Введение к работе
1 Актуальность проблемы. Неорганические пирофосфатазы (РРазы; КФ 3.6.1.1)
являются ферментами, необходимыми для нормальной жизнедеятельности любой живой
клетки Они ответственны за контроль внутриклеточной концентрации пирофосфата
(РР,), который образуется при синтезе большинства биополимеров.
Все известные в настоящее время растворимые пирофосфатазы - олигомерные
белки. Пирофосфатаза Е. coli (ЕРРаза) представляет собой гомогексамер,
организованный как димер тримеров. РРаза является металлозависимым ферментом и
каждая субъеднннца имеет четыре центра связывания ионов металла, кроме того,
существует еще один центр присоединения металла, который находится в
межтримерном пространстве. К настоящему времени для ЕРРазы получены мутантные
формы, содержащие точечные замены функционально важных аминокислотных
остатков. Решены пространственные структуры для апоЕРРазы, ее комплекса с
сульфатом и ионами металлов, а также ряда мутантных ферментов; для пирофосфатазы
Я cerevisiae (УРРаза) определена структура комплекса с четырьмя ионами марганца и
двумя фосфатами (Рі) На основании существующей информации высказаны
предположения о механизме ферментативной реакции.
Согласованность метаболических процессов в клетке предусматривает регуляцию
ферментативной активности. Известно, что большинство РРаз являются
конститутивными ферментами, что предполагает поддержание уровня РР; в клетке
только за счет изменения каталитической активности фермента. Существует несколько
альтернативных путей регуляции для конститутивных ферментов: во-первых, регуляция
может осуществляться за счет взаимодействия фермента с компонентами клеточной
среды, во-вторых, для олигомерных ферментов существенную роль могут играть
процессы диссоциации-ассоциации, но одним из самых общих способов регуляции
активности конститутивных олигомерных ферментов является взаимодействие центров
связывания лигандов.
Несмотря на интенсивные исследования, вопрос о путях регуляции
пирофосфатазной активности до сих пор остается открытым. В настоящее время
известны некоторые природные агенты, которые могут изменять активность
пирофосфатазы. К таким агентам, в частности, относятся моноэфиры фосфорной
кислоты, представляющие собой продукты клеточного метаболизма. С помощью этих
соединений было обнаружено взаимодействие активных центров между двумя
тримерами, выражающееся в реакционной способности половины центров. Высказано
предположение, что причиной инактивации является образование ацилфосфатной связи.
2 Следует подчеркнуть, что молекула ЕРРазы имеет 12 потенциальных центров
связывания Pi, поскольку фермент состоит из шести субъединиц и каждый активный
центр имеет две плошадки связывания фосфата, образующегося из пирофосфата
Поэтому выявление системы взаимодействий, происходящих при связывании лигандов,
а также возможных путей передачи информации между субъединицами является
актуальной задачей.
Пель и задачи исследования. Главной задачей работы явилось расширение круга фосфатсодержащих соединений (ингибиторов и пирофосфата). позволяющих вскрыть систему взаимодействий центров связывания лигандов.
Работа включала следующие этапы: изучение взаимодействия ЕРРазы с неорганическим фосфатом; исследование влияния рН и концентрации фосфатсодержащих лигандов на инактивацию фермента; применение гидроксиламнна для локализации в первичной структуре пирофосфатазы аминокислотного остатка, подвергающегося фосфорилированию; сравнительное изучение кинетических свойств тримерной и гексамерной форм неорганической пирофосфатазы E.coli. а также химерных ферментов, представляющих собой объединение нативного (активного) и мутантного (малоактивного) тримеров.
Научная новизна и практическая ценность работы Показано, что ЕРРаза реагирует с Pi с образованием двух неактивных соединений - продукта фосфорилирования группы активного центра и прочного комплекса с Р,. Выявлено взаимосогласованное функционирование центров связывания фосфатсодержащих соединений. Предложено для локализации фосфорилированной аминокислоты в белке превращение ее в гидроксамат с последующим расщеплением пептидной связи между аспарагиновой кислотой и соседним остатком. Сделан вывод, что при фосфорилировании ЕРРазы образуется ацилфосфатная связь с Asp 67. Рассмотрен возможный механизм аффинного ингибирования ЕРРазы. Показана кооперативность субъединиц в тримере при связывании субстрата. Сделан вывод о согласованном функционировании всех активных центров в процессе катализа.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены н; Международной конференции «The First International Meeting on Inorganii Pyrophosphatases» (Турку, Финляндия, 1997 г.), на Международном конгрессе п< аналитической химии (Москва, 1997) и на Международной конференции «26th Meeting о the Federation of European Biochemical Societies» (Ницца, Франция, 1999) По матері^то диссертации опубликовано 3 статьи и одна находится в печати.
Объем и структура паботы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Материал иллюстрирован 25 рисунками и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 127 цитируемых работ.
