядом, в то же время, различаются молекулярные массы лизоцимов различного происхождения. Так, молекулярная масса лизоцима молока равна 15 000 Да, лизоцима папайи 25 ОООДа, а лизоцима фигового дерева 29 ОООДа. Кроме того, различается и оптимум рН их активности, который лежит в диапазоне значений от 4,5 до 7,0 (Поборнов В.М., Берды-ев А.А., 1991; JollesP., 1967) (табл. 1).
По данным ряда авторов лизоцим широко распространен среди живых организмов и встречается на всех этапах эволюции. Так, данный фермент обнаружен у фагов (Koch G., Dreyer W., 1958), бактерий (Thomson L., 1940), простейших (Chung J.C., 1969), моллюсков (Ломакин М.С., 1990; Carballal M.J., 1997; Карнаухова И.В., 2000), насекомых (Mohrig W., Messner В., 1969; Malke H., 1965), птиц (Norman A.A., Richard S., 1970) и растений (Ермольева З.В., 1938).
У животных и человека лизоцим присутствует в слюне, слезах, тканях сердца, селезенки, лимфатических узлов, почек, скелетных мышцах и мозге. Особенно высоки его концентрации в барьерных органах - печени, селезенке, почках, легких (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974).
Исследованиями последних лет обосновано существование в пресных водоемах особой функциональной системы «лизоцим-атилизоцим» на уровне бактериоценозов (Соловых Г.Н., 1995) и в водорослевых сообществах (Алехина Т.П., 1996). Показано, что среди различных групп гидробионтов - бактерий, микроводорослей, зоопланктеров широко распространена лизоцимная активность и наблюдается высокая частота встречаемости лизоцимного фактора (Соловых Г.Н., 1995; Алехина Г.П., 1996; Немцева Н.В., 1998). Показано, что лизо-цим-антилизоцимные взаимоотношения служат универсальным механизмом, обеспечивающим существование сочленов альго-бактериальных и протозойно бактериальных сообществ (Соловых Г.Н., 1995; Немцева Н.В., 1998; Плотников А.О., 2002).
Вероятно, лизоцим, как фактор естественного иммунитета, может выступать как фактор устойчивости, обеспечивая доминирование определенных видов в биоценозе.
Так, исследованиями Соловых Г.Н., Минаковой В.В., Карнауховой И.В. (2003) показано, что в пределах одного и того же семейства моллюски, принадлежащие к разным родам Unio и Anodonta, характеризуются различным уровнем лизоцимной активности, при этом моллюски вида U. pictorum, проявляя более высокую лизоцимную активность, оказываются более устойчивыми к возрастающей микробной нагрузке на гидробиоценозы и характеризуются более высокими адаптационными возможностями к изменяющимся условиям среды. Авторами был сделан вывод, что, доминирование определенного вида моллюсков связано, по-видимому, с высоким уровнем продукции и активности лизоцима.
Как известно, лизоцимной активностью обладают различные группы гид-робионтов, в том числе и простейшие. Лизоцим простейших впервые обнаружил Chung J.C. (1969) исследуя физико-химические свойства бактериолитиче-ского фермента у амебы Hartmanella glebae.
В настоящее время накоплено достаточное количество данных о лизоцимной активности простейших, широкое распространение которой у представителей протистопланктона подтверждает представление о простейших как о фагоцитарных микроорганизмах. В водных биоценозах среди простейших выявляются, различные по степени лизоцимпродукции виды - как с высокой (Р. caudatum, Т. pyriformis, P. palustris), так и с низкой (М cordiformis). У таких простейших как С. colpoda, С. cucullus, V. nebulifera, L. cygnus, D. anser наблюдается средний уровень проявления лизоцимного признака (Немцева Н.В., 1998; Плотников А.О., 2002) (табл. 2).
Определение количества и уровня активности антилизоцимактивных бактерий
Антилизоцимактивные бактерии в воде определялись по методике Бухарина О.В. (1984). К 1,5% питательному агару добавляли определенные дозы яичного лизоцима, так, чтобы в среде создавалась концентрация лизоцима 3-6 мкг/мл. В чашки Петри помещали 1мл исследуемой воды и заливали средой с лизоцимом. После суточной инкубации в термостате при температуре 25-28С выросшие колонии убивали парами хлороформа в течение 30-40 мин. Затем чашки заливали 0.7% агаром, смешанным с индикаторной культурой Micrococcus lysodeikticus № 2665 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Антилизоцимактивные бактерии учитывались после суточной инкубации в термостате по наличию зон стимуляции роста М. lysodeikticus.
Уровень антилизоцимной активности у водных бактерий определялся по методике Бухарина О.В. (1984). Готовили ряд чашек Петри с питательным агаром, содержащим лизоцим в различных концентрациях (от 1 до 10 мкг/мл). На поверхность приготовленных сред пятачками засевали исследуемые культуры микроорганизмов. После суточной инкубации при заданной температуре чашки стерилизовали парами хлороформа и заливали 0,7% агаром, содержащим тест-культуру на лизоцим М. lisodeikticus. Через сутки инкубации в термостате при 37С производили учет результатов по наличию зон роста микрококка над и вокруг колоний исследуемых культур. За уровень антилизоцимной активности штамма принималось максимальное значение концентрации лизоцима в среде, при которой наблюдался рост микрококка.
Лизоцимактивные микроорганизмы выявляли путем посева воды на агар, содержащий тест-культуру на лизоцим Micrococcus lysodeikticus; либо воду сеяли, как обычно, глубинным способом. Через сутки чашки стерилизовали парами хлороформа и заливали 0,7% МПА. Лизоцимактивные бактерии учитывали после суточной инкубации по зонам лизиса микрококка вокруг колоний (Бухарин О.В., 1984).
Простейших выделяли из планктонных проб объемом 2 л, которые отбирали батометром Молчанова с глубины не более 50 см. Пробы протистопланк-тона обрабатывали в живом состоянии в день сбора, чтобы учесть состояние и видовой состав простейших до наступления необратимых изменений, вызванных хранением. Концентрацию и подсчет простейших проводили общепринятым методом (Мамаева Н.В., 1975), который заключается в следующем. Проба воды объемом 500 мл концентрируются фильтрацией через мембранный фильтр фирмы «Сынпор» с диаметром пор 0,40 мкм до конечного объема 10 мл. Предварительно оценивается примерное количество простейших в пробе. Если численность простейших в пробе меньше 500 кл/л, то весь объем про сматривается под световым бинокулярным микроскопом при увеличении
Если численность простейших более 500 кл/л, то в дальнейшем учет мелких и крупных форм протистов производится дифференцированно. Для этого 0,5-1,0 мл концентрированной пробы распределяют по каплям на предметном стекле и просматривают полностью для подсчета мелких форм. Остальной объем просматривается для учета крупных форм под бинокулярным микроскопом. Расчет численности простейших производится по формуле: где Пі - количество мелких форм в 0,5 мл, а П2 - количество крупных форм в 9,5 мл. Аналогичным образом производится подсчет численности отдельных видов простейших. Частоту встречаемости отдельных видов рассчитывали по шкале Старма-ха (Starmach К., 1955) в модификации Плотникова А.О. (2002)
Характеристика микробоценозов р. Урал в районе г. Оренбурга
Жизнь биоты водоема, его биоценозов обуславливается деятельностью бактериального населения, которое неразрывно связано с жизнедеятельностью более высоко организованных представителей фито- и зоопланктона. Деятельность микроорганизмов тесно связана с экологической обстановкой окружающей среды, ее физическими и химическими особенностями и со всем комплексом гидробионтов.
Поступающие в водоем органические вещества, равно как и образующиеся в нем в результате синтеза первичной продукции, подвергаются воздействию со стороны всех групп гидробионтов. Основную роль в минерализации органических соединений играют бактерии (Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов СИ., 1977; Новожилова М.И., Семенченко Г.В., Мукашев Н.З., 1985). Бактериальное население водоема делится на аллохтонное, то есть поступающее извне, и аутохтонное, присущее водоему. Аллохтонные бактерии вносятся в водоем с дождевыми стоками, а также со сточными и очищенными водами. Среди них преобладают сапрофитные формы, но могут быть и болезнетворные микроорганизмы (Борисов Л.Б., Смирнова A.M., 1994). На качественный состав микрофлоры основное влияние оказывает происхождение воды как среды обитания: пресные поверхностные (воды рек, ручьев, озер, прудов и водохранилищ), подземные (почвенные, грунтовые, артезианские), атмосферные (дождь, снег) и соленые (морские и озерные воды).
Количественные соотношения микроорганизмов в открытых водоемах варьируют в широких пределах, что зависит от типа водоема, степени его загрязнения, смены метеорологических условий, сезона (Романенко В.И., 1979). Исследования общей численности бактериальной флоры воды в биоресурсах пресных водоемов показывают, что ее численность достигает сотен тысяч и даже нескольких миллионов в 1 мл (Соловых Г.Н., 1995; Немцева Н.В., 1998; Мисетов И.А., 1999). Этими исследованиями также показано, что развитие бактерий в воде водоемов разной трофности в течение года происходит с образованием отчетливо выраженных максимумов и минимумов.
В проводимых нами исследованиях общей численности бактерий (ОЧБ) в среднем течении реки Урал в период 2003-2004г.г. оценивалась динамика численности бактерий как по сезонам года, так и по годам, а так же изменения общей численности бактерий на разных станциях водоема. Результаты исследований показали, что, в 2003-2004г.г. наблюдались различия в максимальных и минимальных величинах ОЧБ. Так ОЧБ в 2003 году колебалась от 2900кл/мл до 17990 кл/мл; в 2004 от 977 кл/мл до 5800 кл/мл (рис. 6-9). По всей вероятности, такое повышение численности бактерий в 2003 году связано с поступлением аллохтонной микрофлоры с водосборной площади, так как в этот год отмечено более интенсивное выпадение осадков и уровень воды в водоеме был высоким (Павлов Г.П., 2003).
В 2003 году на станциях Водозабор, Автомобильный мост, Железнодорожный мост отмечалось постепенное увеличение общего числа бактерий с мая по октябрь, в то время как на ст. Сброс с очистных уже с сентября происходило заметное снижение ОЧБ. Анализ среднегодовых данных общей численности бактерий показал, что на станциях Водозабор, Автомобильный мост, Железнодорожный мост она составила соответственно 8211+49; 9147+52; 9581+61, т.е. примерно была одинакова. В то время как на станции Сброс с очистных среднегодовая численность бактерий была на порядок выше и составила 11049+68. Максимальная обсемененность воды на этой станции отмечалась в августе.
В сезонной динамике ОЧБ в 2004 году были выявлены следующие закономерности: на всех станциях, кроме Сброс с очистных, в мае, июле, сентябре и октябре отмечена примерно одинаковая численность бактерий, которая на всех станциях в эти месяцы колебалась от 4000 кл/мл до 5787 кл/мл и в среднем составляла 4432+30 кл/мл. В тоже время на всех исследуемых станциях отмечалось снижение ОЧБ в июне и августе до 977-1234 кл/мл. На станции Сброс с очистных в динамике ОЧБ прослеживалось два пика: май и июль, когда ОЧБ составляла 5215-5800 кл/мл (в среднем 5507+25 кл/мл), в остальные же месяцы исследования ОЧБ в среднем составляла 2932+20 кл/мл. Максимальное значение ОЧБ было зафиксировано в июле на станции Сброс с очисных и составило 5800 кл/мл. Минимальная численность бактерий - 977 кл/мл отмечена в августе на станции Водозабор.
Таким образом, при определении общей численности бактерий выявлены межгодовые изменения численности бактерий, обусловленные колебанием уровня воды в водоеме; в сезонной динамике 2003 года отмечено постепенное повышение ОЧБ с мая по октябрь на станциях Водозабор, Автомобильный мост, Железнодорожный мост, а на станции Сброс с очистных с мая по август происходило увеличение ОЧБ, а с сентября по октябрь ее снижение. В 2004 году наблюдалось снижение ОЧБ на станциях Водозабор, Автомобильный мост, Железнодорожный мост в июне и августе, тогда как на станции Сброс с очистных в течение данного периода исследований отмечалось постепенное снижение ОЧБ с мая по октябрь, с одним пиком увеличения ОЧБ в июле.
Оценка сапрофитирующих бактерий в составе микробиоресурсов, дает представление о содержании легкодоступного органического вещества в биоте. Изучение сапрофитной микрофлоры реки Урал на разных станциях показало, что в 2003 году количество сапрофитов изменялось на Урале от 232 КОЕ/мл до 14200 КОЕ/мл, в 2004 от 320 КОЕ/мл до 3600 КОЕ/мл (см. рис. 6-9). Средние данные количества сапрофитов в 2003-2004 гг. даны табл. 13.
Спектр антимикробного действия гомогенатов простейших
Известно, что яичный лизоцим обладает высокой антибактериальной активностью в отношении фамположительных культур таких как: Micrococcus lysodeikticus № 2665 и Staphylococcus epidermidis №33. Так, Карнауховой И.В. (2000) показано его ингибирующее действие на данные микроорганизмы. При изучении антимикробной активности лизоцима моллюсков U. pictorum методом серийных разведений в жидких питательных средах было показано, что данный препарат активен как в отношении фамположительных {Micrococcus lysodeikticus № 2665, Staphylococcus epidermidis №33, Arthrobacter globiformis №11), так и фамотрицательных {Escherichia coli, Enterobakter cloacae №17, Salmonella eneriditis № 1258) культур (Карнаухова И.В., 2000; Нефедова E.M., 2001). Принимая во внимание тот факт, что лизоцимы различного происхождения обладают достаточно высоким уровнем антибактериальной активности в отношении как фамположительных, так и фамотрицательных микроорганизмов, представлялось актуальным изучить спектр лизоцимной активности гомогенатов простейших.
Наличие лизоцимной активности в гомогенатах простейших исследовалось на основе оценки способности гомогенатов простейших лизировать тест культуру на действие лизоцима: Micrococcus lysodeikticus (штамм № 2665 ГИСК им. Л.А.Тарасевича). Исследование показало, что уровень лизоцимной активности колебался в пределах 0,8+0,2 - 1,2+0,4 ед./мг белка, что и позволило в дальнейшем предположить лизоцимоподобную субстанцию в гомогенатах простейших. Для изучения спектра лизоцимной активности гомогенатов простейших были взяты фуппы микроорганизмов в соответствии с их биологическими особенностями (Трунова О.Н., 1982), которые входят в состав микроборесурс ного потенциала р. Урал (Мисетов И.А., 1999): 1. Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae (микроорганизмы кишечной группы): Enterobakter cloacae №17, Escherichia coli — M-17, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella enteriditis, Shigella sonnei, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa. 2. Микроорганизмы, размножающиеся в воде: Corynebakterium ammoni-agenes. 3. Микроорганизмы, переживающие в воде: Staphylococcus epidermidis штамм № 33. 4. Споровые формы микроорганизмов: Bacillus subtilis. 5. Типичные представители водных биоценозов: Rhodococcus ruber № 386, Rhodococcus ruber № 377, Rhodococcus ruber № 222, Rhodococcus ruber № 90, Rhodococcus ruber № 83, Arthrobacter globiformis № 11. 6. Тест-культура на действие лизоцима: Micrococcus lysodeikticus штамм № 2665. Результаты исследований представлены в табл. 15. Исследование антибактериальной активности гомогенатов простейших в отношении тестируемых культур в сравнении с яичным лизоцимом показало, что гомогенаты простейших активны в отношении культур данных микроорганизмов. В отношении тестовой культуры Micrococcus lysodeikticus № 2665 яичный лизоцим и гомогенаты простейших проявляли одинаковую антибактериальную активность, подавляя рост культуры в разведении 1/2-1/256 (рис.1, приложение).
В отношении в отношении Arthrobacter globiformis №11 гомогенаты простейших оказывали подавляющие действие в разведениях 1/2-1/32, тогда как в присутствии яичного лизоцима развитие данной культуры шло без видимых отклонений (рис. 2, приложение). Таким образом, гомогенат простейших оказался активнее в отношении Arthrobacter globiformis, чем яичный лизоцим. Результаты исследования показали, что гомогенаты простейших проявляют более высокую антибактериальную активность в отношении Corynebacterium ammoniagenes, по сравнению с яичным лизоцимом. Так, препарат яичного лизоцима подавлял развитие данной культуры в разведении 1\4 тогда как гомогенат простейших действовал и в разведении 1/8 (рис. 3, приложение). Однако, следует отметить, что в отношении таких культур как Bacillus subtilis и Staphylococcus epidermidis №33 гомогенат простейших оказывал менее выраженное действие по сравнению с препаратом яичного лизоцима. Об этом говорит тот факт, что в присутствии гомогената простейших развитие культуры Bacillus subtilis начиналось с разведения 1/16, a Staphylococcus epidermidis №33 с 1/32, т.е. лизоцим гомогената простейших оказывал свое подавляющее действие на эти культуры в разведениях 1/2-1/8 и 1/2-1/16 соответственно, тогда как в присутствии препарата яичного лизоцима развитие данных культур не происходило вовсе (рис. 4, 5, приложение). Таким образом, тестируемые грамположителъные микроорганизмы Micrococcus lysodeikticus № 2665, Arthrobacter globiformis №11, Staphylococcus epidermidis №33 обладают более высокой, a Bacillus subtilis, Corynebacterium ammoniagenes меньшей степенью чувствительности к антибактериальному действию лизоцимной активности простейших.
