Содержание к диссертации
Введение
1. Cовременные методы химического синтеза олигодезоксирибонуклеотидов 8
1.1. Развитие химических методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидов 9
1.2. Защитные группы в химическом синтезе олигодезоксирибонуклеотидов 18
1.2.1. Защита гетероциклических оснований 19
1.2.1.1. Блокирование экзоциклических аминогрупп. 19
1.2.1.2. Защита оксо- и иминофункций остатков Giia и Thy 27
1.2.2: Защита гидроксильных групп дезоксирибозы 34
1.2.3. Защита фосфатных групп 42
1.3. Создание межнуклеотидной связи 48
1.3.1. Фосфотриэфирный метод 49
1.3.2. Фосфитный метод 65
1.4. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов растворным методом 71
1.5. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов на твердой фазе 76
1.6. Удаление защитных групп, выделение и очистка полученных олигодезоксирибонуклеотидов, доказательство их структуры 84
1.6.1. Удаление защитных групп 84
1.6.2. Выделение и очистка синтетических олигодезоксирибонуклеотидов 86
1.6.2.1. Хроматографические методы 86
1.6.2.2. Электрофорез в полиакриламидном геле 90
1.6.3. Анализ структуры синтетических олигодезокси-рибонуклеотидов 91
2. Химический синтез длинных олигодезоксирибо-нуклеотидов 93
3. Экспериментальная часть 120
3.1. Материалы 121
3.1.1. Растворители 121
3.1.2. Реактивы 121
3.1.3. Сорбенты 122
3.2. Оборудование 124
3.3. Методы 124
3.3.1. Получение 5-0 ^-защищенных дезоксирибонуклеозидов 124
3.3.2. Получение З'-О-бензоил-^-ацилдезоксирибонуклеозидов 127
3.3.3. Получение защищенных мононуклеотидов 128
3.3.4. Получение динуклеотидных блоков 130
3.3.5. Синтез слигодезоксирибонуклеотидов 131
3.3.6. Получение полностью деблокированных олигодезоксирибонуклеотидов 134
3.3.7. Выделение олигонуклеотидов после полного даления защитных групп 134
Выводы 138
- Защитные группы в химическом синтезе олигодезоксирибонуклеотидов
- Создание межнуклеотидной связи
- Удаление защитных групп, выделение и очистка полученных олигодезоксирибонуклеотидов, доказательство их структуры
- Оборудование
Введение к работе
Разработка методов синтеза олиго- и полинуклеотидов привлекает всё большее внимание исследователей. Это связано с тем, что синтетические олигонуклеотиды заданной структуры являются уникальными инструментами для решения важных молекулярно-биологических задач, для понимания различных биологических процессов на молекулярном уровне. Например, еще в 60-х годах благодаря доступности всех 64-х синтетических олигонуклеотидов, а также полирибонуклеотидов с чередующимися ди-, три- и тетранук-леотидными последовательностями стала возможной расшифровка генетического кода /1,2/. Достижения в области направленного химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот сделали возможным получение искусственных генетических структур, таких как биологически активный ген тирозиновой супрессорной тРНК из E.coli , полный синтез которого.был впервые осуществлен в лаборатории Г.Кораны /3/. Последующее стремительное развитие синтетических методов привело к созданию целого ряда генов, например, пептидного гормона ангеотензина П /4/, лейцин-энкефалина /5/, соматостатина /6/, человеческого фактора роста /7/, гастропеп-тидов /8,9/, человеческого инсулина /10/, проинсулина /11-16/, гена белка рибонуклеазы s /17/ и некоторых других. Возможности химического синтеза иллюстрируют создание и экспрессия гена человеческого интерферрона dU (511 нуклеотидных остатков) /18/ и гена протеиназного ингибитора, белка эглин С ( eglin С) /19/.
Следует отметить, что среди'существующих в настоящее время способов получения генов, полный химический синтез имеет ряд преимуществ: I) возможность получения заранее запланированных последовательностей, в которые по желанию можно ввести регуля-торные элементы для экспрессии в прокариотических системах или подходящие сайты рестрикции; 2) отсутствие сложного этапа выделения соответствующей мРНК или геномной ДНК; 3) упрощение модификации гена и соответствующего ему белка путем удлинения или укорочения кодирующего участка гена, а также путем замены определенных кодонов (и соответственно, кодируемых ими. аминокислот) на другие. О другой стороны, синтетические олиго- и полинуклеотиды необходимы для выделения генов из природных источников (как специфические зонды для гибридизации и как прай-меры при обратной транскрипции) или для "редактирования" природных последовательностей.
Химический синтез олигонуклеотидов открывает возможности искусственного получения регуляторных элементов гена - таких как операторы, промоторы /5,20-23/, рибосом - связывающие участки /24/. Олигонуклеотиды используются в качестве линкеров и адаптеров при введении новых рестрикционных сайтов, а также для введения в ген регуляторных элементов. Олигодезоксирибонуклео-тиды зарекомендовали себя как исключительно специфичные, универсальные и эффективные мутагены in vitro /24/, являющиеся одновременно и инструментами для поиска мутантной ДНК /26/. С их помощью можно осуществлять точечные мутации, вызывая, например, замену всего лишь одной аминокислоты в активном центре фермента.
Широкое применение нашли олигодезоксирибонуклеотиды в определении первичной структуры ДНК /27/. Возможность быстрого синтеза коротких олигонуклеотидных фрагментов позволяет резко повысить скорость и качество определения. По данным авторов /28/ им удалось за небольшой промежуток времени сиквенировать клонированный в векторе MI3 фрагмент ДНК длиной 3000 нуклеотидов без разбивки его на более мелкие сегменты. - б -
Доступность олиго- и полинуклеотидов, кроме того, делает возможным изучение физико-химических свойств нуклеиновых кислот, а также открывает широкие перспективы для изучения специфического взаимодействия нуклеиновых кислот с белками - явления узнавания, лежащего в основе многих фундаментальных биологических процессов.
Современные методы олигонуклеотидного синтеза (см.главу I) позволяют довольно быстро синтезировать 8-14-звенные последовательности, интенсивно используемые в молекулярно-биологических исследованиях. Однако существует и ряд проблем, в общих чертах рассматриваемые в приводимом нихе литературном обзоре, с которыми приходится сталкиваться в процессе синтеза. Так например, общим недостатком используемых методов создания межнуклеотидной связи является значительное образование побочных соединений, таких как продукты модификации гетероциклических оснований и сульфонилирования нуклеозидного компонента реакции, что затрудняет получение более длинных синтетических последовательностей. Тем не менее, для некоторых целей использование более длинных одноцепочечных полинуклеотидов является весьма перспективным. Доступность 30-60-звенных фрагментов позволяет осуществлять сложные варианты направленного мутагенеза клонированных участков ДНК /25/ и открывает новые возможности для физических исследований нуклеиновых кислот. Наличие синтетических олигодезоксирибо-нуклеотидов - зондов длиной более 30 звеньев позволяет идентифицировать и выделять из природных объектов гены различных белков на основании информации, полученной анализом небольших фрагментов этих белков /29 ,30/. Большим преимуществом использования длинных фрагментов ДНК является существенное упрощение и ускорение процесса химико-ферментативного получения искусственных генетических структур. Ранее предложенный Г.Кораной с сотрудниками /6/ метод создания генов предполагает химический синтез всех составляющих обе комплементарные цепи будущего гена олиго-дезоксирибонуклеотидов (IO-15-звенных), с последующим соединением коротких фрагментов посредством ДНК-лигазы. Иной подход, позволяющий более чем на Що сократить объем химического синтеза , состоит в использовании длинных химически синтезированных олигодязоксирибонуклеотидов, имеющих попарно на З^-концах небольшие взаимокомплементарные участки. После отжига соответствующих олигонуклеотидов происходит достраивание их до двунитча-тых фрагментов ДНК посредством репарационного синтеза в присутствии ДНК-полимеразы I (Кленовского фрагмента) и четырех дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов /19 ,31/.
Из всего выше сказанного следует, что разработка методов синтеза длинных олигодезоксирибонуклеотидов является весьма актуальной. Этой проблеме посвящена и данная работа, являющаяся частью исследований, проводимых в лаборатории химии белка Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР.
Автор выражает свою глубокую признательность академику ЮЛ .Овчинникову за постоянное внимание к данной работе, а также старшим научным сотрудникам, кандидатам химических наук В.А. Ефимову и О.Г.Чахмахчевой за ценные советы и помощь в процессе работы и написания диссертации.
Защитные группы в химическом синтезе олигодезоксирибонуклеотидов
К защитным группам предъявляются следующие требования: I) условия их введения должны быть мягкими, не ведущими к побочным реакциям и желательно селективными; 2) группы должны быть устойчивыми ко всем химическим воздействиям, которым подвергается синтезируемая молекула олигонуклеотида в условиях конденсации, выделения продуктов, введения или удаления других защитных групп ; 3) их удаление должно протекать быстро, количественно, не вести к разрушению целевого продукта или к его модификации. Наряду с основным назначением - блокированием всех активных центров, кроме участвующих в реакции - защитные группы иногда несут дополнительные функции: повышают липофильность синтезируемого соединения, облегчая его выделение, или служат удобными метками для его идентификации. Введение защитных групп является первым этапом химического синтеза олигонуклеотидов. Обычно оно проводится в такой последовательности: сначала блокируются реакционные центры гетероциклических оснований, затем вводятся защита по гидроксильным группам углеводного фрагмента и фосфатные защитные группы. 1.2.1. Защита гетероциклических оснований I.2.I.I. Блокирование экзоциклических аминогрупп Нуклеофильность экзоциклических аминогрупп аденина, гуанина и цитозина сравнима с нуклеофильностью первичного и вторичного углеводных гидроксилов, что может приводить к нежелательному образованию фосфамидов в реакции межнуклеотидной конденсации. С учетом кислотноосновных свойств аминофункций гетероциклических оснований (/34/,0.112) были предложены такие ацильные защитные группы, которые могут быть удалены в одинаковых условиях: изо-бутирильная /52/ для гуанина (рКа = 3 ,0), бензоильная /53/ для аденина (рКа = 4,25), бензоильная и анизоильная /54/ для цитозина (рКа = 4,6). Эти группы проявили себя устойчивыми к действию кислот и кратковременной обработке щелочами, применяемых для удаления О-защитных групп, их введение повышает растворимость олигонуклеотидов в органических растворителях. Удаление этих N-ацильных групп легко протекает под действием концентрированного аммиака при 50С за 16-18 часов /55/ (см. также раздел 1.6.1).
Большая по сравнению с другими нуклеозидами основность первичной аминогруппы цитидина позволяет селективно, не затрагивая углеводный фрагмент, вводить ацильную группу - например, кипячением с ангидридом соответствующей кислоты в метаноле /56, 57/; обработкой 2-хлорметил-4-нитрофенилбензоатом /58/ или 0-этил-5-бензоил дитиокарбонатом в пиридине /59/; обработкой 4-нитрофенилбензоатом в присутствии 1-гидроксибензотриазола /60/; а также пентафторфенилбензоатом в пиридине или диметил-формамиде /61/ , как правило, с высоким выходом. Предложенный Кораной двухстадийный метод введения N-ацильных защитных групп (см.раздел I.I), с другой стороны, является универсальным /55/ и может быть использован для защиты любого гетероциклического основания (рис. 4): Будучи предложенными уже довольно давно, эти группы и этот метод оказались весьма удачными и нашли широкое применение в синтетической практике. Лишь сравнительно недавно, в 1982 году, был разработан более удобный и менее трудоемкий способ введения N-защитных групп с использованием так называемой "временной защиты" (transient protection ) /62/. Суть метода составляет селективное введение по гидроксильным группам дезоксирибозного фрагмента временной триметилсилильной защиты, устойчивой в безводном пиридине, с последующим (без выделения силилированного продукта) ацилированием аминогрупп соответствующим ацилхлоридом (присутствие даже большого избытка триметилхлорсилана не влияет на ацилирование). Дальнейший гидролиз водным аммиаком позволяет получить с высоким выходом моноацильные производные (95% для а.СЪг и 0Abz , 75% для д&±ь ). Вся процедура отнимает немного времени, протекает в одной и той же реакционной колбе и не требует трудоемких операций по экстракции, нейтрализации полимерным катионообменником и многочисленных упариваний водных растворов пиридина (рис. 5). В случае цитидина на промежуточной стадии образуется некоторое количество 4-К-5-0-бис-диметокситритилпроизводного, но при обработке бен-зоилхлоридом оно количественно превращается в Н-бензоильное производное. Метод позволяет кроме бензоильной и изобутирильной вводить также и другие группы /63,64/ (см.ниже). Дополнительно к упомянутым выше, был предложен целый ряд других ацильных защитных групп. В работах /65,66/ содержится сравнение скоростей гидролиза некоторых из них в щелочных уеловиях, что позволяет в случае необходимости выбрать более устойчивую или, наоборот, более легкоудаляемую N-защитную группу. Применение трет-бутилфенилацетильной (Ade , Gua ) /67/,фенил-ацетильной (Gua ) /68/, дифенилацетильной (Ade ) /69/ и 4-трет-бутилбензоильной (Ade ) /70/ групп для защиты экзоцикличес-ких аминофункций позволяет увеличить общую липофильность синтезируемой молекулы, что, в свою очередь, облегчает ее выделение. Нужно отметить предложенную вместо бензоильной для защиты остатков Ade и Cyb изобутилоксикарбонильную группу /71/, устойчивую к применяемому для удаления О-защитных групп гидразину (раздел 1.2.2). Некоторыми авторами и были использованы N-защитные группы, устойчивые в щелочных условиях, с альтернативным механизмом удаления. Так например, левулиновая группа, применяемая при защите аминогрупп Ade и Cyt , устойчива ко всем условиям синтеза и в то же время легко и быстро удаляется в мягких условиях (табл. I). Введение этой же группы в остаток гуанина требует очень жестких условий и проходит С НИЗКИМ ВЫХОДОМ \20fo) /72/.
Хорошо известная в пептидной химии бензилоксикарбонильная группа, удаление которой происходит в мягких условиях гидрогенолиза, может быть использована для защиты Ade и Cyt /73/. Применение устойчивой к действию аммиака и триэтиламина в метаноле, но легко удаляемой действием DBH и DBN по механизму В-элиминирования 4-нитрофенилэтоксикарбонильной группы для защиты остатков Ade и Cyt , позволяет уменьшить лабильность гликозид-ной связи в аденозине по сравнению с соответствующим бензоиль-ным производным /74 ,75/. В разделе І.І. уже говорилось, что с приходом триэфирного метода проблема прочности гликозидной связи, проблема депурини- зации под действием кислотных агентов, особенно в случае аде- ниновых производных, стала одной из серьезнейших проблем олиго- нуклеотидного синтеза. В связи с этим много внимания уделяется поиску защитных групп, применение которых уменьшает депуриниза- цию. Одной из таких групп является фталоильная (табл. I), ис пользованная в работах /76 ,77/ для защиты остатков Ade . По данным авторов, гликозидная связь в образующемся фталимидном производном обладает в несколько раз большей устойчивостью к действию кислот, чем в соответствующем бензоильном производном. Несколько позже теми же авторами был проведен сравнительный ана лиз устойчивости в кислой среде производных дезоксиаденозина с различными N-защитными группами: сукцинильной и замещенными фталильными /78/. Показано, что наиболее устойчивым является сукцинимидное производное, оно же показало наибольшую устойчи вость и в 50% водном пиридине. В другой работе /79/ также для защиты Ade были предложены различные диалкилформамидиновые груп пы с общей формулой =СН-ШІ2 наибольшей устойчивостью среди ко торых обладают группы с объемными заместителями (Е= -СН(СН„)2, -СН2СН(СН3)2, -СН3СН2СН2СН3). Известно, что введение Н-ациль- ной защитной группы тем сильнее дестабилизирует гликозид- ную связь, чем больше выражены электроноакцепторные свойства ацильного остатка. Авторы предположили, что устойчивость dA в кислых условиях определяется сохранением основности экзоцик-лической аминогруппы Ade , что может быть достигнуто применением диалкилформамидиновых защитных групп. Приведенные в работе /80/ данные показывают практически одинаковую устойчивость в кислых условиях дезоксиаденозина и его П-диизопропилформамиди-нового производного. Другой N-защитной группой этого типа является N-метилпирролидиновая /81/. 1г-(и-метил-2-пирролидин-амидин)-2-дезоксиаденозин, по данным авторов, в три раза устойчивее к кислотной депуринизации, чем dAbz , к тому же введение этой защитной группы, в отличие от всех остальных, можно проводить селективно, не затрагивая углеводный фрагмент.
Создание межнуклеотидной связи
Формально процесс создания межнуклеотидной связи можно разделить на два этапа. На первом этапе, называемом обычно стадией фосфорилирования, происходит создание химической связи между углеводным фрагментом нуклеозидного остатка и неорганическим фосфатом (уравнение Образовавшийся нуклеотид на втором этапе, в ряде случаев называемом стадией конденсации, фосфорилирует остаток другого нук-леозида, что и приводит к созданию собственно межнуклеотидной связи (уравнение 2): Подобное разграничение, разумеется, условно, и существует целый ряд примеров, когда создание межнуклеотидной связи проводилось как единый непрерывный процесс без выделения промежуточных продуктов. Однако разделение этих двух этапов дает определенные преимущества в плане систематизации имеющегося материала, и поэтому будет использовано при его изложении. 1.3.1. Фосфотриэфирный метод Создание межнуклеотидной связи в триэфирном методе синтеза может осуществляться несколькими путями с использованием различных реагентов (схема ІІІ). Вначале оудет рассмотрен первый этап (фосфорилирование), которому на схеме отвечают стадии I, П и Ш. Обзор большого числа методов фосфорилирования и используемых для этого фосфорилирующих реагентов содержится в работах /34, с.477-506, и 33/. Защищенные нуклеозиды могут фосфорилиро-ваться как моно- (пути її, Ш), так и диэфирными (путь І) фосфо-рильными производными, при этом вводятся соответственно одна или две фосфатные защитные группы. Получение активного фосфорилирую-щего производного может осуществляться методом активации моно-(путь Ш) или дизамещенного (путь І) фосфата in situ действием подходящего конденсирующего агента, как это впервые было Активация гидроксила происходит с помощью реактива Гриньяра. Метод позволяет обходиться без конденсирующего реагента и при наращивании цепи - триэфирный продукт фосфорилирования, содержащий п-нитрофенильный остаток, оказывается достаточно активным для вступления в реакцию с другой активированной молекулой нук- леозида. По словам авторов, метод очень прост, дает отличные выходы и, что самое главное, позволяет работать с незащищенными по гетероциклическим остаткам производными нуклеозидов. Б недавно появившейся работе /203/ метод был использован для получения олигорибоаденилатов, содержащих 2-5 фосфатную связь.
Для фосфорилирования применяются и так называемые "бифункциональные" фосфорилирующие агенты с общей формулой Е0-Р(0)Хр (схема Ш, путь ІІ). Метод основан на том, что в образующемся соединении (х) (схема Ш) активация атома фосфора оказывается уже недостаточной для прохождения дальнейшего фосфорилирования с образованием продуктов с симметричными 3-е/ и 5-5 связями. На практике однако наблюдается образование подобных продуктов, что является одним из недостатков метода. Средством борьбы с этим недостатком является применение избытка фосфорилирующего агента и подбор подходящего заместителя X. Впервые такие агенты были применены авторами /172/ для введения фенильной защитной группы (Е= Ph , Х= CI). Этот же агент был использован в работе /123/ для фосфорилирования 5-0-диметокситритилтимидина в присутствии 5-хлор-1-этил-2-метилимидазола. Однако использование хле-ра в качестве Х-группы ведет к повышенному образованию симметричного димера, что снижает выход продукта. Поэтому в последующих работах вместо хлора было предложено использовать остатки имидазола Д22/, триазола /204/ и 1-гидроксибензотриазола /205 , 206/. Соответствующий фосфорилирующий агент приготовляется обычно на основе арил-(алкил)дихлорфосфата обработкой его избытком соответствующего азола в присутствии EtnN. Время реакции значительно сокращается при добавлении таких нуклеофилышх катализаторов, как Ру , Меїм /207,208/, DMA.P /208/. Потери диметокситри- тильной группы предотвращает проведение реакции в присутствии о молекулярных сит (4 А) /65/. Получаемые при фосфорилировании бифункциональными реагентами соединения типа (х) (схема Ш) могут подвергаться гидролизу в водной среде с выделением образующегося нуклеотида в виде три-этиламмонийной /85,2X0,197-199/ или бариевой ДІ7 ,211/ соли (схема Ш, путь У). Нуклеотид в дальнейшем может быть активирован в присутствии конденсирующего агента и использован для получения полностью защищенного мононуклеотидного блока, или использован в качестве нуклеотидного компонента в реакции конденсации (схема Ш, путь УІІ), подробнее об этом будет говориться ниже. Производные типа (х) (схема Ш) могут также реагировать со спиртами нбн (цианэтанолом, п-нитрофенилэтанолом, трихлорэтано-лом и др.) с образованием полностью защищенных мононуклеотидов (путь Ї7). Реакция может быть значительно ускорена в присутствии нуклеофильных катализаторов, таких как Меїм, DMAP /35 ,2U7 ,208/. Если & является остатком нуклеозидного компонента, то происходит образование межнуклеотидной связи (схема III, путь УІ).
Подобный способ используется в едином процессе наращивания нуклеозидного остатка на одно нуклеотидное звено (см..раздел ІЛ), протекающем без выделения промежуточных продуктов (схема Ш, путь ІІ-УІ). В качестве электроотрицательной группы X используются остатки хлора Д23Д72/, 1,2 ,4-триазола /65,85,207,208,212-214/ и 1-гидроксибензотриазола /205,206,215,216/. Катализ на стадии образования межнуклеотидной связи (путь УІ) осуществляется основаниями типа 2 ,6-лутидина /172/ и Н,И,М-Диизопропилэтиламина /206 ,216/. Сильное ускорение реакции вызывает присутствие нук-леофильных катализаторов: Меїм /123,207,205,206,215,2X6/ и DMAP /208/ (см.также /65,85,212-214/). Недостатком метода является образование симметричных диме-ров, связанное с применением бифункциональных реагентов. Равновесие реакции можно сместить, взяв избыток фосфорилирующего реагента, но тогда на последующей стадии этот избыток будет фосфо-рилировать остаток второго нуклеозида, что также приведет к образованию побочных продуктов и снизит выход целевого вещества. Другим недостатком метода является довольно медленное протекание второй стадии. От перечисленных выше недостатков свободен метод, использующий для образования межнуклеотидной связи на втором этапе конденсирующие реагенты (схема Щ, путь УІІ), впервые предложенный Г.Кораной и сыгравший большую роль в развитии диэфирного метода синтеза (раздел І.І). Участвующий в реакции нуклеотид получил название нуклеотидного компонента, или Р-компонента ; второй уча- го стник реакции - нуклеозидно, или ОН-компонента, саму реакцию принято называть реакцией конденсации (схема ІУ). В триэфирном методе впервые активацию мезитиленсульфонил- хлоридом для создания межнуклеотидной связи применил Летсингер /217,218/. Позднее были использованы триизопропилбензолсульфонил- хлорид /141,219 ,136 ,122 ,137 ,176 ,174/ и 8-хинолинсульфонилхлорид /220,221,177/ (последний обладает тем преимуществом, что образую- щаяся 8-хинолинсульфокислота дает осадок нейтральной внутренней соли, легко удаляемый фильтрованием). Однако арилсульфонилхлориды являются недостаточно активными конденсирующими реагентами для триэфирного метода , и некоторое время отсутствие таковых сдерживало его развитие. Появившаяся в 1973 году работа /222/, сообщавшая о применении в качестве конденсирующего реагента (в диэфирном методе) арилсульфо-имидазолидов, послужила мощным толчком для поиска новых соединений в этой области. Разными авторами были предложены 2,4,6-триизопропилбензолсульфонил-4-нитроимидазол /143 ,193 ,196/, ме-зитиленсульфонил-4-нитротриазол /211/ и п-толуолсульфонил-4-нитроимидазол /86/, а также различные арилсульфонил-1,2 ,4-три-азолы /204/. Но лишь с появлением в 1976 году сразу же получивших широкое распространение конденсирующих реагентов на основе арилсульфонилтетразолов /38 ,223/, позволивших сократить время конденсации до нескольких десятков минут и резко увеличить ее выход (до 80-90 ), триэфирный метод синтеза олигонуклеотидов стал реальной альтернативой диэфирному.
Удаление защитных групп, выделение и очистка полученных олигодезоксирибонуклеотидов, доказательство их структуры
Выполнившие свои функции в процессе синтеза защитные группы на заключительном этапе подлежат удалению. Одной из самых серьезных проблем, стоявших в триэфирном методе синтеза перед первыми исследователями, была проблема расщепления и изомеризации межнуклеотидных связей в процессе удаления щелочнолабильных фе-нильных Р-защит.цых . групп (/34/, с.517-518). Чтобы уменьшить степень разрыва межнуклеотидных связей (при использовании О,IN NaOH в водном диоксане она достигает 4,2% на одну связь /173/) есть два пути: I) использование более "кислых" замещенных фе-нильных групп (таких, как о- и п-хлорфенильные) и 2) использование вместо гидроксила других нуклеофилов. В качестве таковых были предложены фторид-ион /97,174/ и концентрированный аммиак /38/. Однако по данным авторов /301,302/, наиболее подходящим для этих целей нуклеофилом является ион оксимата (син-2-нитро-бензальдоксимат или син-пиридин-2-карбоксальдоксимат), дающий не более 0,5-1% разрывов на одну межнуклеотидную связь. Единственным неудобством в работе с оксиматом является необходимость прибегать для его удаления к экстракции или обессоливанию. С этой точки зрения более удобной, хотя и дающей несколько больший процент разрыва межнуклеотидных связей, является двухстадий-ная обработка аммиаком: (I) 1-2 дня при 20С (концентрированный аммиак-пиридин) , (2) 5 часов при 50С /14/. В нашей группе было предложено использовать обработку 20/Ь раствором пиперидина в водном пиридине (3 часа при 50С или 24 часа при комнатной температуре), легко удаляемого простым упариванием /125/. При удалении Р-защитных групп с олигонуклеотида, привязанного к полимеру (чаще всего щелочнолабильной сукцинатной группой) , желательно, чтобы это происходило до отщепления самого олигонуклеотида, так как в противном случае возможна изомеризация концевого нуклеотидного звена /109/ или образование фосфами-дов /118/. Для метильных фосфозащитных групп оптимальным является применение тиодят-иона /109,118/ с последующим гидролизом сукцинатной связи аммиаком. Оксимат-ион дает наилучшие результаты при удалении хлорфенильных защитных групп /271/, однако при этом происходит также частичное отщепление олигонуклеотида от полимера Д08 ,278/. Удаление Ы-ацильных защитных групп обычно производится действием концентрированного аммиака при повышенной температуре /55/. В работе /303/ предложено использовать для этой цели смесь этилендиамина с фенолом (1:4) і которая позволяет быстро удалять N-ацильные группы, не затрагивая при этом 2,2 ,2-трихлорэтильные фосфатные защитные группы. Предложен также универсальный метод деблокирования, позволяющий быстро удалять Р- и N-защитные группы и одновременно отщеплять олигонук-леотид с полимера.
В его основе лежит использование І М раствора п-нитробензальдоксима и 1,1,3 ,3-тетраметилгуанидина в смеси диоксан-вода (1:1) при 70С, время обработки по данным авторов составляло 17 часов /304/. Удаление диметокситритильной группы производится обычно 10-15-минутной обработкой 80$ уксусной кислотой (устойчивость гликозидной связи в N,P-деблокированных олигонуклеотидах значительно выше, чем в полностью защищенных). I.6.2. Выделение и очистка синтетических олигодезокси- рибонуклеотидов 1.6.2.1. Хроматографические методы Для очистки олигонуклеотидов были испробованы, наверное, почти все существующие хроматографические методы (см.обзоры /48, 305,306/). Но наиболее широко используемыми и дающими наилучшие результаты являются ионообменная и обращенно-фазовая хроматография. Следует отметить, что использование какого-то одного вида хроматографии часто не позволяет получить продукт удовлетворительной чистоты, поэтому на практике используют комбинации различных хроматографических методов, часто в сочетании с электрофорезом. Разделение олигонуклеотидов ионообменной хроматографией происходит в соответствии с их размерами, при этом несущая наибольшее число отрицательно заряженных фосфатных групп моле- ула, являющаяся самой длинной, элюируется последней. Долгое время наиболее широко используемыми сорбентами были DEAE-цел-люлоза или подобные ей ионообменники на основе декстранов /48/. Разделение проводилось в условиях, предложенных Томлинсоном и Тенером /307а,307/. Наряду с этим некоторые авторы использовали ТСХ на целлюлозе с адсорбированным слоем полиэтиленимина /13 ,38 , 15 /. Разработка методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) привела к появлению сорбента нового типа - силика-геля с привитыми на его поверхности четвертичными аммониевыми группами (сильного анионообменника) типа Permaphase MX /140, 213 ,271 ,280,281) и Partisil SAX /8 ,21,23 Діб ,117 ,214 ,239 ,156 , 274,275,278,279,285,288,289/. Эти сорбенты обеспечивают хорошее разрешение , однако их емкость значительно уступает емкости полимерных анионитов. С другой стороны, предложенные недавно в работах /308-309/ для ионообменной хроматографии олигонуклеотидов сорбенты на основе пористого силикагеля с адсорбированным, а потом сшитым бифункциональными агентами слоем полиэтиленимина, характеризуются не только повышенной емкостью, но и большей разрушающей способностью. Многими исследователями отмечалось, что хроматография самокомплементарных или богатых пуринами олигонуклеотидов часто приводит к аномальной элюции пиков и плохому их разрешению.
Для решения этой проблемы авторами /307а,307/ еще в 1962 году было предложено использовать так называемые дезагреганты - вещества, подавляющие вторичные взаимодействия: 7М мочевину, 8М формамид, 8М этилен- и пропиленгликоли. В ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии олигонуклеотидов, тем не менее, дезагреганты долгое время либо не использовались вообще, либо использовался спирт (ацетонитрил) в концентрации 5-30%. Предложенный в работе /311/ в качестве дезагреганта для ВЭЖХ 30-60 формамид позволил существенно повысить разрешение самокомплементарных и богатых гуаниновыми остатками нуклеотидов, их выход после хроматографии, а также продлить срок службы хроматографической колонки /23,21,289/. Следует упомянуть о методике проведения ионообменной хроматографии олигонуклеотидов в кислых условиях (рН 3,5). При этом происходит протонирование аминогрупп цитидиновых остатков и частично аминогрупп аденозиновых остатков. Тем самым суммарный заряд молекулы олигонуклеотида уменьшается в зависимости от числа цитидиновых и аденозиновых остатков, и появляется возможность разделения одинаковых по длине, но разных по составу молекул. Для разделения нуклеотидов, различающихся по составу, широко применяется обращенно-фазовая хроматография на неполярных пришито-фазных сорбентах (впервые примененная для разделения олигонуклеотидов в лаборатории Кораны /266,147/), так как нуклео-тиды равной длины, но разного состава имеют различную гидрофоб-ность, а следовательно, и разное время удерживания. Сорбенты для обращенно-фазовой хроматографии различаются как используемой силикагельной матрицей (размером и формой частиц, диаметром пор), так и пришиваемой неполярной фазой - углеводородными остатками, содержащими от двух до восемнадцати звеньев, что приводит к некоторым различиям в их свойствах /305/. Описано также применение сорбента /19/ на основе полистирола (PKP-I, Hamilton), по словам авторов, отличающегося большой устойчивостью. При получении олигонуклеотидов обращенно-фазовая хроматография может быть успешно использована на нескольких этапах. О применении ее в процессе синтеза уже говорилось выше (раздел 1.6). Очень удобным является метод обращенно-фазовой хроматографии частично деблокированных олигонуклеотидов, содержащих на 5-конце тритильную группу /19,107,121,109,157/, применяемый обычно для очистки продуктов твердофазного синтеза. За счет большой липофильности тритильной группы удается легко выделить тритилсодержащую фракцию (она элюируется последней), которая в основном содержит желаемую последовательность. Еще одним вариантом применения обращенно-фазовой хроматографии, ставшим почти обязательным для многих исследователей, является очистка на заключительном этапе, после удаления всех защитных групп и очистки другими методами.
Оборудование
Подача элюента на хроматографические колонки осуществлялась поршневым насосом ММС (ЧССР), а также перистальтическим насосом Gilson (Франция). Поглощение элюата измеряли на проточном 7Ф-денситометре Uvicord П 8300 (1KB , Швеция). Использовались также коллектор фракций Ultrorack 7000 и формирователь градиента Ultrograd II300 той же фирмы. Высокоэффективная жидкостная хроматография проводилась на приборах Du Pont Preparative НРЬС System 830 (США.) и Altex , модель 332 (США). В работе были использованы центрифуга Janetzki Т-23 (ГДР), спектрофотометр Specord W/VTS (ГДР), ультрахимископ типа "Хроматоскоп" и миксер (модель ВП) отечественного производства. Приборы для вертикального электрофореза в пластинках изготовлены в механических мастерских ИБХ АН СССР, в качестве источника питания использовалась модель 2103 - power supply (ШВ, Швеция). Для упаривания растворов использовались вакуумные роторные испарители производства ВНР (модели Rotadest и Rotavapor type L6-I08) и ПНР ( Vacuum Rotary Evaporator type 350 ). Ш.З. Методы Ш.3.1. Получение 5 -0 JT-защищеиных дезоксирибонуклеозидов Синтез проводился аналогично методике, предложенной Г.Ко-раной с сотр. /55/. N-Бензоилдезоксиаденозин. 5 г дезоксиаденозин-моногидрата (18 ,б ммоль) высушивали 2-3-кратным упариванием с безводным пиридином до реакционного объема 50 мл. Реакционная колба охлаждалась в бане со льдом, и в нее добавлялось 10 мл свежеперег-нанного хлористого бензоила. При этом наблюдалось сильное разогревание и в течение первых 15-20 минут колбу при интенсивном перемешивании охлаждали в ледяной воде. Затем смесь выдерживалась при комнатной температуре 2-2,5 часа. После этого колба вновь охлаждалась до 0С, к реакционной смеси приливалось 100 мл холодной дистиллированной воды и сразу же 100 мл хлороформа. Содержащий вещество хлороформный слой отделяли на делительной воронке, водный слой еще дважды экстрагировали хлороформом (2x100 мл), объединенные слои промывали 100 мл дистиллированной воды и упаривали до масла. Остаток растворяли в смеси 35 мл пиридина и 50 мл этанола, охлаждали до 0С и прибавляли заранее охлажденную смесь 70 мл 2ВҐ раствора NaOH и 70 мл этанола. Смесь хорошо перемешивалась и выдерживалась в течение 20 минут. Значение рН смеси при этом должно превышать 12 (по индикаторной бумажке). Затем смесь нейтрализовали до рН 7,5 добавлением полимерного катионообненника Dowex - 50W 8 (в пиридиниевой форме) при постоянном перемешивании. Dowex отфильтровывался и трижды промывался на фильтре 30}о водным пиридином.
Объединенный фильтрат упаривался до объема 100 мл (при этом начинает выпадать осадок бензойной кислоты). К смеси добавляли еще 100 мл дистиллированной воды и несколько раз экстрагировали эфиром до полного удаления бензойной кислоты (контроль осуществляли методом ТСХ в системе (А) на пластинках " Silufol UV254 " » при этом в водном слое выпадает N-бензоилдезоксиаденозин. К водному слою добавлялся пиридин, смесь упаривалась, а затем вещество высушивалось 2-3-кратннм упариванием с безводным пиридином. Растворенное в сухом пиридине вещество высаживалось в эфир (предварительно высушенный над безводным хлористым кальцием). Выпавший осадок отделялся центрифугированием, промывался три раза свежими порциями эфира и сушился в эксикаторе. Выход N-бензоиладенозина составлял обычно 90-95% от теоретического. Продукт имел следующие спектральные характеристики (в 95% этаноле): 7 мах 279-283 нм ( Є 282= 2050) » мах 232 237 нм (234= 1 600); щія2 нм Значение Bf N-бензоилдезоксиаде-нозина в системе (А) на пластинках " Siltifol 1 равно 0,55. Н-Анизоилдезоксицитидин. Получение Н-анизоилцитидина проводилось аналогично приведенной выше методике из расчета на 5 г (22 ммоль) дезоксицитидина и 15 мл свежеперегнанного анизоил-хлорида. Для дополнительной очистки от анисовой кислоты вещество хроматографировалось на колонке с силикагелем в градиенте метанола (0-10%) в хлороформе. Выход продукта составлял 85-90% от теоретического. Характеристики продукта: мах 280-288 нм ( 284= 24500) ; плечи 250-260 нм, 298-304 нм ; Л 237 нм (все в 95% этаноле) j Ef в системе (А) равен 0,62. N-Изобутирилдезоксигуанозин. Получение проводилось по той же методике из расчета на 5 г (17,5 ммоль) дезоксигуанозинмоно-гидрата и 10 мл свежеперегнанного изобутирилхлорида. Выход составлял 90-95% от теоретического. Характеристики продукта: \ах 255-260 нм (Є = 16200) , Л шх 281 нм ( = II900) ; Xmin 248 нм ; min2 нм (все в 95% этаноле), Bf в системе (А) равен 0,32. 5-0-Диметокситритил-Н ацилдезоксирибонуклеозиды. 20 ммоль -защищенного дезоксирибонуклеозида высушивались 2-3-кратным упариванием с безводным пиридином, последний раз до реакционного объема 50 мл. К веществу добавлялся 1,3-кратный избыток перекристаллизованного диметокситритилхлорида (8,8 г), и реакция продолжалась 1-І ,5 часа при периодическом перемешивании (контролирование реакции осуществлялось методом ТСХ в системе (Б)).
После завершения реакции к содержимому колбы прибавлялось 500 мл дистиллированной воды и вещество экстрагировалось хлороформом (3x200 мл). Объединенный хлороформный экстракт промывался 100 мл дистиллированной воды и упаривался до масла. Для удаления пиридина вещество несколько раз упаривалось с толуолом. Затем полученный продукт очищался колоночной хроматографией на силикагеле L IOO/I60. Вещество растворялось .— в 100 мл хлороформа, наносилось на колонку, которая после этого промывалась хлороформом для удаления избытка диметокситритилкарбино-ла. Хроматография проводилась с использованием ступенчатого градиента метанола в хлороформе (от I до 6% , через 0 ,5%), вещество элюировалось в районе 3-5% метанола (контроль по ТСХ). Содержащие целевое вещество фракции объединялись и упаривались. Выходы 5-0-диметокситритил-И-ацилдезоксирибонуклеозидов близки к количественным. Полученные соединения имели следующие значения R (по ТСХ в системе (Б) на пластинках Silufol UV 254 : 0,Z (5-0-диметокситритил-к-бензоилдезоксирибоаденозин) ; 0,46 (5-0-диметокситритил-и-э.низоилдезоксирибоцитидин) ; 0,28 (5-0-димет-окситритил-к-изобутирилдезоксирибогуанозин) , 0,37 (5-0-диметок-ситритилдезокситимидин). Ш.3.2. Получение 3-0-бензоил-№-ацилдезоксщшбонуклеозидов 5 ммоль 5-0-диметокситритил-№-ацилдезоксирибонуклеозида высушивали 2-3-кратным упариванием с безводным пиридином до реакционного объема 10 мл. Затем при охлаждении прибавляли 5,5 ммоль (0,64 мл) свежеперегнанного хлористого бензоила, после чего смесь выдерживалась при комнатной температуре 2,5 часа. После завершения реакции (контроль по ТСХ в системе (Б)) смесь выливалась в 100 мл воды со льдом, и экстрагировалась хлороформом (3x100 мл), Объединенные хлороформные вытяжки промывались водой (40 мл) , высушивались пропусканием через слой безводного сульфата натрия и упаривались в вакууме. Для удаления следов пиридина остаток несколько раз упаривался с толуолом. Удаление диметокситритильной группы производилось действием 2% раствора п-толуолсульфокислоты в смеси хлороформ-метанол (7:3, 10 мл на I ммоль нуклеозида при 0С) в течение 2-5 минут, полноту протекания реакции контролировали ТСХ в системе (Б). Затем прибавлялся равный объем хлороформа и полученный раствор экстрагировался 2-3 раза 5% раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделялся и упаривался до масла, остаток растворялся в хлороформе и продукт выделялся колоночной хроматографией на силикагеле L 100/160 в ступенчатом градиенте метанола в хлороформе (2-8% через 0,5%), вещество элюировалось в районе 3-5% метанола. Содержащие целевые вещества фракции (проверка осуществлялась методом ТСХ в системе (Б)) объединялись и упаривались в вакууме.
