Содержание к диссертации
Введение
2 Литературный обзор 8
2.1 Фукоиданы бурых водорослей и фукансульфаты иглокожих. Общие сведения 8
2.2 Классификация фукоиданов 9
2.2.1 Фукоиданы, построенные из а-1— 3-связанных остатков сульфатированной L-фукозы 10
2.2.2 Фукоиданы, построенные из а-1— 3- и а-1— 4-связанных остатков сульфатированной L-фукозы 13
2.2.3 Фукоиданы сложного состава. Галактофуканы 15
2.2.4 Фукансульфаты иглокожих 16
2.3 Фукоиданазы. Общая информация 21
2.3.1 Номенклатура и классификация фукоиданаз 21
2.3.2 Методы определения фукоиданазной активности 22
2.3.2.1 Колориметрические методы 22
2.3.2.2 Физико-химические методы 23
2.3.3 Распространение фукоиданаз 25
2.3.4 Выделение и очистка фукоиданаз 26
2.3.5 Физико-химические свойства фукоиданаз 28
2.3.6. Тип действия и специфичность фукоиданаз 30
2.3.7 Структура фукоиданаз 40
2.3.8 Индукция биосинтеза фукоиданаз в микроорганизмах 43
2.4 Альгиновые кислоты 49
2.4.1 Структура альгиновых кислот 50
2.6 Альгинат-лиазы 51
2.6.1 Номенклатура и классификация альгинат-лиаз 51
2.6.2 Методы регистрации альгинолитической активности 52
2.6.3 Распространение альгинат-лиаз 53
2.6.4 Альгинат-лиазы бактерий 53
2.6.5 Альгинат-лиазы грибов, бактериофагов и вирусов 54
2.6.6 Альгинат-лиазы беспозвоночных и морских водорослей 56
3 Результаты и их обсуждение 58
3.1 Методы поиска продуцентов фукоиданаз среди бактерий 58
3.2 Фукоиданазы морской бактерии Formosa algaeКММ 3553Т 60
3.2.1 Влияние различных углеводных компанентов питательной среды на биосинтез фукоиданаз в морской бактерии F. algae КММ 3553Т 60
3.2.2 Выделение и характеристика свойств фукоиданазы из морской бактерии F.a/gaeКММ 3553Т 64
3.2.3 Анализ аминокислотных последовательностей фукоиданаз F. algae КММ 3553Т (Биоинформационный анализ фукоиданаз) 69
3.2.4 Получение рекомбинантных фукоиданаз F. algae КММ 3553Т 75
3.3 Фукоиданаза из морского моллюска Lambissp 83
3.4 Альгинат-лиазы морской бактерии F. algae и морского моллюска Lambis sp 92
4 Экспериментальная часть 98
4.1 Материалы и реагенты 98
4.3 Методы исследования 99
5 Выводы 115
6 Список литературы 117
- Фукоиданы, построенные из а-1— 3-связанных остатков сульфатированной L-фукозы
- Индукция биосинтеза фукоиданаз в микроорганизмах
- Выделение и характеристика свойств фукоиданазы из морской бактерии F.a/gaeКММ 3553Т
- Фукоиданаза из морского моллюска Lambissp
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение уникальных ферментов морских организмов, расщепляющих полисахариды бурых водорослей, характеристика их каталитических свойств и структуры – актуальная задача современной энзимологии. Объектами нашего исследования являются фукоиданазы и альгинат-лиазы морских беспозвоночных и бактерий, принимающие участие в катаболизме полианионных полисахаридов морских водорослей. Эти ферменты исследованы недостаточно, поэтому их изучение расширит наши теоретические знания о структурно-функциональных свойствах этих ферментов и позволит направленно использовать их для установления структуры природных полисахаридов.
Субстратами для исследуемых ферментов являются альгиновые кислоты (гетерополисахариды, состоящие из остатков маннуроновых и гулуроновых кислот) и фукоиданы (высокосульфатированные гомо- и гетерополисахариды). Эти полисахариды бурых водорослей относят к так называемым «поливалентным биомодуляторам», так как они обладают широким спектром биологической активности: иммуномодулирующей, радиопротекторной, антиопухолевой, антивирусной, антимикробной, антикоагулянтной, гепатозащитной и другими. Все эти свойства делают возможным использование полисахаридов бурых водорослей в медицине. Однако лекарства на их основе еще не созданы. Это связано с недостатком информации о взаимосвязи структуры и биологической активности полисахаридов водорослей и отсутствием простых и воспроизводимых методов стандартизации препаратов. Существуют трудности в установлении структуры этих биополимеров, характеризующихся большим структурным разнообразием, гетерогенностью получаемых фракций, сложным построением молекул. Для стандартизации природных полисахаридов, установления их структуры, увеличения биологической активности и снижения побочных эффектов наиболее перспективным является использование ферментов.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является установление первичной структуры и характеристика каталитических свойств фукоиданаз и альгинат-лиаз морских организмов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Разработать методы поиска продуцентов фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских организмов; 2) Выбрать продуценты фукоиданаз и альгинат-лиаз среди морских бактерий и беспозвоночных; 3) Разработать схемы выделения индивидуальных фукоиданаз и альгинат-лиаз из выбранных объектов; 4) Изучить каталитические свойства, специфичность и тип действия выделенных ферментов; 5) Установить структуры продуктов ферментативной трансформации фукоиданов и альгиновых кислот; 6) Определить аминокислотные последовательности выделенных ферментов; 7) Получить рекомбинантные аналоги исследуемых ферментов и провести их сравнительное изучение.
Научная новизна и практическая значимость работы: Разработан простой метод поиска продуцентов фукоиданаз среди микроорганизмов. Впервые выделены: внутриклеточная фукоиданаза из штамма морской бактерии Formosa algae KMM 3553T, фукоиданаза и альгинат-лиаза из печени морского моллюска Lambis sp. Определены их основные биохимические свойства, специфичность и тип действия. Установлены структуры основных низкомолекулярных продуктов трансформации фукоидана и полигулуроновой кислоты, полученных под действием выделенных ферментов. Установлены первичные структуры двух фукоиданаз из штамма морской бактерии F. algae KMM 3553T. Получены две рекомбинантные фукоиданазы F. algae KMM 3553T и проведено сравнительное исследование их каталитических свойств.
Показаны особенности действия новых ферментов и возможности их дальнейшего применения для исследования структур фукоиданов и альгиновых кислот. Рекомбинантные фукоиданазы могут найти свое применение в биотехнологии, для получения сульфатированных фукоолигосахаридов, которые
имеют перспективы использования их в качестве биологически активных добавок и лекарственных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанный метод обнаружения фукоиданаз в бактериях применим для масштабного поиска продуцентов этих ферментов.
-
Внутриклеточная фукоиданаза (FFA), выделенная из морской бактерии F. algae KMM 3553Т, является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление -14-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из Fucus evanescens.
-
Геном морской бактерии F. algae KMM 3553Т содержит два гена, кодирующих внеклеточную (FFA1) и внутриклеточную (FFA2) фукоиданазы.
-
Фукоиданазы FFA1 и FFA2 относятся к 107 структурному семейству О-гликозидгидролаз.
-
Рекомбинантные фукоиданазы FFA1 и FFA2 являются ферментами эндо-типа действия и катализируют расщепление -14-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.
-
Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp. является ферментом эндо-типа действия и катализирует расщепление -14-О-гликозидных связей между остатками L-фукозы в молекуле фукоидана из F. evanescens.
-
Альгинат-лиаза из морского моллюска Lambis sp., является ферментом эндо-типа действия, и имеет редкую для альгинат-лиаз морских беспозвоночных специфичность: катализирует расщепление -14-гликозидных связей между остатками L-гулуроновой кислоты. Фермент классифицирован как поли-14--L-гулуронат-лиаза (КФ 4.2.2.11). Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на:
Первом международном симпозиуме «Marine Enzymes and Polysaccharides», Вьетнам, 2012; конференции молодых ученых «ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ», Россия, 2013 и пятом Российско-Корейском форуме «The 5th Korea-Russia Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application», Корея 2013.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах из списка ВАК РФ и 8 тезисов докладов в материалах научных конференций. Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей. Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и их обсуждение, Экспериментальную часть, Выводы и Список литературы. Список литературы включает 213 источников. Диссертация изложена на 141 странице и содержит 41 рисунок, 24 таблицы и 4 приложения.
Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю к.б.н. Кусайкину Михаилу Игоревичу за помощь в выполнении диссертационной работы. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН: проф. Т.Н. Звягинцевой, к.х.н. В.В. Сова, к.х.н. А.М. Захаренко, к.х.н. Р.В. Меньшовой, к.х.н. М.С. Автушенко, д.х.н. С.П. Ермаковой, к.х.н. О.С. Вищук, к.х.н Н.М. Шевченко, к.х.н. Т.И. Имбс, к.б.н. Ю.В. Дубровской, д.х.н. И.Ю. Бакуниной, н.с. М.И. Киселевой за всестороннюю поддержку и обсуждение полученных результатов в ходе выполнения работы. Автор также благодарен к.х.н. В.В. Исакову и к.х.н. П.С. Дмитренку за получение и помощь в обработке спектральных данных; к.б.н. В.В. Куриленко и д.б.н. О.И. Недашковской за выполнение некоторых микробиологических экспериментов; к.б.н. С.Н. Ковальчук, проф. Nils Peder Willassen, Ph.D. Bjerga Gro Elin Kjreng за помощь в проведении отдельных экспериментов в области молекулярной биологии и генной инженерии.
Сокращения и условные обозначения: а.о. – аминокислотный остаток; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДСН – додецилсульфат натрия; ПААГ-электрофорез – электрофорез в полиакриламидном геле; Р.И. - рефрактометрический индекс; ЯМР-спектроскопия – спектроскопия ядерного магнитного резонанса; Gal – галактоза; FFA1 – внеклеточная фукоиданаза из морской бактерии F. algae; FFA2 – внутриклеточная фукоиданаза из морской бактерии F. algae; FFA1-SD – усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA1 без С концевого домена; FFA2-SD – усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA2 без С-концевого домена; FFA1-KD – усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA1 без С-концевого и кадгериноподобных доменов; FFA2-KD – усеченное с С-конца производное фукоиданазы FFA2 без С-концевого и кадгериноподобных доменов; Fucp – фукопираноза; MALDI масс-спектрометрия – масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией; Xyl – ксилоза.
Фукоиданы, построенные из а-1— 3-связанных остатков сульфатированной L-фукозы
Бурые водоросли порядка Laminariales и Ectocarpales синтезируют фукоиданы, основным структурным мотивом которых являются а-1— 3 -связанные остатки сульфатированной фукозы (рис. 2.1).
Фукоиданы, выделенные из водорослей порядка Laminariales, построены из а-1— 3-связанных остатков фукозы, сульфатированных по С2 и/или С4 положениям. Фукоиданы такого строения были выделены из бурых водорослей Saccharina cichorioides (Laminaria cichorioides) [20; 21], S. latissima (L. saccharina) [22; 23] и Lessonia vadosa [24].
Из бурой водоросли Chorda Шит [25] был выделен фукоидан, главная цепь которого состояла из гексасахаридного повторяющегося звена, в котором на пять а-1— 3 -связанных остатков L-фукозы приходился один остаток фукозы в качестве бокового ответвления при С2. Гидроксильные группы в положениях С4 и реже С2 были этерифицированы серной кислотой.
Помимо остатков фукозы в состав молекул фукоиданов могут входить и другие моносахариды. Так, некоторые фракции фукоиданов, выделенные из бурых водорослей S. gurjanovae, S. japonica и S. longicruris, кроме фукозы содержали значительное количество галактозы [26-28].
Из бурой водоросли Undaria pinnatifida была выделена фракция галактофукана, главная цепь которого построена из 1— 3-связанных остатков a-L-фукопиранозы и /J-D-галактопиранозы в соотношении 1:0,9. Минорные количества ксилозы и маннозы также были обнаружены в составе этого полисахарида [29]. Из этого же вида водоросли был выделен сульфатированный галактофукан, с таким же соотношением остатков a-L-фукопиранозы и /J-D-галактопиранозы (1:0,9). Было установлено, что этот полисахарид состоял из блоков, включающих остатки фукозы и галактозы (п=2-5). Остатки ctr-L-фукопиранозы были сульфатированы при С2 и реже при С4, положение сульфатных групп также отмечалось при СЗ и/или С6 остатков /J-D-галактопиранозы [15]. Из бурой водоросли S. latissima были выделены четыре фракции фукоиданов. Первая - имела типичное для порядка Laminariales строение: основная цепь, построенная из а-1— 3-связанных остатков фукозы, сульфатированных в основном по С4, реже по С2 положениям [22]. После разделения общей фракции фукоиданов из этой же водоросли на колонке с анионообменным носителем, были получены: фукогалактан, построенный из 1— 6-связанных остатков /J-D-галактопиранозы с ответвлениями от основной цепи в виде единичных 1— 4-связанных остатков a-L-фукозы и /J-D-галактозы; фукоглюкурономаннан, состоящий из 1— 4-связанных остатков /J-D-глюкуроновой кислоты и сс-1— 2-связанных остатков D-маннопиранозы с боковыми ответвлениями в виде остатков L-фукопиранозы по СЗ a-D-маннозы и фукоглюкуронан, построенный из 1— 3 -связанных остатков /J-D-глюкуроновой кислоты и содержащий разветвления в виде остатков a-L-фукопиранозы в положении С4 [23]. Аналогичная фракция фукоглюкурономаннана была выделена из водоросли К. crassifolia семейства Laminariaceae [19]. Исследование продуктов деградации фукоидана из S. gurjanovae, полученных в результате сольволитического десульфатирования, методом MALDIOF масс-спектрометрии позволило обнаружить смешанные фукогалактоолигосахариды. Было высказано предположение, что данный фукоидан представлял либо сульфатированный и частично ацетилированный галактофукан блочного строения, либо смесь частично ацетилированных и высокосульфатированных фукана, галактофукана и, возможно, галактана [26].
Бурые водоросли, принадлежащие к порядку Ectocarpales, в отличие от водорослей порядка Laminariales синтезируют фукоиданы с большим количеством боковых ответвлений. Так, из бурой водоросли Cladosiphon okamuranus [30] был получен фукоидан, главная цепь которого была построена из остатков L-фукозы, соединенных а-\— 3-0-гликозидными связями и имеющих боковые ответвления, в основном, в виде ctr-D-глюкуроновой кислоты в положении при С2. Сульфатные группы расположены в основном при С4 остатка фукопиранозы. Более сложную структуру имел фукоидан из Chordaria flagelliformis. Его основная цепь частично гликозилирована по положениям С2 ctr-D-глюкуроновой кислотой. Часть молекул гликозилирована по С4 единичными остатками сульфатированной фукофуранозы и/или дисахаридными звеньями a-L-Fuc(1 2)-ctr-L-Fuc./-(l— [31]. Фукоидан, основная цепь которого построена из 1— 3-связанных остатков oc-L-фукопиранозы, содержался в бурой водоросли Analipus japonicus, которая является представителем порядка Ralfsiales. Этот фукоидан имел преимущественно а-\— 4- и реже а-1— 2-связанные остатки L-фукопиранозы в виде боковых ответвлений. Сульфатные группы расположены в основном, в положении С2, а ацетильные группы в положении С4 остатка фукопиранозы [32].
Индукция биосинтеза фукоиданаз в микроорганизмах
Фукоиданаза FcnA, выделенная из морской бактерии М. fucanivorans SW5, является наиболее изученной. [36; 76]. Для установления специфичности этого фермента авторы использовали в качестве субстрата фукоидан из бурой водоросли P. canaliculata, структура которого представляла собой повторяющиеся дисахаридные звенья, построенные из сульфатированной фукозы, связанной чередующимися а-\— 3- и а-1— 4-гликозидными связями: [3)-a-L-Fucp-(20S03")-1 4-a-L-Fucp-(2,30S03")-(l—]. В результате ферментативной реакции были получены тетра- и гексасахариды следующей структуры: [3)-a-L-Fucp-(20S03")-1 4-a-L-Fucp-(2,30S03")-(l— ]п- Дополнительная информация о субстратной специфичности фукоиданазы FcnA была получена с использованием рекомбинантного аналога природной фукоиданазы [76].
Для установления специфичности фермента сравнивали ЯМР спектры исходного фукоидана из P. canaliculata и суммарной фракции низкомолекулярных продуктов, полученных ферментативным гидролизом этого фукоидана. В спектрах Н-ЯМР продуктов наблюдалось уменьшение интенсивности сигналов протонов при С1 (5,45 мд.), соответствующих 1—»4-a-L-Fucp-(2,30S03 ), в то же время сигналы протонов при С1 (5,3 мд.), соответствующие 1— 3-a-L-Fucp-(20S03"), оставались без изменения. На двумерных спектрах DQF-COZY продуктов отсутствовал кросспик в области 5,45 и 4,69 мд., соответствующий внутренним 1— 4-0-гликозидным связям при a-L-Fucp-(2,30S03"), который присутствовал в фукоидане до его обработки фукоиданазой. Исходя из полученных данных, авторы сделали вывод о том, что фукоиданаза из М. fucanivorans SW5 специфична к а-\— 4 гликозидным связям, расположенным внутри повторяющегося фрагмента [4)-a-L-Fucp-(2,30S03")-l— 3-a-L Fucp-(20S03")-(1—] основной цепи фукоидана. Фукоиданаза являлась гидролазой, так как при ферментативном гидролизе фукоидана не было обнаружено увеличения поглощения в УФ области спектра при длине волны 232 нм характерной для 4,5-ненасыщенных пираноз - продуктов, которые накапливаются при расщеплении субстратов по лиазному механизму.
Установлена структура низкомолекулярных продуктов, полученных при действии внеклеточного фермента из Alteromonas sp. SN-1009 на фукоидан из К. crassifolia [77]. Сравнение структуры продуктов со структурой исходного субстрата позволило сделать вывод о том, что исследуемая фукоиданаза, по-видимому, является ферментом эндо-типа действия и специфична к сс-1— 3-гликозидным связям.
Ферменты, специфичные к /7-І— 4-гликозидным связям между остатками глюкуроновой кислоты и маннозы, были выделены из морских бактерий Flavobacterium sp. SA-0082 и F. marinus SI-0098 [98; 107]. Эти ферменты расщепляли фукоидан SFGM (фукоглюкурономаннан сульфат) из К. crassifolia. В результате были получены сульфатированные 4,5-ненасыщенные фукоглюкурономаннан олигосахариды. Практически все продукты имели на невосстанавливающем конце 4-дезокси-Ь-эритро-гекс-4-енопиранозилуроновую кислоту, а на восстанавливающем конце - маннозу или ее сульфатированные производные. Структура продуктов свидетельствовала о том, что данные ферменты являются лиазами и расщепляют субстрат по механизму [3-элиминирования. Интересно, что ферментный препарат из морской бактерии F. marinus SI-0098 катализировал расщепление и других фукоиданов, выделенных из бурых водорослей сем. Laminarinaceae: U. pinnatifida и Lessonia nigrescens [108].
Морская бактерия Flavobacteriaceae CZ1127 является продуцентом внутриклеточной и внеклеточной фукоиданаз, которые деполимеризовали фукансульфаты, выделенные из различных видов иглокожих, а также фукоиданы бурых водорослей. Для сравнительной характеристики ферментов в качестве субстрата использовали фукансульфат из голотурии A. molpadioides. Показано, что препарат внутриклеточного фермента расщеплял субстрат на более короткие (3,7 кДа) фрагменты по сравнению с внеклеточным (57,7 кДа). Авторы предположили, что такие отличия связаны или с разной величиной фукоиданазной активности препаратов, или ли с различным типом действия ферментов. Препарат внутриклеточного фермента, по их мнению, содержал фукоиданазу, действующую по эндо-типу[96].
Препарат фукоиданазы из штамма CZ1127 был использован для установления структуры фукансульфата из A. molpadioides [66]. В результате обработки фукансульфата фукоиданазой были получены низкомолекулярные продукты и определена их структура. Было показано, что основным структурным фрагментом фукансульфата является [3)- a-L-Fucp-1 3-a-L-Fucp-(2,4S03")-(l—]. Анализ данных о структуре субстрата и продуктов его ферментативного гидролиза позволил заключить, что используемый фермент специфичен к гидролизу сс-1— 3-гликозидных связей в молекуле фукансульфата.
Подобной специфичностью и типом действия обладала внутриклеточная фукоиданаза, обнаруженная в морской бактерии F. fucoidanolyticus SI-1234 [30]. При действии фермента на фукоидан из С. okamuranus была получена серия олигосахаридов с повторяющимся фрагментом следующей структуры:
В морской бактерии S. paucimobilis PF-1 обнаружена фукоиданаза, ассоциированная с клеточной поверхностью. Суспензия клеток деполимеризовала фукоидан из U. pinnatifida с образованием низкомолекулярных продуктов, в которых не содержалась фукоза. Фермент также не действовал на я-нитрофенил-а-Ь-фукопиранозид, поэтому было сделано предположение, что бактерия продуцирует фукоиданазу эндо-типа действия [97].
Фукоиданаза из Flavobacterium sp. F-31, вероятно, тоже была связана с клеточной стенкой. Клеточный экстракт этой бактерии с высокой скоростью катализировал деполимеризацию фукоидана из С. okamuranis [95].
Выделение и характеристика свойств фукоиданазы из морской бактерии F.a/gaeКММ 3553Т
Большая часть грибов, являющихся продуцентами альгинат-лиаз, были морскими обитателями поверхности талломов морских водорослей [170; 172-174]. Имеется только одно сообщение об альгинат-лиазах, обнаруженных в грибах отдела Ascomycetes, обитающих на суше [179].
Практически все изученные альгинат-лиазы грибов являлись внеклеточными ферментами [134]. Только в грибах рода Asteromyces spp. альгинат-лиазы были связаны с поверхностью клеток и практически не секретировались в культуральную среду [170].
Имеются немногочисленные сведения о специфичности альгинат-лиаз грибов. Альгинат-лиаза из D. salina была специфична к расщеплению связей между остатками маннуроновой кислоты [173]. Альгинат-лиаза широкой специфичности была выделена из A. oryzae[lll].
Известные альгинат-лиазы грибов проявляли максимальную активность в области рН 5 - 7 и при температуре 37-45 С [170-174]. Хлорид натрия в концентрации от 1 до 3 % активировал альгинат-лиазу из D. salina, в то время как активность альгинат-лиазы из D. arenaria падала в присутствии 1 % NaCl [172; 174]. Ионы двухвалентных металлов: Са +, Mg +, Zn + увеличивали активность альгинат-лиаз из D. salina и D.
O-L 0-1- 0-1- 0-1- 0-1 arenaria NaCl [172; 174]. Ионы Zn , Mg , Mn , Си и Co активировали альгинат-лиазу из A. oryzae, а ионы Са +, Cd + и Hg + ингибировали активность того же фермента [171; 172; 174].
Альгинат-лиазы бактериофагов являются внеклеточными ферментами и проявляют эндолитическую активность. Молекулярные массы альгинат-лиаз бактериофагов лежат в области 30 - 42 кДа, рН-оптимум 7,5-8,5 [144; 145; 180; 181; 182]. Из вируса, поражающего зеленую водоросль рода Chlorella, была выделена единственная альгинат-лиаза вирусного просхождения [183]. Ген, кодирующий её, был клонирован и экспрессирован в штамме Escherichia coli. Этот фермент был гомологичен маннуронат-лиазе морского моллюска Т. cornutus. Молекулярная масса альгинат-лиазы вируса составляла 39 кДа, оптимум рН 10,5. Активность альгинат-лиаза проявляла только в присутствии ионов С а [183]. 2.6.6 Альгинат-лиазы беспозвоночных и морских водорослей
Несмотря на то, что альгинат-лиазная активность была обнаружена в большом количестве морских моллюсков, немногие из этих ферментов были выделены и охарактеризованы. Альгинат-лиазы были выделены из пищеварительных органов Littorina sp. [184; 185], Т. cornutus [143; 186-188], Haliotis discus hannai [189], H. rufescens и H. corrugate [190]. Путем клонирования гена были установлены первичные аминокислотные последовательности альгинат-лиаз из Aplysia kurodai [191], Н. discus hannai [192] и L. brevicula [193]. Продукты их генов были экспрессированы, и изучены свойства рекомбинантных альгинат-лиаз.
Показано, что в некоторых моллюсках биосинтезируются несколько альгинат-лиаз. Два изофермента, специфичные к расщеплению связей между остатками маннуроновых кислот, были выделены из Т. cornutus [188]. Две альгинат-лиазы, различающиеся по типу действия, обнаружены в моллюсках A. kurodai, Н. discus hannai, L. brevicula и H. rufescens [189; 190; 193; 194]. Большинство изученных альгинат-лиаз моллюсков представлено эндо-1 —»4-/?-В-маннуронат-лиазами, экзо-1 —»4-/?-В-маннуронат-лиазами или альгинат-лиазами, специфичными к ММ и МГ участкам цепи альгиновых кислот [134]. Исключение составляет одна из двух альгинат-лиаз, выделенных из Н. rufescens, которая была классифицирована как экзо-1— 4-а-Ь-гулуронат-лиаза [190].
Полиманнуранат-лиазы морских моллюсков проявляли максимум активности в слабокислых и щелочных диапазонах рН от 5,6 до 9, в то время как экзо-а-1— 4-Ь-гулуронат-лиаза из Н. rufescens проявляла активность в кислой области рН 4,0 [190]. Активность альгинат-лиазы из Haliotis spp. увеличивалась в 0,05-0,75 М NaCl [190]. Более высокая концентрация NaCl (0,2-1 М) была необходима для проявления максимальной активности альгинат-лиаз, выделенных из Н. tuberculata, Spisula solidissima, Т. cornitus [188; 195; 196]. Nakada и соавторы предположили, что при увеличении ионной силы происходит уменьшение вязкости раствора альгината, что облегчает действие фермента [190].
Ионы металлов Mg , Мп , Со и Ni оказывали активирующее действие на активность большинства альгинат-лиаз моллюсков [134]. Ионы Са являлись активаторами одного из изоферментов Т. cornutus, однако ингибировали ферментативную активность альгинат-лиазы из Н. rufescens [188-190]. Ионы Znz и Си оказывали ингибирующее действие на альгинат-лиазу из Littorina sp. [185]. Ограничены сведения об альгинат-лиазах из морских водорослей. Было установлено, что уровень активности альгинат-лиаз зависит от сезона сбора водорослей, а также от места локализации ферментов в талломе [197]. Максимальную активность альгиназы водорослей U. pinnatifida и P. canaliculata проявляли при рН 7,5 - 7,7 [136; 140; 197] и увеличивали свою активность в присутствии ионов Са [136; 140]. Большинство альгинат-лиаз водорослей проявляли способность расщеплять гликозидные связи как между остатками маннуроновой, так и между остатками гулуроновой кислот в молекулах альгинатов [134]. Однако, вывод о столь широкой специфичности одного фермента вызывает сомнения, так как при изучении свойств альгинат-лиаз водорослей использовались неочищенные ферментные препараты, которые могли содержать несколько альгинат-лиаз с различной специфичностью.
Фукоиданаза из морского моллюска Lambissp
Органические растворители, неорганические кислоты и соли (чда) производства «Реахим» (Россия). Акриламид, бис-акриламид, глицин, трис (2-гидроксиметил-2-метил 1,3-пропандиол), глицерин, Р-меркаптоэтанол, дитиотреитол (DTT), 1Ч,1Ч,]Ч ,]Ч -тетраметилен-этилендиамин (ТЕМЕД), персульфат аммония, этилендиаминтетрауксусная (ЭДТА), агароза, ампицилин, хлорамфеникол, гексадецилтриметиламмоний бромид - коммерческие препараты фирмы «Sigma» (США).
Стандартные белки: бычий сывороточный альбумин (БСА), ангидраза, химотрипсиноген А, миоглобин, питохром С, апротинин, лизоцим, иммуноглобулин, Р-лактоглобулин («Sigma», США). Набор белков для ПААГ-электрофореза «Precision Plus Protein Standards» 10-250 кДа фирмы «Bio-Rad» (США). Декстраны Т-10, -20, -40, -80, -100, декстран-голубой (2000 кДа) - препараты фирмы «Sigma». Пептон, дрожжевой экстракт (фирмы «Difco», США), ксилоза, глюкоза, трегалоза (фирмы «Merck», Германия). Целлюлозоацетатные мембраны (3 и 10 кДа) фирмы «Millipore» (США). Красители: толуидиновый синий, этидиумбромид, бромфеноловый синий, Кумасси G-250, феноловый красный - коммерческие препараты фирмы «Sigma» (США).
Носители для ионообменной хроматографии: CM-MacroPrep, DEAE-MacroPrep («Bio-Rad», США), DEAE-Sepharose («GE Healthcare», США). Носители для гель-проникающей хроматографии Shephacryl S-100, гидрофобной хроматографии Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow («Sigma», США). Анионообменные колонки «Source Q 15» и «Mono Q», картридж для аффинной хроматографии «HisTrap FF Crude» (5 мл) фирмы «GE Healthcare» (США). Колонка для гель-проникающей хроматографии TSK-Gel G2000 SW (7,5 ммхЗОО мм) и TSK-Gel G4000 SW (7,5 ммхЗОО мм) фирмы «Tosoh Bioscience» (Япония). Картридж для гель-проникающей хроматографии «Bio-Scale mini», Bio-gel Р-6 (10 мл) фирмы «Bio-Rad» (США).
ДНК-Полимераза «Phusion High-Fidelity» (2000 ед./мл), буфер для ДНК-полимеразы «Phusion High-Fidelity» (5х), диметилсульфоксид (ДМСО, 100 %), смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дГДТФ, дТТФ по 10 мМ), рестриктаза Dpnl (20 000 ед./мл) - фирмы «New England Biolabs» (США).
Набор для выделения геномной ДНК бактерий «GenElut Bacterial Genomic DNA Kit» («Sigma», США), TEV-протеаза («Sigma», США), набор для выделения плазмидной ДНК («Promega», США), маркеры молекулярных масс ДНК «Perfect Size» 1000-10 000 п.н.о. («Novagen», США), набор для выделения продуктов ПЦР («Quagen», США).
Компетентные штаммы бактерий Е. coli: Rosetta-gami (DE3)pLysS, BL21 star (DE3)pLysS, BL21 (DE3)GroEL фирмы «Invitrogen» (США), XL 10-Gold («Stratagene», США). Субстраты КМ-целлюлоза, амилопектин, фукоидан из F. vesiculosus, я-нитрофенил-а-Б-галактопиранозид, -нитрофенил-Р-Б-галактопиранозид, я-нитрофенил-Р-Б-глюкопиранозид, -нитрофенил-ІЧ-ацетил-Р-О-глюкозаминид, -нитрофенил-а-Б-маннопиранозид, -нитрофенил-а-Ь-фукопиранозид, w-нитрофенилсульфат - препараты фирмы «Sigma». Полигулуроновая кислота производства фирмы «Merck». Ламинаран из S. cichorioides, пустулан из лишайника Umbellicaria russica, а также фукоиданы бурых водорослей F. evanescens, S. cichorioides, U. pinnatifida получены по методам, описанным или процетированным в работе [206]. Биологическое сырье
Морской моллюск Lambis sp. собран в прибрежной зоне Социалистической Республики Вьетнам в Южно-Китайском море, в сентябре 2011 года.
Выделение штаммов бактерий из образцов тканей бурых водорослей, а также определение их таксономического положения было выполнено сотрудниками лаборатории микробиологии по методам, описанным ранее [207]. В настоящее время штаммы хранятся в Коллекции морских микроорганизмов (КММ) ТИБОХ ДВО РАН.
Микроорганизмы выращивали на питательной среде рН 7,5-7,8 (морская вода: дистиллированная вода 1:1), содержащей 0,5 %-ый бакто-пептон (фирмы «Difco»,CIIIA), 0,1 %-ый дрожжевой глюкан, 0,02 %-ый К2НР04; 0,005 %-ый MgS04; морская вода 50 %, дистиллированная вода 50 % (среда А), на термостатированной качалке (160 об/мин) при 28С в течение 24 ч. Для первичного направленного поиска продуцентов фукоиданаз в жидкую питательную среду А добавляли 0,1 % глюкозы.
Для исследования динамики роста бактерий и биосинтеза фукоиданаз посевной материал F. algae КММ 3553Т выращивали в колбах объемом 250 см , содержащих 100 мл питательной среды А с добавлением одного из компонентов: 0,1 % глюкозы, 0,1 % трегалозы, 0,1 % ксилозы, 0,1 % ламинарана, 0,1 % фукоидана из F. evanescens, 0,1 % альгината натрия в течение 24 ч при температуре 25С на качалке со скоростью вращения 160 об/мин. Затем биомассу отделяли центрифугированием при 6000 g в течение 40 мин. Полученный осадок взвешивали.
Для определения активности внутриклеточных фукоиданаз 1 г бактериальной массы суспендировали в 3 мл 0,015 М Na-фосфатного буфера, рН 7,2, подвергали ультразвуковому дезинтегрированию и центрифугировали при 10 000 g в течение 40 мин. Активность фукоиданаз устанавливали методом ПААГ-электрофореза [36]. В культуральной жидкости определяли содержание белка, активность фукоиданаз, содержание восстанавливающих Сахаров [81] и общих Сахаров [208]. Определение концентрации белка
Концентрацию белка в растворах определяли по методу Брэдфорд [209]. Во время хроматографии - по поглощению при 280 нм. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Определение восстанавливающих Сахаров
Восстанавливающие сахара определяли по методу Нельсона [81]. К аликвоте исследуемого раствора (0,25 мл) добавляли 0,25 мл смеси реагентов А и В (25:1). Затем пробы нагревали 15 мин на водяной бане, после охлаждения до комнатной температуры добавляли 0,25 мл реагента С, смесь встряхивали и, по окончании выделения углекислого газа, приливали 2,5 мл дистиллированной воды. Измеряли поглощение окрашенных растворов при длине волны 750 нм на спектрофотометре BioTek (США) относительно соответствующих контролей. Концентрацию восстанавливающих Сахаров определяли по калибровочным кривым, используя в качестве стандартов фукозу (для анализа фукоиданазной активности), глюкозу, ксилозу (для анализа изменений восстанавливающей способности жидкой питательной среды в процессе роста бактерий) или гулуроновую кислоту (для анализа альгинолитической активности).
