Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
1. Ковал ентные структуры хромофоров цветных гомологов зелёного флуоресцентного белка (GFP) как ключ к происхождению и механизмам эволюции семейства GFP- подобных белков
1.1.Введение 6
1.2. Структуры и свойства GFP и его гомологов. Структуры хромофоров GFP-подобных белков 7
1.3.Спектральные свойства GFP-подобных белков, вьщеляемых из них хромопептидов и синтетических модельных хромофоров 13
1.4.Некоторые свойства JV-ацилиминов 28
1.5.Фрагментация полипептидных цепей жёлтого и красных гомологов GFP 36
1.6. Роль отдельных аминокислотных остатков в последовательностях гомологов GFP в формировании их хромофоров и в их спектральных свойствах, выявляемая методами направленного и статистического мутагенеза 44
1.7.Структуры хромофоров жёлтого (zFP538) и пурпурного (asFP595) гомологов GFP и возможные механизмы их образования 49
1.8.Природные имидазо[1,2-а]пиразины, их синтетические аналоги и вопросы биосинтеза 57
1.9. Гипотезы о происхождении и эволюции семейства GFP-подобных белков: проблемы и перспективы 63
1.10.Заключение 69
2 Экспериментальная часть
2. Материалы и методы 71
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Экспрессия и выделение флуоресцентных белков 78
3.2. Денатурация zFP538, DsRed и asFP595, ферментативный гидролиз белков и вьщеление хромопептидов 79
3.3. Хромофорсодержащие пептиды, выделенные из белка zFP538 82
3.3.1. Аминокислотный и масс-спектрометрический анализ хромопептидов из ZFP538 82
3.3.2. Спектры поглощения и флуоресценции хромопептидов из zFP538 84
3.3.3. Исследования хромопептидов, выделенных из zFP538, методом спектроскопии ЯМР 88
3.3.4. Структуры хромофорсодержащих пептидов из zFP538 93
3.3.5. Подтверждение структуры хромопептидагРР538-Ш 102
3.4. Фрагментация полипептидной цепи zFP538 117
3.5. Направленный мутагенез zFP538 HZFP506 128
3.6. Свойства хромопептидов, вьщеленных из DsRed и asFP595, и их структуры. Фрагментация полипептидной цепи asFP595 131
3.7. Структура хромофора asFP595 143
3.8. Структура хромофора zFP538 146
Выводы 155
- Структуры и свойства GFP и его гомологов. Структуры хромофоров GFP-подобных белков
- Роль отдельных аминокислотных остатков в последовательностях гомологов GFP в формировании их хромофоров и в их спектральных свойствах, выявляемая методами направленного и статистического мутагенеза
- Гипотезы о происхождении и эволюции семейства GFP-подобных белков: проблемы и перспективы
- Аминокислотный и масс-спектрометрический анализ хромопептидов из ZFP538
Введение к работе
Исследования структур, образующихся в белках в результате посттрансляционных модификаций, остаются одним из важных направлений современной химии белка. Особенный интерес представляют (вероятно, очень древние эволюционно) самопроизвольные/автокаталитические процессы, приводящие к изменению не только и не столько боковых групп аминокислотных остатков, но и топологии основной полипептидной цепи с разрывом химических связей и образованием новых. Наиболее интригующее свойство подобных посттрансляционных модификаций - их спонтанное прохождение без участия ферментов и/или низкомолекулярных соединений. Одним из таких процессов является формирование хромофоров в семействе зелёного флуоресцентного белка (GFP) [Tsien, 1998]. Относительно недавно открытые многочисленные цветные гомологи GFP [Ando et al, 2002; Lukyanov et al, 2000; Matz et al, 1999] демонстрируют богатое разнообразие ковалентных модификаций вблизи общего ядра хромофора GFP-типа и обилие вариаций сходного на начальных этапах механизма образования этой сложной структуры. Исследователю открывается картина непосредственных эволюционных изменений весьма древнего биохимического механизма, по-видимому, уходящего своими корнями к истокам возникновения жизни на нашей планете. Многие процессы и конкретные биохимические реакции в этой группе хромофоров были обнаружены впервые в химии белка и остаются уникальными для этих объектов. Помимо своего общенаучного значения, GFP-подобные белки представляют и большой практический интерес. Применение гомологов GFP в качестве инструментов (например, как репортеров экспрессии генов) в биотехнологических и фундаментальных работах очень широко и общеизвестно [Verkhusha & Lukyanov, 2004; Lukyanov et al, 2005]. Но детальные исследования их хромофоров, несомненно, откроют новые перспективы и для биотехнологии низкомолекулярных метаболитов. Уже почти очевидно, что хромофоры GFP-подобных белков служили в далёком прошлом (вероятно, служат и поныне) предшественниками эндогенных имидазо[1,2-дг]пиразинов, пока малоизученного класса соединений, которые, по-видимому, важны для многих биохимических процессов в живых тканях и являются весьма многообещающими фармацевтическими прототипами лекарственных веществ. Одна из наиболее хорошо изученных функций природных имидазо[1,2-а]пиразинов - роль субстратов люциферазных реакций, лежащих в основе биолюминесценции (самосвечения) многих
неблизкородственных представителей животного царства. Помимо сугубо фундаментального интереса, биолюминесценция имеет и широчайшее практическое применение при визуализации многих биохимических процессов (как in vitro, так и in vivo), а субстрат люциферазной реакции нужен в качестве химического реактива, удешевление производства которого (биотехнологического взамен сложного химического синтеза) станет возможным вскоре после выяснения деталей его биосинтеза. Исследования структур и механизмов формирования хромофоров GFP-подобных белков совершенно необходимы для скорейшего решения этой важной прикладной задачи.
Представленная работа имела целью установление структур хромофоров и химических основ механизмов их формирования в двух гомологах GFP, жёлтом флуоресцентном белке (zFP538) и пурпурном нефлуоресцентном хромобелке (asFP595) из морских кишечнополостных. В ходе исследования решались следующие задачи:
1) разработка методов препаративной наработки, денатурации и протеолитической
деградации исследуемых белков с целью минимального повреждения их нативных
хромофоров;
разработка методов выделения содержащих хромофоры протеолитических пептидов;
препаративная наработка хромопептидов, их всестороннее изучение с привлечением ряда современных физико-химических методов: масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР ('Н и 13С), электронной спектроскопии и аминокислотного анализа;
установление, на основании полученных данных, структур хромопептидов из zFP538 и asFP595 и, в качестве контроля, из красного флуоресцентного белка DsRed;
установление, с учётом полученной информации о хромопептидах, а также на основании экспериментов с полноразмерными GFP-подобными белками (N-концевое секвенирование, масс-спектрометрические, хроматографические и электрофоретические исследования), точных сайтов самопроизвольной фрагментации полипептидных цепей zFP538 и asFP595 вблизи их хромофоров;
направленный мутагенез изучаемых GFP-подобных белков с целью изменения их хромофоров и способности к самопроизвольной фрагментации;
выдвижение обоснованных предположений о структурах хромофоров в нативных zFP538 и asFP595 и о возможных механизмах их формирования.
Структуры и свойства GFP и его гомологов. Структуры хромофоров GFP-подобных белков
GFP был открыт в 1962 году [Shimomura et al, 1962] в тихоокеанской медузе Aequorea victoria, обладающей яркой зелёной люминесценцией. Источником свечения этого организма является биолюминесценция, сопровождающая реакцию, катализируемую белком, получившим название акворин. История открытия последнего популярно изложена в работе [Shimomura, 1995], ссылку на которую мы даём, дабы привлечь внимание к этому изящному эссе. Если рассматривать термины "люциферин" и "люцифераза" расширительно, как родовые понятия уровня "субстрат" и "фермент", то акворин можно назвать люциферазой, а его субстратом (люциферином) служит соединение, получившее название целентеразин (I) [Shimomura & Johnson, 1978]. К подробному рассмотрению этого соединения мы ещё вернёмся. Здесь скажем только, что иногда его рассматривают как кофактор или даже метаболический предшественник простетической группы акворина, образующегося из "апо-акворина". При окислении люциферазой своего субстрата энергия возбужденного состояния продукта биолюминесцентной реакции (донора) передается хромофору расположенного рядом флуоресцентного белка (акцептора), вызывая его флуоресценцию и излучение зелёного света организмом. В этом, кажется, и состоит единственная функция GFP в медузе Aequorea. GFP представляет собой мономерный белок, образованный 238 а.о. (М 27 кДа). Исследования методом РСА [Оппб et al, 1996; Yang et al, 1996] показали, что полипептидная цепь GFP образует уникальную структуру полого цилиндра (диаметром -24 и высотой 42 А), образованного одиннадцатью антипараллельными Р-тяжами (такую структуру часто называют p-barrel). Находящийся внутри глобулы хромофор связан с сс-спиральным участком, проходящим вдоль центральной оси цилиндра. Короткие фрагменты ос-спиралей и петли между р-тяжами образуют своего рода "крышки" (caps), закрывающие цилиндр сверху и снизу. Общую структуру GFP и других членов его семейства предложено называть р-сап. Эта структура почти не имеет швов между р-тяжами, симметрична относительно продольной оси и окружена плёнкой из связанных молекул воды. Много молекул "кристаллизационной" воды находится и внутри цилиндра.
Структура р-сап удивительно прочна и надёжно защищает хромофор GFP, изолируя его от действия денатурирующих агентов (например, 6 М мочевины) [Ward & Bokman, 1982]. Кроме того, все члены семейства GFP-подобных белков необычайно устойчивы в нативном состоянии к действию протеаз [Bokman & Ward, 1981], что очень полезно для их биотехнологического применения в качестве репортеров экспрессии генов и внутриклеточного белкового трафика. В непосредственном окружении хромофора GFP, 4-(и-гидроксибензилиден)имидазолид-5-она (HBI) (II), расположенного во внутренней полости цилиндра и занимающего в ней центральное положение, находится большое количество полярных остатков, которые вместе с иммобилизованными молекулами воды образуют сеть водородных связей вокруг этого плоского бициклического фрагмента. Всё вышеописанное практически без изменений приложимо и к другим членам семейства GFP-подобных белков, для которых установлены пространственные структуры (см., напр., [Yarbroughef al, 2001; Prescott et al, 2003]). Отличия наблюдаются лишь вблизи их хромофоров, которые всегда можно рассматривать как производные от хромофора GFP (что вовсе не следует понимать как безусловное утверждение, будто HBI (II) - это обязательная стадия их формирования [Remington, 2002]). В литературе закрепился обычай нумеровать остатки GFP-подобных белков в соответствии с выравниванием (alignment) их последовательностей с GFP из Aequorea. Трудно придумать что-то более удачное, когда речь идёт об удалённых от хромофора остатках. Здесь мы предлагаем новую, относительную систему нумерации остатков вблизи хромофора по аналогии с промоторами или открытыми рамками считывания (см. Рис. 1). За начало координат мы предлагаем принять т.н. ХОТ, хромофоробразующий триплет (англ. CFT, chromophore forming triplet). В случае GFP это остатки Ser-65, Туг-66 и Gly-67. Внутри ХОТ остатки нумеруются цифрой перед аббревиатурой: так, остаток Ser-65 в GFP получит координату 1-ХОТ. Вне ХОТ остаткам "слева" (в сторону N-конца, upstream) предлагается давать отрицательные координаты через пробел после аббревиатуры "ХОТ" (напр., Phe-65 в zFP538 - "ХОТ_-1"), а "справа" (в сторону С-конца, downstream) - положительные (напр., Asp-69 в zFP538 - "ХОТ_+1"). Саму последовательность ХОТ в приводимых структурах белков и пептидов мы будем выделять подчёркиванием. HBI-хромофор GFP (II) образуется в результате циклизации, дегидратационного образования связи между атомами С остатка Ser-65 (1-ХОТ) и N" остатка Gly-67 (3-ХОТ), и последующего дегидрирования связи Са-Ср остатка Туг-66 (2-ХОТ) [Heim et al, 1994; Cubitt et al, 1995; Reid & Flynn, 1997].
Экспрессия полностью функционально активного (т.е. спектрально полноценного) GFP в различных гетерологических системах [Inouye & Tsuji, 1994], а также полный химический синтез полипептида-предшественника GFP [Nishiuchi et al, 1998] подтверждают, что для формирования его хромофора необходимо и достаточно, чтобы незрелый полипептид правильно сложился в нативную структуру р-сап. Все дальнейшие события происходят самопроизвольно (автокаталитически) и весьма мало зависят от внешних факторов (за исключением температуры), что подтверждает почти полную изоляцию внутреннего пространства белковой глобулы и хромофора от растворителя. Единственным условием окончательного формирования хромофора GFP (этот процесс для всех GFP-подобных белков принято обозначать термином "созревание") является присутствие молекулярного кислорода [Heim et al, 1994], необходимого для дегидрирования связи Са-Ср остатка Туг-66 (в положении 2-ХОТ). Детальный механизм формирования хромофора в GFP до сих пор остается предметом пристального изучения. Сейчас, пожалуй, требующим решения остается вопрос: предшествует ли окислительная реакция реакции дегидратации [Rosenow et al, 2004] или она, как было постулировано [Heim et al, 1994], является заключительной реакцией формирования хромофора [Barondeau et al, 2005]. Процесс созревания хромофора GFP занимает от 1,5 до 4 часов, замедляясь при повышении температуры до 37 С (напомним, что медуза Aequorea - обитатель холодных вод) [Heim et al, 1994]. У длинноволновых гомологов GFP процесс созревания, включающий ещё минимум одну или даже две дополнительные стадии, может требовать гораздо больше времени [Baird et al, 2000]. С целью преодолеть это неприятное свойство членов GFP-семейства, а также их склонность к олигомеризации, которую в некоторой степени демонстрирует и сам GFP, были предприняты многочисленные и масштабные работы по мутагенезу этих белков [Bevis & Glick, 2002; Campbell et al, 2002; Verkhusha & Lukyanov, 2004]. Методом PCA установлены пространственные структуры белков и ковалентные структуры хромофоров некоторых гомологов GFP: красных флуоресцентных белков DsRed (drFP583) [Wall et al, 2000; Yarbrough et al, 2001], eqFP6ll [Petersen et al, 2003], HcRed [ Wilmann et al, 2005] и нефлуоресцентного окрашенного белка поциллопорина (Rtms5) [Prescott et al, 2003]. В отличие от GFP, эти белки являются облигатными тетрамерами, HcRed закристаллизован в виде димера. В то же время, такая структуризация, по всей видимости, не обязательна для правильной сборки отдельных мономеров и образования функционального хромофора [Gurskaya et al, 2001; Campbell et al, 2002]. Несмотря на малую степень гомологии первичных структур красных флуоресцентных белков и GFP, мономерные субъединицы красных белков имеют структуру, идентичную GFP. Для всех них показана весьма сходная с GFP укладка полипептидной цепи (типа р-сап) и структура хромофора на основе HBI (II), дополненная двойной связью Ca=N при аминокислотном остатке в положении 1-ХОТ. Таким образом, хромофор этих гомологов GFP (III) содержит в качестве заместителя в положении 2 имидазолидонового цикла фрагмент JV-ацилимина, C=N-CO-, азометиновая связь C=N которого расположена в одной плоскости с фрагментом HBI (II).
Роль отдельных аминокислотных остатков в последовательностях гомологов GFP в формировании их хромофоров и в их спектральных свойствах, выявляемая методами направленного и статистического мутагенеза
Долгое время GFP из медузы Aequorea victoria являлся единственным объектом, на котором методами направленного и случайного мутагенеза изучалась связь между структурой белка и его спектральными свойствами. Основной подход был основан на поиске и анализе флуоресцентно-активных мутантов, отличающихся от GFP дикого типа по своим спектральным характеристикам. Данная тактика диктовалась, прежде всего, биотехноло-гоическими потребностями в новых вариантах GFP, а также простотой скрининга мутантов по фенотипу. При таком методическом подходе большинство мутированных белков, не флуоресцирующих в видимой области спектра, остались не исследованными. Тем не менее, в результате анализа только позитивных мутантов были сделаны открытия, позволяющие оценить влияние структурных изменений на функцию белка. Сейчас очевидно, что все многочисленные мутированные варианты GFP явились результатом введения в белок дикого типа замен по трём ключевым аминокислотным остаткам. Единичные и комбинированные замены Ser-65 (1-ХОТ) на Ala, Leu, Cys и Thr; Glu222 на Gly и Gin; Thr-203 на Val и He, внесенные в GFP, приводили к значительным изменениям в спектрах поглощения и возбуждения флуоресценции этого белка, но практически не сказывались на его максимуме эмиссии. В сущности, эти мутации стабилизировали хромофор GFP (II) либо в нейтральной, либо в анионной форме [Tsien, 1998]. Только в случае замены Thr-203 на ароматические аминокислотные остатки (His, Тгр, Phe и Туг) наблюдался одновременный сдвиг в длинноволновую область спектра (на 20 нм) максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции [Оттб et ah, 1996; Cubitt et ah, 1999]. Общепринятым считается, что близкая к желтой флуоресценция этих мутантов обусловливается стэкинг-взамодействием между мутированным остатком и фенолят-анионом хромофора. Мутант GFP203Y представляет собой один из немногих удачных примеров рационального мутагенеза GFP. При анализе его кристаллической структуры было в действительности выявлено, что ароматическое кольцо тирозина находится рядом с хромофором и взаимодействует с ним [Wachter et ah, 1998]. Следует отметить, что все перечисленные мутации не изменяли ковалентной структуры хромофора GFP. В действительности, получить мутанты с тремя химически различающимися хромофорами удалось введением замен по 66-му (2-ХОТ) аминокислотному остатку.
Весьма интересно, что все три теоретически обоснованные замены, то есть замены природного ароматического остатка Туг-66 на ароматические аминокислоты (His, Тгр и Phe) приводили к функционально активным (в смысле флуоресценции) белкам, излучающим свет в более коротковолновой по сравнению с GFP области видимого спектра [Tsien, 1998]. После клонирования в 1999 году генов целого семейства новых GFP-подобных белков из небиолюминесцентных морских кишечнополостных [Matz et ah, 1999] необходимость изменять мутагенезом GFP до красной формы перестала быть актуальной задачей. Гораздо перспективнее представлялось адаптировать для биотехнологического применения природный красный белок из Discosoma sp., названный drFP583 (DsRed), максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции которого приходятся, соответственно, на 558 и 583 нм. Поскольку на ранних этапах своего созревания DsRed демонстрирует выраженную зеленую флуоресценцию и никогда полностью не достигает абсолютно красной формы, было резонно предположить, что в белке могут присутствовать две различные формы хромофоров [Gross et al, 2000]. В результате мутагенеза было выявлено несколько позиций в последовательности белка, замены по которым (Lys-69, Lys-84) либо ингибировали, либо полностью останавливали процесс созревания белка на стадии зеленой формы [Baird et al, 2000]. После того, как стало ясно, что ковалентная структура зрелого хромофора DsRed представляет собой НВ1-хромофор GFP-типа (II), дополненный одной сопряженной двойной связью, появилось и предположение о возможной каталитической роли двух аминокислотных остатков (Glu-222 и Ser-68) в дегидрировании связи Ca-N остатка Gln-66 (1-ХОТ) [Yarbrough et al, 2001]. Экспериментов с целью прямо подтвердить или опровергнуть это предположение не проводилось. В то же время, мутагенез близкородственного DsRed сине-зеленого белка dsFP483 (60% гомологии) показал принципиальную возможность превращения зеленого белка в красный. Для этого потребовалось провести двойную замену N68S/I112S, тогда как единичные замены N68S и I112S не приводили к изменению фенотипа [Gurskaya et al, 2001]. DsRed имеет структуру тетрамера [Baird et al, 2000]. У мономерного мутанта DsRed (mRFPl), в отличие от тетрамерного прототипа, максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции сдвинуты в длинноволновую область спектра: 584 и 607 нм, соответственно. В спекрах поглощения обнаруживается минорный пик при 503 нм, который был отнесен на счет нефлуоресцирующей фракции белка [Campbell et al, 2002]. Большинство экспериментов с целью получения разнообразных цветных вариантов красного флуоресцентного белка было выполнено именно на его мономерной форме. В действительности удалось получить палитру белков, флуоресцирующих в диапазоне от 537 до 610 нм [Shaner et al, 2004]. Нет возможности перечислять все мутации, которые необходимо было ввести в белки для достижения такого цветового разнообразия. Остановимся лишь на ключевых моментах. Замена Q66M (в положении 1-ХОТ) предопределяет незначительный сдвиг максимума флуоресценции до 610 нм.
Введение по 66-му (1-ХОТ) положению остатков Ser, Thr или Cys приводит к тому, что мутированные формы mRFPl становятся спектрально неотличимыми от DsRed. У тройного мутанта (Q66C/Q220L/I203E), получившего название mBanana, и у mOrange (Q66T/T41F/L8F) наблюдалась желтая (553 нм) и оранжевая (562 нм) флуоресценция, соответственно. Наиболее коротковолновые варианты mRFPl (mHoneydew) удалось получить после замены хромофоробразующего остатка Tyr-67 (2-ХОТ) на Тгр. Оптимизированный дополнительными мутациями, конечный вариант mHoneydew имеет двойной пик в спектре возбуждения (487/504 нм) и в спектре эмиссии (537/562 нм) флуоресценции [Shaneretal, 2004]. Интересно, что сходное направленное изменение хромофора было реализовано по крайней мере еще на одном объекте, циановом флуоресцентном белке amFP486. У мутанта amFP486-Y66W максимумы возбуждения и эмиссии были сдвинуты в коротковолновую область спектра относительно таковых белка дикого типа [Gurskaya et al, 2001]. Следует напомнить, что и GFP толерантен (в смысле потери флуоресцентных свойств) к подобного рода заменам. В связи с этим, принимая во внимание тот факт, что хромофоробразующий остаток Туг (2-ХОТ) абсолютно инвариантен для всех известных флуоресцентных и окрашенных белков, не ясно, почему такие замены в принципе «разрешены». Кроме того, если флуоресценция GFP-подобных белков эволюционировала по признаку цвета, не вполне понятно, почему в природных источниках не обнаружены варианты белков, аналогичные по этому остатку вышеупомянутым мутантам. То, что мутации по положению 1-ХОТ влияют на спектральные свойства флуоресцентных белков, очевидно следовало из результатов по мутагенезу GFP и mRFPl. Наиболее полно влияние замен по этому остатку на структуру хромофора мутантных белков было оценено только на одном объекте, желтом флуоресцентном белке zFP538 [Remington et al, 2005]. Были проанализированы все возможные замены остатка Lys-66 (1-ХОТ). Белок zFP538 приобретал зеленый фенотип в случае замены К66 на А, С, F, G, Н, L, М, N, S, Т, Р, Q и V. Замены на I, R, W и Y давали бесцветные мутантные белки. Замены К66Е или K66D приводили к тому, что изменённый этими мутациями zFP538 приобретал способность флуоресцировать в красной области спектра. В спектре флуоресценции мутанта К66Е обнаруживалось два пика: выраженный при 504 нм и незначительный при 578 им. У мутанта K66D максимумы приходились на 524 нм и 552 нм, при этом плечо пика при 552 нм простиралось до 650 нм. Авторы работы [Remington et al, 2005] предположили, что в случае замены К66Е образуются белки с двумя формами хромофоров: GFP-типа (II) и измененной DsRed-типа (III) как результата циклизации боковой группы остатка Glu, сопряжённой с разрывом полипептидной цепи белка.
Гипотезы о происхождении и эволюции семейства GFP-подобных белков: проблемы и перспективы
Свечение животных и растений было с глубокой древности одним из самых интригующих свойств биологических объектов. В главе, названной "Особые трудности теории естественного отбора", Чарльз Дарвин [Darwin, 1859] писал: "Органы свечения, встречающиеся у немногих насекомых, принадлежащих к самым разным семействам, и расположенные в различных частях тела, представляют при нашем современном недостаточном состоянии знаний о них пример трудности, подобный тому, который представляют электрические органы рыб>"13. Вероятно, удивление натуралиста перед этим загадочным явлением, а создателя теории эволюции - перед его происхождением, в равной мере должно быть отнесено и к биолюминесценции морских организмов. По прошествии более полутора столетий нам ясно, что происхождение свечения живых тканей не представляет особой трудности, поскольку энергия во многих биохимических реакциях выделяется в виде излучения, в т.ч. и в видимом диапазоне: биолюминесценция (пусть слабая и с трудом детектируемая) наблюдается во всех без исключения живых организмах, поэтому люциферин-люциферазные системы возникали независимо и неоднократно на протяжении эволюционной истории органического мира, при этом за основу специализированного развития признака брались весьма разные катализируемые ферментами процессы. Нас же здесь далее будет интересовать лишь один из них, приведший в конечном итоге к паре акворин/GFP с целентеразином (І) в качестве субстрата люциферазной реакции. Но перед тем, как продолжить, сделаем, на первый взгляд, очень далёкое отступление. На языке оригинала эта цитата выглядит куда как лаконичнее: "The presence of luminous organs in a few insects, belonging to different families and orders, offers a parallel case of difficulty" [Darwin, 1859]. Базальные мембраны - это внеклеточные плёнкоподобные образования, лежащие в основе эпителиальных поверхностей/слоев. Предотвращая смешивание клеток и служа субстратом для их прикрепления, эти образования играют важнейшую роль в росте и функционировании тканей всех многоклеточных организмов. Базальные мембраны состоят из эволюционно древнего набора больших гликопротеинов, таких как представители семейства ламининов, коллаген IV, перлекан и нидоген/энтактин. Нидоген-1 - это белок с молекулярной массой 150 кДа, состоящий из трёх глобулярных доменов, G1-G3.
Домены G1 и G2 соединены гибким линкером, чувствительным к протеазам, в то время как домены G2 и G3 соединены жёсткой связкой из двух тандемно повторенных структур, гомологичных фактору роста эпидермиса (EGF). Домену G1 нидогена-1 пока не сумели приписать никакой функции. Цепь yl ламинина связывается с доменом нидогена-1 G3, для которого предсказана пространственная структура шестилопастного р-пропеллера. Коллаген IV и перлекан связываются с доменом нидогена-1 G2, который состоит из N-концевой EGF-подобной последовательности и фрагмента -230 а.о., не имеющего гомологии ни с одним из известных доменов внеклеточных белков. В результате исследований домена G2 нидогена-1 методом РСА [Hopf et al., 2001] выяснилось, что он имеет пространственную структуру р-сап, т.е. является как минимум паралогом GFP-подобных белков. Совпадение последовательностей GFP и домена G2 нидогена-1 составляет 10%, что можно отнести на счёт псевдогомологии стандартных структур глобулярных белков. Но практически полное совпадение их пространственных структур не исключает и общности происхождения (т.е. существования в далёком прошлом общего предка обоих белков). Эквивалентная ХОТ GFP (SYG) последовательность в домене G2 нидогена-1 представлена остатками Gly-462, Ие-463 и Ие-464 (если судить по выравниванию последовательностей GFP и нидогенов, приведённому в работе [Hopf et al, 2001]), непосредственное их окружение весьма мало напоминает таковое у хромофоров GFP-подобных белков. Наружная поверхность Р-сап в домене G2 нидогена-1 мало напоминает таковые у GFP и DsRed: в первом случае она формирует зоны контакта (участки связывания) с иными доменами нидогена-1 и его природными лигандами, а у гомологов GFP эта поверхность задействована в межмономерном взаимодействии при образовании тетрамеров (в случае GFP - в связывании акворина). Столь подробное цитирование работы [Hopf et al, 2001] показалось нам необходимым перед переходом к проблеме, заявленной в названии настоящего обзора: итак, GFP-подобный домен обнаружили в составе структурного белка внеклеточного матрикса. Филогенетическое древо GFP-подобных белков из кораллов (класс Anthozoa) [Labas et al, 2002], построенное на основе анализа последовательностей кодирующих их генов, не следует за их цветом, ковалентной структурой хромофора и даже за систематическим положением хозяев. Авторы работы [Labas et al, 2002] заключили, что GFP-подобные белки всех известных цветов появились сравнительно поздно и независимо внутри разных таксонов современных коралловых полипов, а также что на доступной им выборке (почти 30 разных последовательностей гомологов GFP) невозможно сделать однозначного вывода о цвете (и структуре хромофора) их общего предка. Различные структуры хромофоров, вероятно, появляются как альтернативные продукты, синтезируемые с помощью в основном сходного автокаталитического окружения, а не как результат длительной эволюции разных каталитических механизмов. С этими выводами трудно не согласиться, равно как и с положением, что цветовое разнообразие GFP-подобных белков у современных кораллов является результатом баланса двух разнонаправленных процессов, естественного отбора по определённому цвету и мутационного прессинга14, приводящего к его изменению (чаще всего к "примитивному" зелёному, GFP-типа, или же к обесцвечиванию).
В работе [Shagin et al, 2004] выборка GFP-подобных белков была существенно расширена как за счёт новых гомологов из кишечнополостных, так и за счёт недавно открытых гомологов из планктонных ракообразных Copepoda. В анализ были также включены GFP-подобные белки из гидромедуз (включая и сам GFP из Aequorea, который не был включён в построение филогенетического древа в работе [Labas et al, 2002]) и домены G2 нидогенов [Hopf et al, 2001], которые были объединены с остальными GFP-подобными белками в "суперсемейство GFP". Достаточно глубокий и корректный анализ позволил сделать однозначный вывод, что дупликация гена, приведшая в одной линии к бесцветным нидогенам, а в другой - к хромофорсодержащим белкам, произошла у общего предка всех рассмотренных (весьма далёких друг от друга таксономически, как мышь от кораллового полипа) организмов ещё до разделения двустороннесимметричных и лучесимметричных животных. То есть этот весьма древний многоклеточный организм уже содержал в своём геноме как ген-предок домена внеклеточных нидогенов, так и ген-предок GFP-подобных белков. 14 То есть современное цветовое разнообразие кишечнополостных класса Anthozoa (включающего и всех рифообразующих кораллов) - не игра случая, но результат длительной и жёсткой работы естественного отбора по признаку цвета. Таким образом, разнообразная раскраска (а иногда и способность к флуоресценции) зачем-то очень нужна кораллам и пр. Менее надёжным выглядит предположение авторов работы [Shagin et ai, 2004] о том, что уже на этой ранней стадии последний кодировал функциональный флуоресцентный белок, хотя и для полного исключения такой возможности пока нет достаточных оснований. Аргумент, что возникновение способности к флуоресценции не могло произойти независимо минимум дважды (у предка ракообразных и у предка современных кишечнополостных после их разделения 700-900 млн. лет назад) на протяжении истории органического мира, поскольку это якобы крайне маловероятное событие - не из разряда самых сильных, хотя он и подкреплён некими статистическими выкладками15. Авторы работы [Shagin et al, 2004] оговариваются, что столь раннее (почти 1 млрд. лет назад) возникновение хотя бы зелёной, GFP-типа, флуоресценции не вполне понятно, поскольку тогда ещё не появились глаза или просто светочувствительные органы, способные её воспринимать. Последнее сомнительно16, но в данном случае несущественно. Важнее другое: предок всех ныне известных членов семейства GFP-подобных хромофорсодержащих белков возник столь давно, что его потомки могут существовать (и быть обнаружены) у всех ныне живущих представителей животного царства17.
Аминокислотный и масс-спектрометрический анализ хромопептидов из ZFP538
В MALDIOF масс-спектре пептида ZFP538-I был обнаружен однозарядный ион [М+Н]+ при m/z=765,8, который соответствовал хромопептиду с молекулярной массой 764,8 Да. Методом аминокислотного анализа в пептиде zFP538-I обнаружены аминокислоты Phe, Asx и Arg в эквимолекулярных соотношениях. Обработка пептида zFP538-I химотрипсином высвобождала Phe, при инкубации с карбоксипептидазой В от пептида отщеплялся Arg. Методом аминокислотного анализа в пептидах zFP538-II и zFP538-III были обнаружены аминокислоты Asx и Arg в соотношении 1:1. Обработка пептидов zFP538-II и zFP538-III карбоксипептидазой В приводила к высвобождению С-концевого Arg. В ESI масс-спектре пептида zFP538-II был обнаружен основной пик при m/z=617,2681, который соответствует однозарядному иону [М+Н]+ с брутто-формулой C27H37N8O9 (расчётная моноизотопная мол. масса - 617,2682 Да). В ESI масс-спектре пептида zFP538-III (при более низком разрешении) был обнаружен основной пик при w/z=599,27 и минорный пик при m/z=6\7,27 (см. Рис. 10, Г). Минорный пик при т/г=в\1,21 всегда присутствует на масс-спектрах пептида zFP538-III. Этот пик может быть отнесён на счет следовых количеств пептида zFP538-II, спонтанно образующегося в результате деградации пептида zFP538-III. В действительности, при хранении водных растворов гомогенного пептида ZFP538-III, в них спонтанно образуется пептид zFP538-II, и этот процесс ускоряется при рН 7 (при слабощелочных значениях рН пептид zFP538-III более стабилен) и при повышении температуры. Напротив, из пептида zFP538-II никогда не образуется пептид zFP538-III. Водные растворы пептида zFP538-III реагировали с NaBR». Обработка пептида zFP538-III боргидридом натрия давала стабильный продукт, пептид zFP538-IV. В MALDIOF масс-спектре пептида zFP538-IV был обнаружен основной пик молекулярного иона [М+Н]+ при m/z=618,7. Сходная обработка пептида ZFP538-II не приводила к изменению масс-спектрометрических характеристик и оптических спектров этого пептида. Спектр поглощения водных растворов пептида zFP538-I при разных рН весьма сходен со спектрами хромопептидов, получаемых из GFP [Niwa et al, 1996; Shimomura, 1979]. В спектре поглощения пептида zFP538-I наблюдаются два выраженных максимума: при 385 нм в кислых рН и при 450 нм в щелочных рН (рКа перехода - 7,8, изобестическая точка - при 410 нм).
В отличие от хромопептидов из GFP, флуоресцирующих только при криогенных температурах [Niwa et al, 1996], хромопептид zFP538-I в щелочных растворах флуоресцирует26 при комнатной температуре (Рис. 11,3). Спектр поглощения пептида zFP538-II при разных рН (Рис. 11, А и Г) сильно отличается от описанных в литературе спектров хромопептидов из GFP, но сходен со спектрами модельного соединения "4" [Yampolsky et al, 2005] и хромопептида27, выделенного из триптического гидролизата asFP595 [Martynov et al, 2001]. При слабощелочных значениях рН основной пик в спектре поглощения пептида zFP538-II находится при 512 нм (красная форма). В сильнощелочных растворах основной пик с максимумом поглощения при 512 нм переходит в пик с максимумом поглощения при 343 нм. Данный переход необратим и отражает процесс химической деструкции хромофора. Две спектральные формы пептида zFP538-II, существующие в кислой и слабощелочной среде, флуоресцируют (Рис. 11, Б и В). Жёлтая форма, с максимумом возбуждения при 412 нм, флуоресцирует с максимумом эмиссии при 538 нм, совпадающим с максимумом флуоресценции нативного zFP538. В красной спектральной форме пептида zFP538-H максимуму возбуждения при 512 нм соответствует флуоресценция с максимумом при 578 нм, совпадающим с плечом в спектре эмиссии флуоресценции нативного zFP538. Спектры пептида ZFP538-III демонстрируют ряд необычных свойств этого соединения. При низких значениях рН наблюдается форма с максимумом поглощения при 420 нм. При защелачивании водного раствора пептида zFP538-III (Рис. 11, Д) в первый момент появляется спектральная форма с максимумом поглощения при 529 нм, совпадающим с максимумом поглощения нативного zFP538. Однако эта форма нестабильна и с течением времени превращается в другую спектральную форму, с максимумом поглощения при 470 нм. Скорость конверсии короткоживущей промежуточной формы с ЯтаХ=529 нм в равновесную (конечную) с тах=470 нм зависит от рН: чем он выше, тем быстрее идёт этот процесс. При экстремально высоких значениях рН переходную форму зарегистрировать не удаётся. Этот процесс полностью обратим: если раствор пептида zFP538-III в равновесной щелочной форме (с Хщах=470 нм) закислить, то образуется кислая форма (с Атпах=420 нм), которая при последующем защелачивании снова переходит в равновесную щелочную (с х =470 нм) через промежуточную короткоживущую (с шах=529 нм). Обе щелочные формы пептида zFP538-III, промежуточная (с тахех=528 нм) и равновесная (с ХтаХех=475 нм), флуоресцируют. Максимум эмиссии равновесной щелочной формы, поглощающей при 470 нм, совпадает с максимумом эмиссии нативного zFP538 Pwnaxem=538 нм, Рис. 11, Е). Из анализа зависимости интенсивности флуоресценции растворов пептида ZFP538-III при разных длинах волн от времени с момента защелачивания до рН 8,8 оказалось возможным реконструировать спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции короткоживущей щелочной формы пептида zFP538-III с max=528 нм. Максимум её возбуждения равен 528 нм (как и у нативного zFP538), максимум эмиссии равен 595 нм (Рис. И, Ж) и совпадает с таковым для нативного asFP595 и выделенного из него хромопептида [Martynove/a/.,2001].
Продукт восстановления пептида zFP538-IH боргидридом натрия, пептид zFP538-IV, в водном растворе имеет только две спектральные формы, с Хтпах =382 нм в кислотах и с Хтах=443 нм в щелочах, с рКа перехода 7,9. По всем своим изученным спектральным свойствам пептид zFP538-IV весьма сходен с описанным выше пептидом zFP538-I и с хромопептидами из GFP [Niwa et al, 1996; Shimomura, 1979]. Обе спектральные формы пептида zFP538-IV, детектируемые при кислых и щелочных значениях рН, устойчивы и не обнаруживают взаимопревращений, свойственных пептиду zFP538-III. Флуоресцентные свойства пептида zFP538-IV не исследовались. Структуры пептидов zFP538-II и zFP538-III исследовали с помощью Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии. На первом этапе идентифицировали лабильные (обменивающиеся с растворителем) амидные протоны, сравнивая спектры образцов, растворённых в НгО и в D2O. После этого двухмерные гомоядерные (TOCSY, DQF-COSY и ROESY) и гетероядерные ( H-13C-HMQC И Н- С-НМВС) спектры были использованы для идентификации Н- Н и Н-13С спиновых систем аминокислот. Гетероядерные спектры пептида zFP538-II приведены на Рис. 12, значения химических сдвигов ядер Н и 13С пептидов zFP538-II и zFP538-III приведены в Таблице 1. Каждый из двух пептидов (zFP538-H и zFP538-III) описывался пятью спиновыми системами, при этом различия между пептидами были незначительными. Спиновые системы пептида zFP538-II схематически представлены на Рис. 13, А, выведенная структура пептида zFP538-II показана на Рис. 13, Б. В обоих пептидах спиновые системы (1), -CO-NH-CH[(CH2)3-NH-C(=NH,-NH2)]-CO-, и (2), -CO-NH-CH(CH?-CO-VCO-, могут быть отнесены к модифицированным остаткам Arg-70 и Asp-69, соответственно. Группа С =0 (подчёркнута) остатка Asp-69, относящаяся к обеим спиновым системам (1) и (2), позволяет связать эти системы друг с другом. В пептидах ZFP538-II и zFP538-HI спиновая система (3), -CO-N(C=)-CH2-CO-, представляет собой модифицированный аминокислотный остаток Gly-68. Сигнал ядра 13С остатка Gly-68 обнаружен в спиновых системах (2) и (3), что позволяет сделать вывод о наличии пептидной связи между остатками Gly-68 и Asp-69 . Сигнал от амидного протона остатка Gly-68 в Н-ЯМР спектрах пептидов отсутствует: атом азота остатка Gly-68 в пептидах связан с тремя атомами углерода. Спиновая система (4), =C-C(=X)-(CH2)4-NH2 (X - гетероатом, N или О), пептида zFP538-II представляет собой модифицированный аминокислотный остаток Lys-66. Сигналы ядер 13Са при 156,51 и 13СР при 32,50 м.д. сдвинуты в сторону слабого поля по сравнению с таковыми в нормальном лизине. Это свидетельствует о том, что в остатке Lys-66 атом С находится в состоянии -гибридизации. Для пептида zFP538-II сигнал ядра 13С остатка Lys-66, обнаруженный в спиновых системах (4) и (3), позволяет связать эти системы друг с другом. Сигнал в одну протонную единицу, соответствующий протону СаН лизина, не был обнаружен в спектрах Н-ЯМР пептидов zFP538-II и zFP538-III. В гетероядерных спектрах
