Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Биосинтез липидов 10
1.1.1 Биосинтез триацилглицеридов 10
1.1.2 Биосинтез фосфолипидов и гликолипидов 12
1.1.3 Биосинтез жирных кислот 14
1.2 Изменение липидного состава семян/плодов высших растений в процессе созревания 17
1.2.1 Маслообразование в семенах и плодах различных культур 18
1.2.2 Изменение содержания нейтральных и полярных липидов 21
1.2.2.1 Изменение состава нейтральных липидов 24
1.2.2.2 Изменение состава полярных липидов 27
1.2.3 Изменение содержания липофильных компонентов 27
1.2.4 Изменение состава жирных кислот липидов семян/плодов различных культур 33
1.3. Влияние низких температур на липидный метаболизм 38
1.4. Биологически активные компоненты различных видов калины 46
2. Обсуждение результатов
2.1 Биологически активные компоненты семян калины обыкновенной - отхода пищевой продукции 50
2.1.1 Липиды и липофильные компоненты семян калины обыкновенной 51
2.1.2 Пигменты семян калины обыкновенной 61
2.1.3 Белки семян калины обыкновенной 63
2.2 Липиды и липофильные компоненты плодов калины обыкновенной в процессе их созревания 64
2.2.1 Динамика накопления липидов в процессе созревания плодов калины обыкновенной 64
2.2.2 Классовый состав липидов плодов калины обыкновенной в процессе созревания 69
2.2.3 Состав жирных кислот липидов плодов калины обыкновенной в процессе созревания 76
2.3 Влияние пониженной температуры на состав липидов семян калины обыкновенной 82
2.3.1 Структура оксикислот 91
2.4 Изменение биологически активных компонентов при хранении семян калины обыкновенной 96
2.5 Кормовая добавка для цыплят-бройлеров и кур-несушек 102
3. Экспериментальная часть 107
Выводы 127
- Изменение липидного состава семян/плодов высших растений в процессе созревания
- Влияние низких температур на липидный метаболизм
- Липиды и липофильные компоненты плодов калины обыкновенной в процессе их созревания
- Влияние пониженной температуры на состав липидов семян калины обыкновенной
Введение к работе
Флора России - еще недостаточно изученный богатейший источник биологически активных веществ, на основе которых можно создать новые лекарственные препараты, биологически активные добавки для широкого применения в фармацевтической, косметической и пищевой промышленностях. В последнее время в мире резко возрос интерес к фитопрепаратам и к получению на их основе различных пищевых и кормовых добавок, производство которых в настоящее время испытывает значительный подъем. Пищевая и медицинская продукция, полученная на основе растительных источников, как правило, менее токсична, а ее производство является, зачастую, экономически более выгодным и экологически более чистым, чем производство синтетических препаратов. Более того, 30 — 60% препаратов, применяемых в медицине для лечения различных видов заболеваний, имеют растительное происхождение.
Одной из важнейших задач, требующих решения, является рациональное использование побочных продуктов и отходов производств, связанных с растительным сырьем, т.е. комплексная переработка сырья, полное извлечение из него всех ценных компонентов.
Калина обыкновенная (Viburnum opulus L., сем. Caprifoliaceae) — растение, которое широко распространено практически на всей территории России. В народной медицине нашли применение кора и плоды калины. Из коры калины выделены иридоиды, тритерпеноиды, катехины, оксикумарины, флавоноиды. В плодах обнаружены антоцианы, катехины, хлорогеновая кислота, пектиновые вещества, углеводы, тритерпеноиды, полисахариды, органические кислоты [1, 2]. В настоящее время пищевая промышленность перерабатывает плоды калины для получения джемов с товарным названием «Калина протертая с сахаром», семена являются отходом производства, которые практически не используются и сжигаются.
Работами по исследованию семян калины обыкновенной, проводимыми в лаборатории природных соединений Института органической химии Уфимского научного центра РАН, было показано, что семена содержат сложный комплекс биологически активных соединений - липидов, белков и пигментов. Масло семян калины обыкновенной обладает противовоспалительным действием, стимулирует репаративную регенерацию кожи и слизистой оболочки желудка [3], а также является богатым источником полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), которым в последнее время придается очень большое значение для получения биологически активных пищевых добавок, широко применяемых для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Все вышеизложенное позволяет рассматривать семена калины обыкновенной - отход пищевой продукции как сырьевой источник для производства широкого ассортимента продуктов различного функционального назначения, природный ресурс и химический потенциал которого до настоящего времени используется нерационально и не полностью.
Поэтому представляется актуальным и перспективным подробное изучение биологически активных компонентов семян калины, отхода пищевой продукции, для целенаправленного поиска путей утилизации и многостороннего использования содержащихся в отходах биологически активных соединений. Для определения оптимальных сроков сбора сырья, максимально обогащенного БАВ, целесообразно было изучить изменение одного из основных компонентов семян - липидов в процессе их созревания, под действием низких температур и хранения. Данные по липидному составу семян калины обыкновенной в литературе отсутствуют.
Эта работа является частью исследований, проводимых в лаборатории природных соединений ИОХ УНЦ РАН, по теме «Растительные биорегуляторы - алкалоиды и липиды некоторых растений, произрастающих в РФ» (per. номер № 01.20.00 13599). Работа выполнена при финансовой поддержке Президента Российской Федерации (программа поддержки научных школ, грант НШ-
8 139.2003.3), Министерства промышленности, науки и технологий (государственный контракт № 41.028.1.1.2447, проект № 02-4207.2003).
Цель исследования. Изучение липидов семян калины обыкновенной в ^ процессе онтогенеза, их изменение под влиянием низких температур и условий хранения. Определение биологической ценности семян калины, антиоксидантнои активности пигментного комплекса. Выявление возможности использования в качестве кормовой добавки отхода пищевого производства -семян калины обыкновенной и проведение испытаний на одной из птицефабрик Башкортостана на интенсивность роста цыплят-бройлеров и яйценоскость кур-несушек.
Научная новизна работы заключается в следующем.
Впервые подробно изучен состав нейтральных, полярных: глико- и фосфолипидов и липофильных компонентов семян калины обыкновенной и его изменение при созревании, под действием низких температур и хранении. 4 Проведен глубокий химический анализ липидов плодов калины обыкновенной трех степеней зрелости. Обсуждена роль отдельных классов липидов в процессе маслообразования. Охарактеризован состав жирных кислот всех ацилсодержащих классов липидов трех степеней зрелости. В липидах раннезрелых семян обнаружены значительные количества пальмитиновой (16:0) кислоты, резко уменьшающейся к моменту зрелости, что позволяет говорить об ее участии в биосинтезе ненасыщенных: олеиновой (18:1) и линолевой (18:2) кислот. Выявлены некоторые закономерности в процессе биосинтеза отдельных классов липидов.
Установлено, что действие низких температур приводит к нарушению метаболизма липидов: образованию оксиглицеридов в нейтральных липидах; значительному снижению общего содержания и отдельных классов полярных липидов, и, в конечном счете, к разрушению мембран. Выделены оксикислоты, входящие в состав оксиглицеридов, и установлена их структура. Показано, что кислоты данной структуры могли образоваться в результате окисления * линолевой и олеиновой кислот.
9 Впервые охарактеризован состав основных биологически активных природных соединений из семян калины обыкновенной - липидов, белков и пигментов, что дало возможность оценить его биологическую значимость. Комплексный подход к переработке плодов калины, основанный на оптимальном использовании его возможностей, как ценного сырьевого источника, позволит: повысить эффективность переработки плодов за счет расширения ассортимента выпускаемой продукции; снизить загрязнение окружающей среды; создать широкий ассортимент функциональных технологических, пищевых, кормовых и биологически активных добавок.
Практическая значимость.
Проведены испытания кормовой добавки из шрота семян калины обыкновенной на Турбаслинской птицефабрике РБ на цыплятах-бройлерах. Установлено, что добавление 1% шрота калины в полнорационные комбикорма «Провими» оказывало воздействие на прирост живой массы, начиная с 8 - 10-дневного возраста, превышая контроль к концу опыта (45 дней) на 9%.
Испытания кормовой добавки на продуктивные и воспроизводительные качества кур-несушек показали, что при добавлении калины в количестве 1,5% к составу основного рациона кур-несушек в опытных партиях увеличивало сохранность птицы на 1,5%, а яйценоскость - на 1,6% по сравнению с контролем.
Изменение липидного состава семян/плодов высших растений в процессе созревания
Семена любого растения содержат сложный комплекс различных природных веществ, одним из основных компонентов которого являются липиды и липофильные соединения. В процессе созревания, хранения и под действием неблагоприятных условий окружающей среды в семенах происходят изменения компонентного состава липидов. Изучение динамики таких изменений вносит определенный вклад в понимание процессов их биосинтеза, позволяет определиться с оптимальными сроками сбора растительного сырья, когда оно максимально обогащено БАВ, и стандартизировать сырье с целью дальнейшего его использования. В литературе не существует единого мнения по определению липидов и их классификации. По мнению авторов [56], к липидам следует относить соединения нерастворимые в воде, растворимые в неполярных органических растворителях, таких как бензол, хлороформ, эфир и т.д. и содержащие высшие алкильные радикалы, т.е. весь комплекс природных соединений, извлекаемый указанными растворителями из биологического объекта. Оправдано это тем, что большая часть липорастворимых соединений связана с мембранами, участвует в метаболизме липидов и содержится вместе с липидами в экстрактах, усиливая биологическую активность последних [16, 56]. Основная масса растительных липидов представлена глицеролипидами с небольшим содержанием (от 2% до 5%, в зависимости от растений) липорастворимых соединений [19, 57]. К последним относятся жирорастворимые витамины (А, Е, F, К), тритерпеновые соединения, углеводороды [56-58]. Начиная с 60-х годов прошлого столетия, проводятся работы по изучению динамики изменения липидного комплекса и состава жирных кислот при созревании семян различных промышленных культур. Ниже представлены данные по составу липидов, жирных кислот и липофильных компонентов промышленно важных масличных культур, имеющиеся к настоящему времени в доступной нам литературе [59-88]. 1.2.1 Маслообразование в семенах и плодах различных культур Процесс созревания семян условно можно разделить на три стадии: начало, середина и конец биологического развития. На протяжении всего периода созревания происходит увеличение массы семян и, одновременно, накопление в них липидов - процесс маслообразования [12, 13, 89, 90]. Как правило, этот процесс протекает в условиях повышенной влажности семян, которая снижается по мере накопления липидов [13, 89, 90]. Исключение составляют плоды, содержащие липиды в мякоти (оливки, облепиха). В этом случае в процессе их созревания происходит увеличение и влажности, и масличности [84].
Обобщая литературные данные по изучению процесса маслообразования в семенах различных культур (табл. 1), видно, что своего максимального содержания липиды достигают к концу созревания, а наивысшая скорость накопления масла происходит в первой половине развития семян, от стадии I к II [59-62, 65, 68, 71, 74, 77, 78, 84-87]. Влажность семян большинства культур ранней степени зрелости составляет 80 - 90% и по мере созревания она уменьшается до 10% и меньше [59-61, 68, 78, 87]. Заметное влияние на продолжительность развития семян и состав липидов оказывают метеорологические условия окружающей среды: температура, влажность, интенсивность и качество света, продолжительность светового дня [89]. 1.2.2 Изменение содержания нейтральных и полярных липидов Липиды в растениях выполняют различные функции. Запасные или нейтральные липиды являются источником резервной энергии, необходимой для развития семени/плода [16, 19, 91]. Доминирующая их часть представлена триацилглицеридами. Полярные липиды: гликолипиды и фосфолипиды называются структурными липидами и участвуют в формировании мембраны клетки и мембран субклеточных частиц [16, 19, 24, 25, 91, 92]. Липофильные компоненты играют роль строительного материала клеточных мембран, регулируют их текучесть и проницаемость и, кроме этого, участвуют в различных физиологических процессах роста и развития семян [19, 25, 92-94]. Процесс созревания семян сопровождается увеличением количества структурных и запасных липидов, необходимых для формирования органов и тканей клеток, накоплением в них запасающей энергии [12, 13]. Как правило, на ранней стадии развития преобладают структурные липиды: ПЛ, стерины, а в период интенсивного маслообразования увеличивается содержание запасных липидов-ТАГ [12,13]. Анализируя исследования по изменению основных групп липидов (табл. 2) видно, что на ранней стадии созревания полярные липиды преобладают над нейтральными в семенах сои, подсолнечника, рапса, кукурузы и оливках, за исключением сорго, плодов арахиса и семян хлопчатника, а также пальмы, где содержание НЛ и ПЛ примерно одинаково. В процессе развития семян происходит накопление всех групп липидов, однако соотношение нейтральных и полярных резко меняется [63, 65, 68, 70, 71, 74, 77, 78, 84, 85]. В плодах какао, кукурузы, арахиса и зернах сорго содержание ПЛ достигает своего максимума ко II периоду, а затем снижается [65, 70, 74, 77].
Максимальная скорость накопления НЛ и ПЛ наблюдается от стадии I к II, за исключением плодов оливок и пальмы, где в первом случае (оливки) скорость накопления ПЛ на всех трех стадиях примерно одинаковая, а во втором (пальма) наибольшая скорость наблюдается от стадии II к III [84, 85]. Наиболее интенсивно увеличивается содержание запасных - нейтральных липидов, они становятся основными в зрелых семенах/плодах всех растений [63, 65, 68, 70, 71, 74, 77, 78, 84, 85]. 1.2.2.1 Изменение состава нейтральных липидов По имеющимся в литературе данным, на ранней стадии развития в НЛ семян/плодов рапса, кукурузы, сои, пальмы, винограда и хлопчатника [62, 65, 68, 78, 80, 85] основными компонентами являются липорастворимые соединения (углеводороды, стерины и их эфиры, жирные спирты), неполные ацилглицериды и свободные жирные кислоты (табл. 3). По мере созревания семян возрастает содержание ТАГ, и уже на II стадии они являются доминирующим классом практически во всех культурах, достигая максимального значения к концу зрелости. Относительное количество всех остальных классов в процессе развития семян снижается [62, 65, 68, 74, 77, 78]. Иная закономерность наблюдается в ягодах винограда [80], где на долю липофильных компонентов приходится практически половина НЛ во все периоды развития плодов. Литературные данные по изменению состава ПЛ семян/плодов различных культур при созревании немногочисленны и противоречивы (табл. 4, 5). Так, при изучении состава ФЛ созревающих семян сои, подсолнечника и ягод винограда [68, 72, 80] авторами на ранних стадиях созревания обнаружено достаточно большое количество фосфатидной кислоты, содержание которой снижается при созревании, в то время как количество фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина возрастает. Это согласуется с существующим в настоящее время мнением о биосинтезе ФЛ в высших растениях [4, 7, 10, 14, 25, 27-29], где ФК является предшественником основных классов ФЛ. Однако, в ФЛ семян кукурузы [66] не наблюдается такой закономерности: содержание ФК, как и ФХ, меняется очень незначительно на протяжении всего периода созревания этой культуры, количество ФЭ падает. На предмет изучения изменения состава ГЛ в процессе созревания семян/плодов в имеющейся к настоящему времени литературе обнаружены лишь три работы - по семенам кукурузы [66], сои [68] и плодам винограда [80]. Анализ этих данных (табл. 5) не выявил определенных закономерностей в изменении состава. Однако, известно [95], что основную часть ГЛ растений зрелых семян/плодов составляют МГДГ - 40-50%, в меньших количествах содержатся ДГДГ - 20-40%, и значительно меньше, если они присутствуют вообще, содержание СХВДГ - 7-10%. 1.2.3 Изменение содержания липофильных компонентов Из липорастворимых компонентов в НЛ (маслах) растений чаще всего встречаются тритерпеновые спирты - стеролы (стерины), которые присутствуют в растениях в свободном и связанном виде (чаще как сложные эфиры с жирными кислотами) [94, 96].
Влияние низких температур на липидный метаболизм
В природе на растения действуют различные неблагоприятные факторы окружающей среды - повышенная температура, засуха, охлаждение, которые вызывают стресс и приводят к различным нарушениям жизнедеятельности растений. Липиды, как один из основных классов природных соединений всех высших растений, могут претерпевать различные изменения в зависимости от условий внешней среды. Эти изменения могут носить адаптивный характер, может меняться ферментная система, стресс может вызывать различные реакции деградации - все это в целом приводит к изменению липидного метаболизма [109, ПО]. Липиды составляют основу мембран, в которых проходят различные биохимические и биофизические процессы. При стрессовом воздействии окружающей среды на растение - охлаждении (замораживании), его мембраны выступают в роли своеобразной мишени, которые принимают удар на себя, и зачастую, это приводит к их повреждению и нарушению деятельности растительной клетки в целом [111-115]. Известно, что результатом охлаждения являются изменения метаболических процессов, идущих в клетке: активация ферментной системы, фотосинтетической способности, изменение текучести мембран [ПО, 112, 114, 116]. Считается, что последнее играет важную роль в выживании растений при низких температурах [114, 117, 118]. По мнению авторов [119, 120], необходимо рассматривать две последовательные стадии замораживания. «Первичная стадия» - зависит от чувствительности растения к холоду и приводит к изменению физических свойств клеточных мембран, а также внешних признаков обморожения ткани. «Вторичная стадия» - зависит от времени и характеризуется множественными процессами деградации, наиболее существенным из которых является изменение мембранных липидов, вызванное процессами гидролиза и переокисления [112, 119, 121, 122]. Эту стадию рассматривают как ответ на замораживание. Воздействие низкой температуры может вызвать механический стресс: за счет образования льда в растительных тканях происходит их разрыв [123]. Согласно существующей гипотезе о холодовом стрессе, влияние низких температур на метаболизм липидов и мембранную функцию вызывает каскад реакций распада, приводящих, в конечном счете, к отмиранию клетки [112, 124, 125]. При низкой температуре окружающей среды могут происходить изменения в липидном метаболизме, молекулярных видах глицеридов, составе жирных кислот, длины их цепи и ненасыщенности [ПО, 126]. Так, было показано, что в томате действие низких температур приводило к ингибированию «эукариотического» пути синтеза галактолипидов, т.е. такого пути, при котором sn-2 положение в молекуле преимущественно занято Ci8 жирными кислотами [127, 128].
Основные работы в этом направлении посвящены изучению влияния низких температур на полярные: глико- и фосфолипиды, а также липофильные соединения - стерины, поскольку все они являются структурными компонентами мембран. Действие холода приводит к разрушению мембранных липидов вследствие активации липолитических ферментов, как галакто-, так и фосфолипидных, которые получили название липидных гидролаз, причем, гидролитическая активность их возрастает с понижением температуры [125]. Изучение изменения состава этих липидов под действием холода, по мнению многих исследователей [112, 114], играет важную роль в понимании механизма устойчивости растений к охлаждению, что особенно необходимо при выведении сельскохозяйственных культур с улучшенными холодоустойчивыми свойствами. Поэтому и основная масса работ в этом направлении посвящена исследованию липидов культур, важных для сельского хозяйства. Во всех изученных растениях охлаждение приводило к снижению содержания ГЛ и ФЛ за счет активации ацил-гидролаз [113, 121, 122, 124, 125, 127-130]. Причем, в плодах перца [131] и томата [124] галактолипаза активировалась в большей степени, чем фосфолипаза, т.е. потери ГЛ были более значительны. А в плодах арабидопсиса [125] была обратная тенденция -снижение количеств ФЛ превышало потери ГЛ. Однако, как считают авторы, уменьшение содержания ГЛ в плодовой оболочке плодов томата [127], а также в листьях некоторых сортов кофе [115] происходит не за счет их деградации, а в результате изменения биосинтеза липидов. Отмечается, что в холодочувствительных сортах кукурузы и томата происходит более значительный распад ПЛ по сравнению с холодоустойчивыми видами [121, 127, 128]. Во всех исследованных растениях при изучении классового состава ГЛ после холодового стресса отмечалось снижение соотношения МГДГ к ДГДГ [109, 115, 121, 125, 127]. Существует мнение, что это является определяющим фактором при сохранении функциональной целостности клеточной мембраны [115]. По мнению авторов, в плодах арабидопсиса [125] и зернах холодоустойчивого сорта пшеницы [109] это происходит за счет снижения содержания МГДГ и возрастания ДГДГ. Значительные потери МГДГ также были отмечены в плодах томата [127] и проростках кукурузы [121]. А в листьях кофе причиной снижения соотношения МГДГ/ДГДГ авторы считают усиление синтеза ДГДГ [115]. Кроме этого, при охлаждении в перикарпе плодов томата отмечалось снижение содержания сульфолипидов [127]. О влиянии охлаждения на состав ФЛ в литературе нет единого мнения. Считается, что при снижении температуры окружающей среды в растительном организме возникает потребность в «низкоплавких» липидах [132]. Было предположено, что первичным признаком холодового повреждения в клеточных мембранах является липидно-фазовый переход (жидкокристаллическая фаза - гелеобразная) [112, 115, 120], и определенную роль в этом переходе играют «высокоплавкие» виды ФГ, в которых содержится такое сочетание кислот: 16:0 и 18:0 или 16:1 (транс), как в sn-І, так и в sn-2 положении глицеринового скелета и именно эти виды ответственны за холодовую восприимчивость [114, 133-135]. Эта гипотеза получила подтверждение путем определения фазового перехода в 16:0/16:0 видах ФГ, полученных синтетическим путем и выделенных из холодочувствительных растений [134, 136].
Есть мнение, что накопление «высокоплавких» ФГ в результате охлаждения может приводить к изменениям в метаболизме клеток, и, в дальнейшем, к дисфункции мембран в клетках растений [112, 133, 137]. Так, показано, что в мембранах веток тополя [113], в плодах перца [131], огурца [130] и арабидопсиса [125] при охлаждении снижалось количество ФХ и возрастало - ФК, на основании чего было сделано предположение об активации фосфолипазы D, субстратом для которой может служить ФХ. В последних отмечено также снижение ФЭ и ФГ, а в плодах томата - незначительное увеличение ФХ [128]. Отмечается [115], что различные по устойчивости к охлаждению сорта кофе по-разному реагировали на стресс, однако в ФЛ листьев всех исследованных сортов наблюдалось снижение ФХ и возрастание ФГ. Есть данные о влиянии низких температур на состав липофильных компонентов: в плодах томата [124] охлаждение приводило к повышению содержания свободных стеринов за счет снижения этерифицированных их форм. Как считают авторы [138], причиной этого может быть разное функциональное предназначение этих классов липидов, поскольку свободные стерины являются структурными компонентами клеточных мембран, а эфиры стеринов таковыми не являются. При изучении состава стеринов обнаружено, что охлаждение приводило к значительному увеличению соотношения стигмастерин/ситостерин в плодах томата [124] и перикарпе перца [131]. По мнению авторов [124], причина этого кроется в структуре боковой цепи этих двух стеринов, и это, в конечном счете, влияет на упаковку и текучесть бислоев (рис. 1). Имеются очень ограниченные данные [115, 122, 128, 131] об изменении нейтральных липидов при охлаждении культур. Так, снижение температуры окружающей среды приводило к уменьшению каротиноидов в плодах перца [131]. В результате охлаждения и увеличения активности ацил-гидролаз происходило расщепление мембранных липидов и накопление СЖК в проростках кукурузы [122] и плодах томата [128]; в последнем также уменьшалось содержание ДАТ. В 4-х из 5-ти изученных сортов листьев кофе возрастало суммарное количество НЛ [115]. В литературе в течение многих лет широко обсуждается роль метаболизма мембранных липидов, уровня их ненасыщенности в развитии холодовой чувствительности растений. Для жизнедеятельности клеток, правильного функционирования мембранных белков и нормального прохождения веществ через мембрану необходимым условием является чтобы липиды, входящие в состав мембраны, находились в состоянии жидкой пленки, т. е. в их составе были ненасыщенные жирные кислоты [114, 139, 140].
Липиды и липофильные компоненты плодов калины обыкновенной в процессе их созревания
Изучена динамика изменения липидов в процессе созревания плодов калины обыкновенной, что дало возможность определиться с оптимальными сроками сбора сырья, максимально обогащенного биологически активными веществами, и стандартизировать его. Детальное изучение биосинтеза триацилглицеридов - основного класса липидов и метаболизма липидных классов в биологических объектах начато более 40 лет назад. Большое число исследований проведено в этом направлении и на основании полученных данных предложены пути биосинтеза липидов в высших растениях [4-20]. Однако число работ, в которых бы изучалась динамика изменения липидов в процессе созревания плодов или семян весьма ограничено, хотя исследования, проводимые в этом направлении, вносят определенный вклад в познание процессов биосинтеза. Данные по изучению динамики накопления липидов семян калины обыкновенной в литературе отсутствуют. Изучен классовый состав нейтральных и полярных липидов: глико- и фосфолипидов, липофильных компонентов, а также изменение состава жирных кислот в течение всего периода развития плодов калины обыкновенной [197]. Известно, что основная масса запасающих - нейтральных липидов и часть структурных - глико- и фосфолипидов концентрируется, как правило, в семенах. Однако на стадиях ранней и средней зрелости плодов семена практически невозможно отделить от мякоти, поэтому для исследования брали семена вместе с мякотью. Для того чтобы показать, что изучаемые липиды относятся к семенам, мы определяли количество как НЛ, так и ПЛ в мякоти зрелых плодов калины, предварительно отделив ее от семени. Согласно полученным данным, ПЛ в мякоти отсутствовали, а НЛ составляли лишь 0.04% от массы мякоти. Таким образом, можно утверждать, что изучаемые нами липиды содержатся в семенах. Для исследования были отобраны образцы плодов калины на трех стадиях созревания: 1-1 месяц после цветения, II - 2.5 месяца, III - 4 месяца после цветения, т.е. начало, середина и конец биологического созревания. Первая стадия (I) - начало формирования плодов: плоды мелкие, зеленые, жесткие, косточка не отделяется; вторая стадия (II) - незрелые плоды: плоды крупные, желтовато-зеленоватого цвета, косточка и околоплодная мякоть сформированы, но плохо отделяются друг от друга; третья стадия (III) - зрелые плоды: крупные ярко-красные ягоды со сформировавшейся околоплодной мякотью и косточкой.
Для каждого образца определяли вес плодов, влажность, масличность, а также кислотное число и содержание каротиноидов в масле (табл. 15). Как видно из таблицы, по мере созревания вес плодов увеличивается с 9.5 г/100 шт. до 59.0 г/100 шт. Одновременно с этим возрастает количество липидов, причем скорость маслообразования в первой половине созревания семян выше. Так, в образце II количество липидов в 15 раз выше, чем в образце I. Во второй фазе развития (от II к III) липиды синтезируются в 4 раза медленнее. Кислотное число (КЧ) на ранней стадии составляет 22.7 мг КОН и в процессе созревания оно уменьшается до 1.5 мг КОН в зрелых семенах. Содержание каротиноидов увеличивается с 1.4 мг/% до 4.0 мг/%. На рис. 3 показано изменение содержания липидов, влаги, показателя КЧ и веса плодов по мере их созревания. Для того чтобы определить, какие классы соединений входят в НЛ и ПЛ, каждую из этих групп липидов подвергали разделению с помощью КХ. Смешанные фракции, содержащие два и более класса, рехроматографировали птсх. Таким образом, из НЛ всех образцов выделили и идентифицировали 8 классов соединений (табл. 17). ЫЛ раннезрелых плодов калины практически на 80% состоят из липорастворимых компонентов (72.8% СЭТС + 4.4% стеринов). Основным классом на ранней стадии развития плодов являются СЭТС, содержание которых к концу созревания уменьшается до 2.0%, а количество ТАГ постоянно растет, достигая максимума в зрелых плодах. Скорость их накопления наивысшая в период перехода от стадий I к стадии II, содержание ТАГ за это время увеличивается в 33 раза (от 1.9% до 63.1%). Содержание всех остальных классов НЛ к концу созревания плодов уменьшается; для ДАТ этот процесс идет неравномерно: в период перехода от стадии I к стадии II количество ДАТ увеличивается в 2 раза, а затем снижается. Содержание МАГ значительно на ранней стадии развития плодов. Эти данные дают основание предполагать, что в развивающихся плодах калины биосинтез ТАГ может осуществляться с участием промежуточных МАГ и ДАТ. Свободные кислоты не являются определяющим классом липидной суммы раннезрелых плодов, как предполагалось ранее [198], и сравнимы по количеству с МАГ и МЭЖК. Последние, до некоторой степени, возможно, являются продуктом метилирования СЖК в процессе экстракции липидов смесью растворителей, содержащих метанол.
Уменьшение содержания СЖК в процессе созревания плодов подтверждается снижением показателя КЧ. Для каждого образца был изучен компонентный состав липофильных соединений — стеринов и тритерпеновых спиртов, находящихся в НЛ как в свободном виде, так и в составе СЭТС. Идентификацию свободных спиртов осуществляли методом масс-спектрометрии в сочетании с хроматографическим разделением; связанных - тем же способом, но после щелочного гидролиза соответствующих фракций СЭТС, выделяя спирты как неомыляемые компоненты с последующей очисткой препаративной ТСХ. Коэффициент достоверности Q всех идентифицированных терпеновых соединений был в пределах от 90 до 97%. Качественный состав липофильных соединений как в свободном, так и в связанном виде усложняется по мере созревания плодов (табл. 18). В стеринах основным является Р-ситостерин, его количество в процессе созревания уменьшается; снижается содержание стигмастерина, и в зрелых плодах связанный стигмастерин вообще не обнаруживается; кампестерин меняется незначительно, а содержание холестерина как свободного, так и связанного возрастает. Увеличивается количество связанного изофукостерина. Свободный изофукостерин, а также стигмастан-3-ол как в свободном, так и в связанном виде присутствуют только в зрелых плодах. Доминирующим компонентом тритерпеновых спиртов и свободных, и связанных на всех стадиях развития плодов калины является сс-амирин, содержание которого к концу созревания плодов уменьшается, также как и 3-амирина. 24-метиленциклоартанол в свободном и в связанном виде и лупеол в свободном виде присутствуют только в зрелых плодах. Изучение биосинтеза стеринов на примере развивающихся семян Sorghum bicolor показало, что 24-метиленциклоартанол принимает участие в биосинтезе кампестерина, а изофукостерин - в биосинтезе р-сито- и стигмастерина [101]. Из всех трех образцов гликолипидов выделено и идентифицировано 4 компонента (табл. 19). Наибольшим по содержанию на всех стадиях созревания являлись МГДГ, их количество в процессе биосинтеза возрастает. Содержание Ас-МГДГ и ДГДГ сначала увеличивается, а затем уменьшается, хотя и остается выше первоначального. Содержание СХВДГ в период перехода от стадии I к стадии II падает почти втрое, а затем немного повышается. Такой набор гликолипидов характерен для высших растений, где основными являются МГДГ и ДГДГ [16, 24, 25, 95]. Согласно существующим представлениям о путях биосинтеза этих соединений, МГДГ образуются из ДАГ, а ДГДГ из МГДГ под действием ферментов, в том числе и галактозилтрансферазы (см. схему 3, гл. 1.2) [4, 7, 14, 25, 32-34].
Влияние пониженной температуры на состав липидов семян калины обыкновенной
Для установления оптимальных сроков сбора плодов калины обыкновенной было изучено влияние пониженной температуры окружающей среды на липидный состав семян. С этой целью были собраны плоды калины обыкновенной в ноябре месяце, когда внешняя температура понижалась до -10 - 20С (образец II). Изучали состав: нейтральных липидов, полярных: глико- и фосфолипидов, липофильных компонентов, а также состав жирных кислот. Полученные результаты сравнивали со зрелыми семенами из плодов, собранных в октябре до заморозков (образец I) (см. главу 2.2). После заморозков за счет усыхания околоплодника вес плодов снижается (табл. 23). Несколько увеличиваются масличность семян, показатель КЧ и уменьшается содержание каротиноидов. Изменение масличности и КЧ семян, по-видимому, связано с процессами гидролиза, которыми сопровождается влияние холодных температур на растение [121, 122, 124, 127, 128]. Такие же закономерности были отмечены при изучении влияния охлаждения на липиды листьев некоторых сортов кофе [115] и плодов перца [131]. НЛ выделяли петролейным эфиром и разделяли на классы соединений (табл. 24). В НЛ образца II значительно снижается содержание липофильных компонентов в свободном и связанном виде (тритерпеновые спирты, стерины, СЭТС), а также ТАГ и МАГ. Количество ДАТ увеличивается в 2 раза и появляется новый класс соединений - оксиглицериды (11%), не обнаруженные нами в семенах, собранных до заморозков. Качественный набор стеринов, как свободных, так и связанных в образце II упрощается (табл. 25), особенно в связанном виде. Главным компонентом остается (3-ситостерин, но количество его в свободном виде снижается, почти в 6 раз возрастает содержание изофукостерина и в 2 раза стигмастерина. В связанном виде стигмастерин отсутствует. А с изофукостерином наблюдается та же тенденция. Соотношение (изофукостерин + стигмастерин)/р ситостерин в свободном виде повышается в 6 раз в сравнении с тем же в семенах, собранных до заморозков. Возможно, что изофукостерин, являясь изомером стигмастерина по положению двойной связи в боковой цепи (см. рис. 1, гл. 2.3), играет ту же роль, что и последний, оказывая определенное влияние на упаковку и текучесть бислоев мембран, о чем отмечалось отдельными авторами при изучении липидов перца и томата [124, 131]. Из-за малых количеств состав свободных тритерпеновых спиртов семян, собранных после заморозков, установить не удалось. Качественный состав связанных ТС при охлаждении не меняется.
Основным компонентом образца II остается а-амирин, однако его количество возрастает, увеличивается содержание лупеола и значительно снижается содержание 24-метилен-циклоартанола. Подтверждением того факта, что при охлаждении активизируются ферменты - ацилгидролазы [129] и первыми принимают на себя удар мембранные липиды, явилось значительное снижение содержания ГЛ и ФЛ, количество которых уменьшилось соответственно в 10 и в 1000 раз (табл. 26, 27), т.е. ФЛ разрушаются практически полностью. Это же явление отмечалось многими авторами [113, 121, 125, 127, 128, 130, 131]. Повышенный распад общих ПЛ не приводит к накоплению СЖК, а просто поддерживает их стабильный уровень, стимулируя окислительные процессы [122], которые оказывают разрушительное действие на клетки растения. Заморозки оказывают влияние и на классовый состав мембранных липидов (табл. 26, 27). В ГЛ образца II снижается содержание гликолипидов, содержащих моносахариды: Ас-МГДГ, МГДГ и СХВДГ. Причем, содержание МГДГ уменьшается на 10% и почти на 14% возрастает количество гликолипидов с дисахаридами - ДГДГ. Увеличение синтеза ДГДГ и уменьшение соотношения МГДГ/ДГДГ в липидах листьев различных по устойчивости к замораживанию сортов кофе, как считают авторы [115], носит адаптивный характер, отражает усиление мембранной устойчивости и акклиматизацию к низким температурам и является критическим фактором в поддержании клеточной целостности при замораживании. Существует мнение [109, 115], что есть определенная связь между соотношением ДГДГ/МГДГ и устойчивостью растения к заморозкам. Известно, что в растениях, подвергшихся заморозкам (замороженных при температурах ниже критической), происходят необратимые изменения клеточных мембран [113]. В частности, такие изменения происходят в составе ФЛ, являющихся важными компонентами клеточных мембран, и встречаются у растений, подвергшихся заморозкам и претерпевших какие-либо иные повреждения. По-видимому, деградация ФХ, ФЭ и, возможно, ФИ связана именно с этими явлениями. Причиной происходящего, по мнению авторов [113, 125, 130, 131], изучавших состав ФЛ в огурцах, клетках тополя и плодах перца после охлаждения и переохлаждения, является активизация фосфолипазы D, субстратом для которой может служить ФХ, что, в конечном счете, приводит к уменьшению их количества, возрастанию содержания ФК и к полному разрушению ФЛ. Возможно, это утверждение авторов касается, в основном, фотосинтетических тканей растений, где, как известно [108], содержится достаточно стабильная фосфолипаза D. В случае калины ФЛ выделяли из семян. В составе ЖК ацилсодержащих классов НЛ семян, собранных после заморозков, очень значительных изменений по сравнению с семенами, собранными до того, не наблюдалось (табл. 28). Качественный набор кислот не менялся. Содержание насыщенных ЖК повышалось во всех классах, кроме ДАТ, за счет 16:0 и 22:0 кислот. Снижалось содержание олеиновой кислоты в СЭТС, МЭЖК и ТАГ.
Содержание линолевой кислоты в этих же классах, за исключением СЭТС, было несколько повышенным. В ГЛ и ФЛ (табл. 29) наблюдались значительные изменения в содержании насыщенных и ненасыщенных ЖК. В образце II общий уровень насыщенных ЖК увеличивался в 2 раза как в ГЛ, так и в ФЛ. В ГЛ содержание 16:0 возрастало в 2 раза, а 18:0 - в 22 (т.е. от следовых до 22%); в ФЛ количество 16:0 не менялось, а 18:0 увеличивалось от следовых до 36%. Изменение содержания олеиновой кислоты практически не происходило, содержание линолевой снижалось в ГЛ в 2.5 раза, а в ФЛ в 6 раз. Количество линоленовой (18:3) кислоты в ФЛ возрастало в 4 раза. Известно, что при низких температурах важную роль в выживании растений играет текучесть мембран. В большинстве растений, выращенных при пониженной температуре, происходит общее увеличение полиненасыщенных жирных кислот [125, 131, 132, 141, 143]. В некоторых классах липидов большинства холодоустойчивых культур отмечался более высокий уровень линоленовой кислоты [109]. Так, известно [114, 141], что и десатуразная (А6, А9) активность выше у растений, выращенных при пониженных температурах. Однако, как отмечают авторы [109], сама по себе ненасыщенность не имеет прямой связи с холодовой устойчивостью. Определенную роль в холодоустойчивости растений играют «высокоплавкие» ФГ (т.е. имеющие в своем составе значительные количества видов с высоким содержанием насыщенных жирных кислот). В мембране липиды могут находиться в «жидком» и «твердом» (гелеобразном) состоянии [140]. Переход из одного состояния в другое называется фазовым переходом и осуществляется с помощью «высокоплавких» видов ФГ [133-135]. Изучение жирнокислотного состава ФГ листьев различных по устойчивости к холоду растений показало, что в ФГ устойчивых растений динасыщенных видов содержится менее 25%, а у чувствительных они составляют 50-60%, т.е. количество динасыщенных видов ФГ увеличивается одновременно с возрастанием восприимчивости растений к холоду [136]. Есть данные о том, что нефотосинтетические ткани холодочувствительных растений также восприимчивы к холодовому повреждению, т.к. и в них в небольших количествах содержатся динасыщенные ФГ и в этих тканях наблюдаются мембранные дисфункции [136]. Из-за очень незначительного содержания фосфолипидов изучить видовой состав ФГ не было возможности. Однако, полученные результаты нашего исследования по липидам этих семян: снижение содержания ФХ, ФЭ, накопление ФГ и значительное увеличение насыщенных (16:0 и 18:0) жирных кислот как в ФЛ, так и в ГЛ, образование оксиглицеридов указывают на то, что действие низких температур окружающей среды приводит к изменениям в метаболизме липидов и, в конечном счете, к разрушению мембран.
