Введение к работе
Актуальность проблемы
Неприятные болевые ощущения и в первую очередь хронические болевые синдромы значительно снижают качество жизни людей. Они часто вызывают физические и эмоциональные страдания, сопровождающиеся депрессией, подавленным настроением и чувством безнадежности. Детальные механизмы возникновения патологических болей до конца не выяснены, но известен ряд клеточных рецепторов, отвечающих за восприятие болевых стимулов и генерацию болевых ощущений. По современным представлениям одними из важнейших рецепторов болевого каскада являются кислоточувствительные ионные каналы (ASICs). Было показано, что они ответственны за восприятие снижения рН в тканях (состояние, называемое ацидоз), которое может происходить как в норме (при накоплении молочной кислоты в связи с усилением анаэробного метаболизма глюкозы и высвобождении протонов при гидролизе АТФ), так и при патологии (воспалительные процессы в тканях, ишемический инсульт, черепно-мозговая травма, опухоли, повреждение тканей и эпилептический припадок).
Впервые, рецепторы нервных клеток, способные воспринимать экстрацеллюлярное
снижение рН, были обнаружены в лаборатории под руководством О. Кришталя еще в 1980
году. Однако клонированы и охарактеризованы данные рецепторы были только в 1997 году
группой под руководством М. Лаздунского. Каналы ASIC относятся к надсемейству
амилорид-чувствительных дегенерин/эпителиальных (DEG/ENaC) Na -каналов и
представлены в организме в виде 6 изоформ: ASIC la, lb, 2а, 2Ь, 3 и 4. Они в большом
количестве встречаются в нейронах центральной нервной системы, где было обнаружено по
крайней мере три (ASICla, ASIC2a и ASIC2b) из шести субъединиц. Из всех субъединиц,
представленных в мозге, ASIC 1а является основной. Показано, что ASIC 1а и ASIC2
принимают непосредственное участие в процессах синаптической пластичности, обучении,
передаче нервного возбуждения, ишемических процессах, эпилепсии,
кислотоопосредованного нейронального повреждения.
В нейронах периферической нервной системы в основном представлены ASIC3 и ASIC3 -содержащие каналы. Способность этих каналов воспринимать сигналы в виде небольшого снижения рН внеклеточной среды (до значений 7.0 - 6.7), интегрировать различные воспалительные и ишемические стимулы, такие как АТФ, молочная и арахидоновая кислоты, повышение осмотического давления, позволяет рассматривать ASIC3 в качестве основных участников процесса развития боли. Характерной особенностью при активации ASIC3 является их способность проводить токи двух видов - быстрые, инактивирующиеся в течение нескольких миллисекунд, и медленные, продолжительностью в
несколько десятков секунд. Для периферических ASIC3 каналов было показано, что они: а) участвуют в восприятии кислотоопосредованной, воспалительной и постоперационной боли; б) вносят вклад в развитие первичной и/или вторичной механогиперчувствительности в мышцах; в) участвуют в кожной и висцеральной механочувствительности и восприятии боли от механических стимулов; г) участвуют в восприятии болевых сигналов от легких и желудочно-кишечного тракта.
Было также показано, что ASICs играют важную роль при некоторых нейродегенеративных расстройствах, включая ишемический инсульт, болезнь Паркинсона, эпилепсия, болезнь Хантингтона, и аутоиммунный энцефалит. ASICs обнаруживаются не только в нейронах, но также и в раковых клетках, костной ткани, клетках эпителия и мочевого пузыря, в клетках гладких мышц.
Удобным и распространенным способом изучения как физиологической роли каналов в организме, так и молекулярных механизмов их функционирования является использование лигандов, модулирующих работу ASIC каналов. Особенно это касается высокоспецифичных соединений, с помощью которых можно как идентифицировать и охарактеризовать данный тип канала, так и управлять его работой. Фармакология ASICs на данный момент представляет собой относительно небольшой набор лигандов. Потенциаторы активности ASIC каналов представлены как низкомолекулярными компонентами, так и молекулами пептидной природы, как, например, MitTx, выделенный в лаборатории Д. Джулиуса. Ингибиторы активности ASIC каналов представлены как неспецифическими низкомолекулярными молекулами, такими как диуретический препарат амилорид, аспирин, так и высокоспецифичными компонентами пептидной природы. К последним относятся PcTxl и АРЕТх2, выделенными из ядов беспозвоночных в лаборатории М. Лаздунского. Комбинированием методов биохимии, молекулярной биологии, а также с помощью структурных и функциональных исследований, удалось достичь прогресса в установлении механизмов действия модуляторов активности ASIC каналов. Дальнейшие исследования в данном направлении могут оказать значительную помощь в понимании роли данных каналов в физиологических/патологических процессах, а также позволят создать новые лекарственные препараты.
Цель и задачи работы
Цель работы состояла в поиске, выделении и изучении свойств природных веществ, модулирующих активность ASIC3 рецепторов.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
тестирование экстрактов растений и ядов беспозвоночных на наличие искомой активности;
-
идентификация и выделение активных компонентов при помощи хроматографических методов;
-
анализ активности выделенных компонентов на ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих канал ASIC3;
-
изучение физико-химических свойств выделенных компонентов;
-
разработка системы гетерологической экспрессии для лиганда пептидной природы;
-
проверка анальгетических эффектов новых лигандов в болевых моделях in vivo.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые из природных источников были выделены лиганды, обладающие ингибирующим действием на обе компоненты тока ASIC3 канала, не описанным ранее ни для природных низкомолекулярных соединений, ни для соединений пептидной природы.
Новое низкомолекулярное соединение, представитель класса полифенольных соединений лигнанов - севанол, было обнаружено и структурно охарактеризовано в ходе этого исследования. Из морских анемон были выделены два новых пептида - 7i-AnmTX Нсг 1Ь-1 и 7i-AnmTX Ugr 9-1. Her lb-1 гомологичен другому изученному инигибитору ASIC3, в то время как Ugr 9-1 является пептидным модулятором с уникальной структурой. На примере рекомбинантного аналога Ugr 9-1 впервые установлено пространственное строение для токсинов данного класса.
Все выделенные лиганды проявляли ингибирующую активность в отношении ASIC3 канала, при этом характер действия севанола и Ugr 9-1 был абсолютно новым. В тестах in vivo новые лиганды продемонстрировали способность значительно подавлять величину болевых стимулов, что является еще одним подтверждением немаловажной роли ASIC3 в восприятии сигналов при патологических состояниях. Таким образом, все найденные в ходе работы природные вещества ранее не были известны, и воздействие двух новых лигандов на изучаемый рецептор ASIC3 имеет уникальный характер.
Полученные результаты могут внести существенный вклад в фундаментальном плане, позволяя изучить молекулярные основы функционирования ASIC3 канала и исследовать
физиологическую роль данных каналов в организме. Кроме того, результаты могут иметь
практическое применение в области разработки новых высокоэффективных и безопасных обезболивающих лекарственных средств.
На данный момент на все обнаруженные в ходе данной работы лиганды поданы заявки на патенты РФ как на перспективные соединения с анальгетической активностью.
Апробация работы
Основные материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: V Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); XXIV зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012); 1 Оксфордский симпозиум по веномике (Оксфорд, 2012); VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Структура и объем диссертации
