Содержание к диссертации
Введение
1. Фитоэкдистероиды 14
1.1. Химическая природа фитоэкдистероидов 14
1.2. Распространение экдистероидов в мире растений 16
1.3. Фитоэкдистероиды видов семейства Caryophyllaceae 20
1.4. Распределение экдистероидов в растениях 51
1.5. Предполагаемые роли фитоэкдистероидов 58
2. Поиск новых экдистероидсодержащих видов семейства caryophyllaceae и установление химического состава экдистероидов перспективных видов 63
2.1. Скрининг видов семейства Caryophyllaceae на присутствие экдистероидов 63
2.1.1. Скрининг экстрактов семян растений хроматоспектрофотометрическим методом 64
2.1.2. Радиоиммунный анализ экстрактов растений 74
2.2.. Изучение химического состава экдистероидов некоторых видов семейства Caryophyllaceae 84
2.2.1. Выделение и идентификация экдистероидов видов рода Lychnis L. 85
2.2.2. Выделение и идентификация экдистероидов Silene linicola и Silene viridiflora 91
2.2.3. Идентификация экдистероидов некоторых видов рода Silene методом ВЭЖХ 97
2.2.4. Выделение и разделение экдистероидов Silene radicosa, Silene regia и Silenepseudotites 103
2.2.5. Идентификация экдистероидов, изолированных из Silenepseudotites, S.radicosa и S.regia 107
3. Фотохимические и хемотаксономические аспекты изучения экдистероидов родов lychnis и silene (caryophyllaceae) 125
3.1. Хемотаксономическое значение фитоэкдистероидов при изучении рода Silene 125
3.2. Распределение экдистероидов в процессе развития видов Caryophyllaceae 138
3.2.1. Динамика содержания экдистероидов в однолетних видах Silene 139
3.2.2. Динамика содержания экдистероидов в многолетних видах Silene, Lychnis в процессе развития 149
3.2.3. Изменение содержания экдистероидов в зависимости от возраста растений семейства Caryophyllaceae 158
4. Биологическая активность некоторых видов caryophyllaceae 164
4.1. Радиопротекторная активность экстракта Lychnis chalcedonica и изолированного из его надземной части экдистерона 164
4.2. Фунгистатическое действие Lychnis chalcedonica 165
4.2.1. Влияние экстрагента на фунгистатическую активность экстрактов Lychnis chalcedonica 165
4.2.2. Выявление группы биологически активных веществ и индивидуальных соединений, обладающих фунгистатическим действием 167
4.3. Гемореологическая активность некоторых видов Silene и Lychnis 170
4.4. Оценка противоопухолевых свойств некоторых видов семейства Caryophyllaceae 176
5. Экспериментальная часть 179
5.1. Методы качественного и количественного определения экдистероидов 179
5.1.1. Хроматографические методы 179
5.1.2. Метод радиоиммунного анализа 181
5.1.3. Биотест на присутствие агонистов и антагонистов экдистероидов 182
5.2. Выделение и разделение экдистероидов из видов Silene и Lychnis 183
5.2.1. Выделение и разделение экдистероидов из видов Lychnis 183
5.2.2. Выделение и разделение экдистероидов из видов Silene 185
5.3. Идентификация выделенных экдистероидов 190
Основные результаты и выводы 212
- Распространение экдистероидов в мире растений
- Распределение экдистероидов в растениях
- Изучение химического состава экдистероидов некоторых видов семейства Caryophyllaceae
- Идентификация экдистероидов, изолированных из Silenepseudotites, S.radicosa и S.regia
Введение к работе
Актуальность темы. Среди разнообразных низкомолекулярных физиологически активных веществ, синтезируемых растениями, заметное место занимают экдистероиды.. Являясь структурными аналогами гормонов линьки и метаморфоза насекомых, эти соединения широко распространены в растительном мире. Исследования последних лет свидетельствуют о существовании двух главных гипотез в отношении значения экдистероидов в онтогенезе растений: защитной и гормональной. Наиболее убедительные доказательства приводятся в пользу детеррентной функции при взаимодействии с неадаптированными беспозвоночными фитофагами, однако получены данные, указывающие на выполнение ими физиологической роли в онтогенезе растительного организма.
К настоящему времени выделено более 250 экдистероидов из объектов растительного и животного мира. По своему химическому строению экдистероиды представляют собой полигидроксилированные стерины с характерными особенностями структуры: цис- сочленив А/В циклов, наличие 14<х-гидрокси-Д7-6-кетонной группировки и нескольких гидроксильных групп как в стероидной части, так и боковой цепи молекулы.
Фитоэкдистероиды в практическом плане являются основой мощных препаратов анаболического, адаптогенного, тонизирующего и других действий (экдистен, Cytodyne, Ecdybol, Power Health, Macamor, Z-mass и др.). Растительные объекты по содержанию и разнообразию химических структур экдистероидов являются предпочтительными источниками для получения чистых соединений, а также различных субстанций, их содержащих.
К настоящему времени стало известно, что Caryophyllaceae является одним из богатых экдистероидсодержащих семейств и характеризуется большим разнообразием химических структур экдистероидов. Вероятность
нахождения новых источников и новых стероидных соединений в нем весьма велика.
Актуальной задачей современной биоорганической химии является изучение распространения фитоэкдистероидов в мировой флоре, поиск их новых и доступных источников, исследование химического состава.
Цель работы. Поиск доступных и перспективных в химическом
отношении экдистероидсодержащих растений семейства Caryophyllaceae,
способных служить основой для создания препаратов анаболического,
радиопротекторного, противоопухолевого, антифунгального и
гемореологического действия.
Задачи исследования:
- разработать быстрый способ обнаружения и количественного
определения фитоэкдистероидов в растительных объектах;
- изучить их распространение в семействе Caryophyllaceae;
выявить наиболее перспективную по содержанию и составу экдистероидов группу растений;
исследовать химический состав экдистероидов в перспективных видах Caryophyllaceae;
выявить закономерности распределения экдистероидов в процессе развития, влияния интродукции и систематического положения видов родов Silene, Lychnis;
определить биологическую активность экстрактов экдистероидсодержащих растений, выделенных фракций и индивидуальных фитоэкдистероидов. Положения, выносимые на защиту:
Разработанная стратегия скрининга позволяет прогнозировать присутствие/отсутствие фитоэкдистероидов в растениях на основе предварительного хроматографического анализа семян.
Род Silene - богатейший экдистероидсодержащий род мировой флоры.
3. Физиологически активные вещества Lychnis chalcedonica - основа
для создания эффективных препаратов антифунгального,
радиопротекторного, противоопухолевого и гемореологического действия.
Научная новизна. Разработана стратегия скрининга флоры на присутствие экдистероидов на основании предварительного хроматографического анализа семян, позволяющая сделать заключение о способности растений их синтезировать. Это способствует крупномасштабному изучению распространения экдистероидов в мировой флоре. Проанализировано более 400 видов порядка CaryophyHales, включая 266 видов семейства Caryophyllaceae, принадлежащих 28 родам. Достоверность результатов по выявлению экдистероидсодержащих видов подтверждена радиоиммунным анализом (РИА), биотестированием на культурах клеток Drosophila melanogaster, а также высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Обнаружено 95 новых экдистероидсодержащих видов сем. Caryophyllaceae, включая 8 видов рода Lychnis L. и 75 видов Silene L., 4 вида Sagina L.t 2 вида Saponaria ., 2 вида Petrocoptis A.Braun, 1 вид Dianthus L. и З вида Melandrium Roehl. Впервые роды Melandrium, Petrocoptis предложены в качестве источников экдистероидов..
Впервые определен химический состав экдистероидов 14 видов семейства Caryophyllaceae: Lychnis chalcedonica L, L.wilfordii (Regei) Maxim.» Silene antirrhina L., S.chlorifolia Sm., S.cretica L., S.disticha Willd., S.echinata Otth in DC, S.italica (L) Pers, S.linicola CC.Gmelin, S.portensis ., S.pseudotites Besser ex Reichenb., S.radicosa Boiss. & Heldr. in Boiss, S.regia Sims, S.viridijlora L. Выделено и идентифицировано 19 известных и 3 новых фитоэкдистероида: 2-дезоксиэкдизон 22(5-В-гликозид, 2-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизон и 2-дезоксиполиподин В ЗР-О-гликозид, химическое строение которых установлено на основании спектральных (ИК-, УФ-, масс-, ЯМР 'Н и ,3С) и ВЭЖХ данных.
Выявлены некоторые закономерности распространения экдистероидов в роде Silene и проведено хемотаксономическое изучение секций этого рода. Изучено распределение экдистероидов в процессе развития 19 видов и оценен вклад органов растений в суммарное количество 20-гидроксиэкдизона.
Впервые выявлены противогрибковая активность экстрактов лихниса халцедонского и изолированных из них фракций флавоноидов, полисахаридов, радиопротекторное действие его этанольного экстракта, а также гемореологическая активность Lychnis chalcedonica, Silene tatarica, S.dioica, S.linicola, S.viridiflora, S.cretica. Установлено, что экдистерон обладает гемореологической и радиопротекторной, а полиподин В антифунгальной активностью. Выявлена противоопухолевая активность экстрактов S.viridiflora, L.chalcedonica.
Практическая значимость. Разработан способ обнаружения фитоэкдистероидов, способствующий быстрому скринингу мировой флоры и надежному прогнозированию наличия их в растениях. Обнаружено 95 новых растительных источников экдистероидов, в том числе 26 видов с высоким содержанием экдистероидов.
Изучено распределение 20-гидроксиэкдизона в процессе развития 19 видов, выявлены органы с наибольшим содержанием (количеством и вкладом в общее количество) экдистероидов и установлены сроки сбора растительного сырья (фазы развития и возраст растений). Показано, что введение экдистероидсодержащих растений в культуру приводит к увеличению уровня экдистероидов в семенах и растениях.
Разработан способ получения средства противогрибкового действия на основе Lychnis chalcedonica. Показано, что спиртовый и водный экстракты, а также индивидуальный полиподин В и фракции, содержащие экдистероиды, флавоноиды и полисахариды, проявляют фунгистатическую активность в отношении поверхностных дерматофитов. Специфическая активность
водного экстракта значительно выше эталонных препаратов синтетического и растительного происхождения.
Показано, что спиртовый экстракт лихниса халцедонского и выделенный из него индивидуальный 20-гидроксиэкдизон обладают противолучевой активностью, заметно увеличивая среднюю продолжительность жизни облученных крыс.
Установлено, что этанольный экстракт Lychnis chalcedonies а также выделенные из него бутанольная, этилацетатная фракции, флавоноиды и 20-гидроксиэкдизон проявляют гемореологическое действие. Разработаны гемореологические средства и способ их получения, защищенные патентами РФ.
В результате проведенных химических и фармакологических исследований открывается возможность создания оригинального комплексного лечебного препарата анаболического, радиопротекторного, противоопухолевого, антифунгального и гемореологического действия на основе Lychnis chalcedonica.
Работа выполнена в фитохимической лаборатории Сибирского ботанического сада (Сиб БС) Томского государственного университета в период с 1986 по 2002 год. Экспериментальная часть по выделению и идентификации экдистероидов проведена в лабораториях фитохимии Сиб БС и химии гликозидов Института химии растительных веществ АН Узбекистана (г.Ташкент) при участии Балтаева У.А. и Саатова 3.
Научные консультации по идентификации и исследованию закономерностей содержания экдистероидов рода Lychnis осуществлялись член-корреспондентом АН Узбекистана, д.х.н. Абубакировым Н.К., за что автор ему очень признателен.
Радиоиммунный анализ, биотесты на агонистическую и антагонистическую активности, проведены совместно с доктором Лоуренсом Дайненом (Эксетерский университет, Великобритания). Установление новых структур экдистероидов, а также ВЭЖХ разделение экстрактов растений
рода Silene осуществлено совместно с профессором Рене Лафоном (Университет Пьера и Марии Кюри, Париж, Франция).
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Сибирского ботанического сада Томского госуниверситета и комплексными исследованиями по теме гранта РФФИ р98сибирь № 98-04-03080 (1998-2000 гг.) и международного проекта INTAS № 96-1291 (1997-2000 гг.). Результаты исследований, являяясь частью комплексной темы, отмечены премией Правительства РФ за 2000 г.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 23 конференциях и симпозиумах: всесоюзных (2), российских (10) и международных (11), в том числе на Всесоюзной конференции «Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока (Томск, 1986, 1989), 8th Danube Symposium on chromatography (Warsaw, 1991), Юбилейной конференции "Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов" (Томск, 1994), Международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды" (Томск, 1995), 10th International Symposium "Advances and applications of Chromatography in Industry" (Bratislava, 1996), 5-м Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998), Всероссийском симпозиуме по теории хроматографии и электрофореза, посвященного 95-летию открытия хроматографии М.С.Цветом (Москва, 1998), 23rd International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques HPLC, 99 (Granada-Spain, 1999), международной научной конференции "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств.,." (Томск, 2000), XIII-XV International Ecdysone Workshop (Jena, Germany - 1998; Rapperswil, Switzerland - 2000; Kolymbari, Greece - 2002).
Благодарности. Автор считает приятным долгом выразить глубокую признательность коллегам и соавторам за неоценимую помощь в осуществлении этой работы: В.И.Ереминой, Н.А.Ивановой, Т.П.Свиридовой, Л.А. Малаховой, П.В.Зибареву, З.Саатову, М.Б.Плотникову, С.Е.Дмитруку, Р.Лафону и Л.Дайнену.
Распространение экдистероидов в мире растений
К настоящему времени известно, что экдистероиды широко распространены в растительном мире. Встречаются они как в низших растениях: водорослях, грибах, что свидетельствует в пользу очень древнего происхождения молекул экдистероидов [5], так и в высших папоротникообразных, голосемянных и покрытосемянных. Одно из первых обширных исследований по скринингу флоры на присутствие экдистероидов было предпринято японскими учеными [10]. Проанализировано 1056 видов, принадлежащих 186 семействам, 738 родам и лишь в 54 видах (что составляет примерно 5.1 % от общего числа) обнаружена активность "гормона линьки". В произвольно выбранных английскими учеными 2200 видах встречаемость экдистероидсодержащих составила 6 % [9]. Сосредоточение поиска на уровне порядка Pteridophyta привело к увеличению вероятности нахождения экдистероидсодержащих видов: из 115 видов, относящихся к 17 семействам, 50 родам, искомые соединения были выявлены в 64 [11], а в другом исследовании [12] из 283 видов (20 семейств, 76 родов) в 170 видах. На ранних этапах изучения фитоэкдистероидов сложилось мнение о большей распространенности их в папоротникообразных (Pteridophyta) и голосемянных (Pinophytd), что обусловлено большей изученностью указанных порядков в тот период времени. Процесс изучения распространенности этих соединений в мировой флоре продолжается, и на данный момент выяснилось, что они особенно часто встречаются в покрытосемянных {Magnoliophyta). Лафон [5], проанализировав распределение экдистероидов в соответствии с числом атомов углерода (табл. 1.1), пришел к заключению, что красные водоросли синтезируют только 27С, в то время как наиболее высоко организованные покрытосемянные растения - разнообразные экдистероиды с 19С, 21С, 24С, 27С, 28С, 29С, 30С, аналогичный вывод сделан нами ранее [13]. В работе Stebbins [14] также проанализировано распространение экдистероидов среди покрытосеменных растений. Долгое время считалось, что не существует корреляций между распространением экдистероидсинтезирующих видов и их филогенетическим положением. В пределах семейства имеются роды как, содержащие экдистероиды, так и не способные их синтезировать.
Наблюдается гетерогенность даже внутри рода, которая хорошо просматривается в многочисленном роде Silene L. [15]. Лафон [5] и Дайнен [9] считают, что, возможно, все растения синтезируют экдистероиды, основанием для такого заключения послужила недавно опубликованная информация о возможности биосинтеза их "отрицательным" видом Zea mays при введении 14С-холестерина [16]. И, вероятно, лишь низкое содержание экдистероидов в некоторых видах, соразмерное с таковым у членистоногих, а также недостаточно чувствительные методы не позволяют выявить эти соединения. Ряд обзоров [17-19, 5] посвящен анализу встречаемости экдистероидов в растениях. В последние годы особенно активно исследуются виды семейств: Amaranthaceae Juss. [20, 21], Caryophyllaceae Juss. [22-29, 15], Chenopodiaceae Vent. [30-33], Gramineae Juss.[34], Ranunculaceae Juss. [35], Solanaceae Juss. [36] и др. Экдистероиды не обнаружены пока в семействах Urticaceae Juss., Cannabaceae Endl, Cruciferae Juss. [9]. В настоящее время выявлены новые роды: Agapdntus L Her. (Alliaceae) [37], Xerophyllum (Melanthiaceae) [38], Limnanthes (Limnanthaceae) [39], Ourisia (Scrophulariaceae) [40], представители которых синтезируют экдистероиды. Как правило, подход к выбору объектов исследования осуществляется тремя путями: 1) произвольно выбранные виды [10-12,17]; 2) виды, принадлежащие одному семейству [23, 32, 35, 36]; 3) таксономически близкие виды к экдистероидсодержащим [8, 15, 24, 25, 28, 29, 37, 40]. Следует заметить, что в силу субъективных факторов при выборе видов для скрининга, вероятность обнаружения растений, способных к синтезу экдистероидов - величина условная. Однако проведение тестирования на уровне семейств, родов, несомненно, повышает ее. Более 30 % экдистероидсодержащих видов обнаружено при поиске их в роде Chenopodium L. [33], более 59 % в p.Silene L.. Как верно заметил Дайнен [9], различные роды и семейства значительно отличаются по числу видов, способных синтезировать экдистероиды. К настоящему времени скринингу подвергнуто несколько тысяч растительных объектов. Нами проанализировано более 400 видов растений. Тестирование такого большого количества видов стало возможно благодаря разработанному нами способу обнаружения экдистероидов в растительных объектах уже на уровне семян [41] (более подробно в гл.И), защищенному патентом РФ. В основу его положены хроматографические методы качественного анализа семян. В результате многочисленных экспериментов нами обоснована возможность прогнозирования синтеза экдистероидов во взрослых растениях по предварительному определению их в плодах, семенах. За короткий период выявлены новые виды и новые роды в семействах Caryophyllaceae, Amaranthaceae. Применение этого способа ускоряет изучение распространения искомых стероидов в мировой флоре и, возможно, приблизит исследователей к решению важной экологической проблемы - выяснению функций экдистероидов в самих растениях. Аналогичная стратегия позже предложена Дайненом [42, 9]. Автором разработана методика качественного анализа экдистероидов с использованием двух экдистероидспецифичных методов радиоиммунного анализа (РИА) и биотестов на агонистическую и антагонистическую активность. Показано, что биотест чувствителен, специфичен, прост и надежен, обеспечивая при этом ответную реакцию, адекватную степени родства экдистероида к рецептору.
Большим преимуществом данной методики является возможность использования малых навесок сырья (семян) 25 мг. Исследователями проанализировано на присутствие экдистероидов более 3000 видов, относящихся к различным семействам: АШасеае, Amaranthaceae, Bladfordiaceae, Chenopodiaceae, Limnanthaceae, Gramineae, Scrophulariaceae, Solanaceae [20, 21, 32-40], выявлены новые роды и виды, выделены новые экдистероиды: 20Е 2(3-В-глюкопиранозид из Xerophyllum tenax Nutt, лимнантозид А и лимнантозид В из Limnanthes douglassi R.Br. Весьма активные исследования ведутся учеными экдистероидной школы, созданной под руководством член-корреспондента АН Узбекистана Н.К.Абубакирова. Впервые ими выявлены экдистероиды в родах Serratula L., Rhaponticum Ludw. {Aster асеаё) [17, 43], Silene L., Dianthus L. {Caryophyllaceae) [22]. Изолирован ряд новых экдистероидов: 24(28)-дегидромакистерон А [43], интегристероны А и В [43], рапистерон [44], согдистерон [45] и многие др. 1.3. Фитоэкдистероиды видов семейства Caryophyllaceae Семейство Caryophyllaceae Juss. - Гвоздичные вызывает повышенный интерес ученых в плане изучения физиологически активных соединений. Известно, что для этого семейства характерным признаком является присутствие тритерпеновых гликозидов (сапонинов), кроме того, в химический состав входят алкалоиды, флавоноиды, кумарины [46, 13]. Внимание к сем. Гвоздичных возросло многократно в последние годы в связи с обнаружением гормонов линьки насекомых. Первые сообщения об обнаружении экдистероидов в растениях этого семейства {Gypsophyla perfoliata L., Lychnis chalcedonica L., L.miqueliana Rohrb.) и отсутствии в родах Cucubalus L., Dianthus L., Saponaria L., Silene L. были опубликованы японскими учеными в 1969 году [10], По всей вероятности, негативное заключение по последним родам обусловлено фактором случайности выбора отдельных видов, попавших в поле зрения исследователей, так как, "отрицательные" виды встречаются даже в тех родах, в которых выявлено много экдистероидсодержащих видов (более подробно в разделе 2.2). Семейство Caryophyllaceae включено в порядок Caryophyllales, в который входит по Cronquist 12 семейств [47], а Тахтаджяну - 17 [48]. По последним данным экдистероиды встречаются в нескольких семействах порядка Caryophyllales: Aizoaceae Rudolphi, Chenopodiaceae, Amaranthaceae, Nyctaginaceae Juss., Phytolacaceae R. Br., Cactaceae Juss., Caryophyllaceae (табл. 1.2).
Распределение экдистероидов в растениях
Во всем объеме исследований, посвященных изучению различных аспектов химии фитоэкдистероидов, в последнее время все больше внимания уделяется распределению экдистероидов в органах растений. Освещение этого вопроса способствует опосредованному выяснению функций, выполняемыми этими стероидными соединениями в растениях. Кроме того, анализ их распределения внутри растения в течение вегетационного периода необходим для того, чтобы сопоставить их с наблюдаемыми взаимоотношениями между растениями с одной стороны и насекомыми фитофагами и полезными насекомыми с другой [9]. В органах растений наблюдается градиент концентраций экдистероидов, претерпевающий изменения в онтогенезе. В этом аспекте изучались растения различных родов и семейств. Вересковским с соавторами 0 [137] проведено сравнение содержания 20Е в фазу цветения в органах некоторых видов рода Rhaponticum: Rh. car thammo ides (Willd.) Iljin, Rh.pulchrum Fisch. et Mey, Rh.lyratum С Winkl. ex Iljin , Rh.scariosum Lam. и установлено, что максимальное его количество накапливается в плодах и наименьшее в стеблях. Показано, что листья и корни этих видов имеют наибольшие значения в период вегетации и бутонизации. Следует отметить, что даже внутри одного рода характер изменения концентраций экдистероидов неодинаков. Данные работы Якубовой с соавторами [138] находятся в некотором противоречии с результатами, приведенными в работе [137]: в корнях дикорастущего на Алтае Rh.carthamoides к концу вегетации наблюдалось увеличение уровня 20Е, тогда как в подземных органах интродуцированных растений в Белоруссии происходит постепенное снижение этого показателя. Видимо, это объясняется различными условиями произрастания. В работе Свиридовой с соавторами Ф [139] проведено сравнение уровней экдистерона в видах, интродуцированных в Сибирском ботаническом саду: Rh.carthamoides, Rh.chamarense Peschkova, Rh.lyratum, Rh.scariosum, Rh.cynaroides Less., исследована динамика содержания 20E в двух первых видах. Показано, что максимальный уровень для листьев наблюдался в начале вегетации. Наибольшие значения искомого соединения зафиксированы в плодах, в корнях поддерживался примерно одинаковый уровень в течение всего вегетационного процесса в пределах 0.29-0.36 для Rh.carthamoides и 0.51- 0.58 % для Rh.chamarense, минимальные - в бутонизацию и цветение соответственно.
В литературе имеются сведения, что концентрации и даже качественный состав экдистероидов подвержены весьма существенным колебаниям в зависимости от места и времени сбора растений. Так Silene brachuica, произрастающая в Киргизии содержит 20Е, полиподин В, интегристерон А, витикостерон Е, силенеозиды А, В, С, Д, 22-сульфат-а- экдизон, а образец этого же вида из Узбекистана - 20Е, 2-дезокси- производные экдизона и 20Е, интегристерон А, силенеозиды А, В, С, Е, 2- дезокси-20Е-20,22-моноацетонид, 2-дезоксиэкдизон-22-ацетат [22]. Вариабильность химического профиля экдистероидов наблюдалась в образцах Serratula coronata L. разного происхождения: растения, собранные в Узбекистане, содержали 20Е, витикостерон Е и экдизон [45, 140]; выращенные в Республике Коми - 20Е, экдизон, 258-инокостерон, макистерон А, макистерон С, аюгастерон С и дакрихайнанстерон [141], в то время как в дикорастущих в Башкирии обнаружены 20Е, экдизон, полиподин В, аюгастерон С, 22-О-ацетил-20Е, 22-дезокси-20Е и новый фитоэкдистероид - коронатастерон [142]. Володин с соавторами [143] исследовали связь между распределением 20Е в системе целого растения и биологическими особенностями видов Serratula coronata, Rhaponticum carthamoides, Ajuga reptans L. При раздельном изучении вегетативных и генеративных побегов Rhaponticum carthamoides установлено, что в первых - наибольшее количество содержится в неразвернутых листьях, и уменьшается этот показатель в процессе развития (развертывания) листа. В генеративных побегах отмечено большое содержание в цветочных корзинках, сохраняющееся постоянным независимо от фазы развития. Показано, что в молодых листьях (верхних стеблевых) уровень 20Е выше, чем в более старых (средних и нижних стеблевых). Максимальное содержание наблюдалось в семенах. Увеличивается содержание 20Е в корнях в период от 30 до 77 дней. Характер распределения определяется биологическими особенностями видов и отражает возможную стратегию защиты жизненно важных органов растений от фитофагов.
Холодова с соавторами [144] представили результаты количественного определения 20Е и интегристерона А в цветочных корзинках и листьях Serratula xeranthemoides Bieb. и отметили, что соцветия содержали больше искомых соединений, чем листья. Анализируя данные о распределении 20Е в органах S.coronata, Ревина с соавторами [145] подчеркнули, что в фазу цветения максимальное количество наблюдалось в листьях (1.7 %) и несколько меньшее в бутонах, цветках и плодах (1.2; 1.3 и 1.5 % соответственно). Другие исследователи предприняли более детальное изучение распределения экдистероидов в процессе развития этого вида [143, 146]. Замечено, что у генеративных растений в фазах начала вегетации и бутонизации наблюдается плавное увеличение концентрации экдистероидов в направлении от нижних стеблевых листьев к апикальным. А при переходе растений к цветению плавный ход нарушается. Происходит как бы перераспределение 20Е между листьями: содержание в апикальных резко падает, тогда, как во взрослых центральных, дающих ветвление метамерах, оно сохраняется на высоком уровне до цветения бокового побега. Подтверждается заключение, сделанное Bergamasco и Horn [18] о необходимости экдистероидов растениям в молодом возрасте, в периоды интенсивного роста и формирования репродуктивных органов. Имеются сведения о различном содержании 20Е в органах другого вида этого рода Serratula inermis Gilib [7]: в соцветиях - 2 % , листьях - 0.25 и стеблях-0.01. Показано, что в корнях Ajuga iva 20Е (0.22 %) и циастерона (0.13 %) накапливается больше, чем в листьях (0.05 и 0,04 %) [147]. Содержание же макистерона А оказалось больше в стеблях (0.06 %) и меньше в корнях (0,03 %). Володиным установлено, что распределение экдистероидов в Ajuga reptans определяется биоморфологическими особенностями растений, наиболее важными из которых являются способность к образованию плагиотропных побегов и наличие зимнезеленых листьев [148]. Показано, что максимальное количество экдистероидов содержится в зимнезеленых листьях, которые являются запасающими органами, и сохраняется постоянным в течение зимнего покоя. Во время бутонизации и цветения содержание 20Е в листьях и соцветиях находится на одном уровне.
Изучение химического состава экдистероидов некоторых видов семейства Caryophyllaceae
Выявление большого количества новых источников фитоэкдистероидов в процессе поиска искомых соединений различными подтверждающими друг друга методами: химическим, радиоиммунным и биотестированием вселяет большую уверенность в результатах скрининга и расширяет горизонты их изучения. Однако окончательное утверждение о присутствии экдистероидов в том или ином растении более правомерно, когда они изолированы, получены их спектры, определены различные физико-химические свойства, на основе которых установлены химические структуры выделенных соединений. Скрининг мировой флоры способствует выявлению новых продуцентов фитоэкдистероидов и тем самым ускоряет такие исследования. Разработав быстрый способ обнаружения этих соединений в растительных объектах, выявив новые экдистероидсодержащие роды и виды, мы поставили перед собой задачу - подтвердить возможности данной стратегии выявления источников экдистероидов изучением качественного состава новых видов, выделяя эти биологически активные соединения и устанавливая их химические структуры. Проведенные химические исследования будут использованы нами при интерпретации хемотаксономического изучения родов Lychnis и Silene. В качестве объектов исследования химического состава выбраны виды родов Lychnis и Silene, в которых впервые обнаружены экдистероиды, интродуцированные в Сибирском ботаническом саду и обеспеченные растительным сырьем: Silene antirrhina, S.chlorifolia, S.cretica, S.disticha, S.echinata, S.italica, S.linicola, S.portensis, S.pseudotites, S.radicosa и Lychnis wilfordii (единственный дикорастущий вид, собранный на Дальнем Востоке). Lychnis chalcedonica также включен в число объектов настоящего изучения ввиду того, что результаты биотестирования, проведенного ранее [114], необходимо подтвердить химическими методами и исследовать состав экдистероидов. 2.2.1. Выделение и идентификация экдистероидов видов рода Lychnis В настоящее время экдистероиды обнаружены в 13 видах Lychnis из 35 видов этого рода [169], в 8 из них (L.arkwrigti, L.cognata, L.flos-jovis, L.haageana, L.sibirica, L.villosula, L.wilfordii, L.kuisiana) впервые выявлено нами присутствие этих стероидов [13, 24]. Выделение экдистероидов из надземной части Lychnis chalcedonica и L.wilfordii проводили по схеме, изображенной на рисунке 2.1. Растительное сырье (15 кг и 0.4 кг соответственно) экстрагировали метанолом на технологической установке Института химии растительных веществ (ИХРВ) (г. Ташкент). Затем концентрированный метанольный экстракт разбавляли водой, фильтровали. Фильтрат от липофильных веществ очищали гексаном. Экдистероиды многократно извлекали н-бутиловым спиртом.
Из объединенных бутанольных фракций удалили экстрагент, выход экстрактивных веществ из L. chalcedonica составил 1.6 %. На хроматограмме в тонком слое бутанольная фракция представляла собой совокупность плохо разделенных пятен. На фоне эталонов можно было различить наличие пяти экдистероидов, из которых два на уровне 20-гидроксиэкдизона и полиподина В в значительных количествах проявлялись реактивом обнаружения - 3 % раствором ванилина в этиловом спирте с добавлением H2SO4. Концентированный бутанольный экстракт растворяли в системе растворителей хлороформ-метанол в соотношении 4:1. На хроматограмме в тонком слое обильно выпавшего осадка проявлялся в большом количестве полярный флавоноид, который присутствовал и в фильтрате. При хроматографировании фильтрата на колонке с окисью алюминия последний был адсорбирован. Разделение обогащенных экдистероидами фракций многократно осуществляли колоночной адсорбционной хроматографией на силикагеле. Элюировали соединения системами хлороформ - метанол в соотношениях 15:1; 9:1; 7:1; 4:1; 2:1. В результате многократного хроматографического разделения и перекристаллизации из Lychnis chalcedonica было выделено 7 индивидуальных экдистероидов (таблица 2.7). Выделение экдистероидов из надземной части L.wilfordii проводили по указанной схеме, приведенной на рисунке 2.1. Экдистероидсодержащая фракция на ТСХ представлена рядом пятен. В сравнении с эталонными образцами предварительно идентифицированы мажорные компоненты - 20-гидроксиэкдизон и полиподин В, которые впоследствии изолированы и идентифицированы на основании спектральных данных. В надземной части L.wilfordii выявлено 5 экдистероидов: 20-гидроксиэкдизон, полиподин В, экдизон, 24(28)-дегидромакистерон А и интегристерон А. В таблице 2.7 приведены физико-химические характеристики фитоэкдистероидов, выделенных из исследуемых видов Lychnis. Наблюдалось хорошее совпадение экспериментальных спектральных данных и физико-химических характеристик выделенных экдистероидов с литературными [43,165, 170-178]. Выделенные соединения оказались известными: витикостерон Е (25-0- ацетилэкдистерон), впервые изолирован из Vitex megapotamica [175], интегристерон А - из цветочных корзинок Rhaponticum integrifolium [43] и часто встречается в растениях семейств Caryophyllaceae, Asteraceae, 24(28)- дегидромакистерон А - из Rhaponticum carthamoid.es [43], стахистерон Д - из Stachyurus ргаесох [176], Blechnum nipponicum [177] nAiuga nipponensis [178] под названием шидастерон. На рисунке 2.2 изображены структуры экдистероидов, выделенных из Lychnis chalcedonica и L.wilfordii.
В этих структурах установлено наличие дополнительных гидроксильных групп в стероидной части молекулы по сравнению с 20-гидроксиэкдизоном - в полиподине В в 5р-положении, интегристероне А при С-1 и в боковой цепи - в 24(28)-дегидромакистероне А имеется дополнительная метиленовая группа, связанная с С-24, в витикостероне Е присутствует при С-25 ацетильная группа. Стахистерон Д имеет оригинальную структуру - его боковая цепь содержит тетрагидрофурановый цикл. Таким образом, из надземной части Lychnis chalcedonica изолировано 7 соединений, принадлежащих к 27С, 28С и 29С- экдистероидам. Интерес представляет их состав: распространенные в животном и растительном мире 20-гидроксиэкдизон и экдизон, часто встречающиеся в растениях -полиподин В, витикостерон Е, интегристерон А и довольно редкие и не обнаруженные ранее в семействе Caryophyllaceae - 24(28)-дегидромакистерон А и стахистерон Д. Японские исследователи [114] сообщали об обнаружении в этом виде наряду с экдистероном птеростерона. В процессе изучения химического состава интродуцированного Lychnis chalcedonica птеростерон нами не обнаружен. 2.2.2. Выделение и идентификация экдистероидов Silene linicola и Silene viridiflora Род Silene признан хорошим источником новых экдистероидных аналогов [15, 17, 22, 29]. Экдистероиды обнаружены нами в 115 видах этого рода, включая 75 видов, выявленных впервые. В связи с высокой степенью обнаружения экдистероидов (59 %) род Silene является удобной моделью для изучения распространения экдистероидов внутри рода. К настоящему времени химический состав этих соединений определен в 23 видах Silene, включая 12 видов, исследованных нами. Экдистероидный профиль определен нами в следующих видах: Silene antirrhina, S.chlolirifolia, S.cretica, S.disticha, S.echinata, S.italica, S.linicola, S.portensis, S.pseudotites, S.radicosa, S.regia, S.viridijlora. Впервые экдистероиды в этих видах растений выявлены нами [28, 29, 15] разработанным способом обнаружения в семенах [41], в последствие эти данные были подтверждены радиоиммунным анализом (таблица 2.4). Выделение экдистероидов из надземной части Silene linicola (3 кг) осуществлено по схеме, представленной на Рис. 2.1. В качестве экстрагентов экдистероидов использовали этилацетат и бутиловый спирт. В результате хроматографического разделения этилацетатной фракции вначале на колонке с окисью алюминия, а затем с силикагелем были изолированы следующие экдистероиды: при элюировании системой хлороформ-метанол в соотношении 15:1 - витикостерон Е 1, 2-дезоксиэкдистерон 2, более полярной системой (9:1)-экдизон 3, полиподин В 4, экдистерон 5. Хроматографирование бутанольной фракции на силикагеле и элюирование системой хлороформ-метанол (4:1) позволило выделить полярные экдистероиды - туркестерон 6 и интегристерон А 7 (Рис. 2.3).
Идентификация экдистероидов, изолированных из Silenepseudotites, S.radicosa и S.regia
Экдистероиды, выделенные из экстрактов S.pseudotites, S.radicosa и S.regia были идентифицированы методами УФ-, ЯМР Н и ,3С, масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографией в сравнении с эталонами. Из надземной части Silene pseudotites, было изолировано 12 стероидных соединений, а выявлено 14, два из которых в следовых количествах - 258-инокостерон и понастерон А (табл. 2.13). Структуры изображены на рисунке 2.8. Ввиду того, что экдистероиды в S.pseudotites обнаружены впервые, и их состав оказался богатым и разнообразным, проведено более подробное изучение структур. 20-гидроксиэкдизон 1 является аморфным веществом. Предварительно принадлежность этого соединения к экдистероидам определена на основании УФ-спектра. Интенсивная полоса с максимумом поглощения при X = 243 нм, обусловлена присутствием а,Р-ненасыщенной кетогруппировки. Данные ЯМР Н спектра совпадают с литературными [22, 24, 45, 73, 171], полученными для экдистерона, выделенного из Rhaponticwn carthamoides, Serratula coronata, Lychnis chalcedonica. Кроме того, совместным введением с эталоном при использовании ВЭЖХ была подтверждена идентичность экдистероида 1 20-гидроксиэкдизону. Полиподин В 2 - аморфное вещество. Идентифицирован на основе физико-химических характеристик и данных УФ-, ИК-, масс- и ЯМР Н спектров. Сравнение химических сдвигов исследуемого экдистероида с литературными данными [172-174, 24] показало, что наблюдается хорошее совпадение значений сигналов и, следовательно, соединение является полиподином В с ОН-группой в положении 5р. Инокостерон 3. Вследствие того, что соединение 3 обнаружено в следовых количествах его идентификация была проведена сравнением времен удерживания со стандартным образцом методом ВЭЖХ как на обращенно-фазовой аналитической колонке с Qg, так и нормально-фазовой -Apex II диол, а также сопоставлением ЯМР Н спектров с опубликованными ранее [180]. Экдизон 4 - аморфное вещество. В УФ-спектре обнаружена характерная для экдистероидов интенсивная полоса поглощения при X = 242 нм. Хроматографическое поведение (ВЭЖХ) соединения 4, введенного совместно с эталоном, позволило предположить, что оно является экдизоном.
В масс-спектре имеется слабый пик молекулярного иона с m/z 464 [М]+ Данные ЯМР Н и 13С совпадают с приведенными в работах [45, 180] для экдизона. Значения химических сдвигов ангулярной метильной группы 18-СНз 0.74 м.д. и третичной метильной группы 21-СН3 при 1.24 м.д. в ЯМР Н спектре указывает на отсутствие 20-ОН группы. На основе совокупности экспериментальных данных соединение 4 идентифицировано как экдизон. 2-Дезоксиэкдизон 5 является аморфным соединением. Совместное хроматографирование ВЭЖХ с эталоном позволило предположить, что соединение 5 является 2-дезоксиэкдизоном. Использование способа отрицательных ионов в масс-спектрометрии, где в качестве матрицы применен глицерин, показало, что в спектре проявился ион с m/z 447 [М-Н]", а также фрагмент с m/z 429 [М-Н-Н20]\ Сравнение характера фрагментации соединений 4 и 5 свидетельствует об идентичности их боковых цепей и присутствии в стероидном ядре последнего лишь двух окси-групп. Из масс-спектра следует, что молекулярная масса соединения 5 - 448. Кроме того, наблюдалось хорошее совпадение спектральных данных ЯМР Н и 13С с опубликованными ранее [180] для 2-дезоксиэкдизона. Таким образом, соединение 5 идентифицировано как 2-дезоксиэкдизон. 2-Дезокси-20-гидроксиэкдизон 6. Аналогично при применении указанного набора методов и совместного хроматографирования (ВЭЖХ) со стандартным образцом было идентифицировано соединение 6 как 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон. В масс-спектре (способ отрицательных ионов, глицерин) обнаружены фрагменты с m/z 463 [М-Н]" и 445 [М-Н-НгО]", отнесенного к иону, образованному при отщеплении от него одной молекулы воды. Отсутствие сигнала протонов при С-2 и уширение при С-3 указывает на 2-дезокси - производное 20-гидроксиэкдизона. Совпадение спектральных данных с литературными [180] подтвердило сделанные выводы относительно структуры соединения 6 как 2-дезокси-20-гидроксиэкдизона. 2-Дезокси-20,26-дигидроксиэкдизон 7. В масс-спектре (химическая ионизация, ЫНз) проявились следующие пики: с m/z 498, отвечающий иону [M+H+NH3]+, 481 [М+Н]+, а также с m/z 480, соответствующий молекулярному [М]+ и дегидратационным ионам 463 [М+Н-Н20]+ и 445 [М+Н-2 Н20]+ (Рис. 2.9). В ЯМР !Н спектре (D20) присутствуют типичные особенности как 2-дезокси-, так и 20,26-дигидрокси экдистероидов (Рис. 2.10, табл. 2.14). На основании химических сдвигов сигналов ангулярных 18- и 19-метильных групп, а также метальных групп боковой цепи сделан вывод о структуре циклической части стероида с двумя окси-группами. Сигнал 5 0.863 м.д. (синглет) отвечает одной из ангулярных метильных групп 18-СНз, а б 0.976 м.д. (синглет) соответствует 19-СНз и свидетельствует о том, что структура стероидного ядра подобна таковым 2-дезокси-20Е, 2- дезоксиэкдизона.
При сравнении ЯМР Н спектров 2-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизона 7 и 20,26-дигидроксиэкдизона [23] наблюдается хорошее совпадение положения большинства протонов, однако в соединении 7 отсутствует сигнал Н-2 при 3.99 м.д. (табл. 2.14), и наблюдается уширение сигнала Н-3 (wi/2 = 20 Гц), что является следствием отсутствия гидроксильной группы при С-2. В спектре исследуемого стероида 7 наблюдается смещение сигнала СНз -18 в слабое поле, а СНз -21 в сильное поле по сравнению с химическими сдвигами в спектре 22-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизона [23], что объясняется отсутствием ОН-группы при С-22 в последнем соединении. Для 26-гидроксиэкдистероидов характерно появление -СНг-ОН сигнала в виде синглета при 5 = 3,45 м.д. Таким образом, для соединения 7 предложена структура 2-дезокси-20,26-дигидроксиэкдизона, выделенного впервые . количествах, является понастероном А, структура которого подобна 20-гидроксиэкдизону при отсутствии ОН-группы при С-25. Сидистерон 9 - аморфное соединение. В ИК-спектре проявились полосы v (cm"1) 1749 (у-лактон), 1643 (а,р-ненасыщенная кетогруппировка), которая в УФ-спектре наблюдалась при A.max (logs): 240 нм, (4.12). Проведено совместное хроматографирование исследуемого образца с предполагаемым эталоном методом ВЭЖХ. Хроматографическое поведение соединения 9 подобно стандартному образцу, что косвенно доказывает их идентичность. В масс-спектрах (химическая ионизация) проявились пики с m/z 434, соответствующие фрагменту [M+H+NH3]+ ,417 [М+Н]+, молекулярному иону 416 [М]+ и дегидратационному иону 399 [М+Н-Н20]+. Сравнение ЯМР Н и ,3С спектров исследуемого соединения 9 и 20Е показало, что химические сдвиги СН3-19 при 5 0.98 м.д., Н-2, Н-3 и Н-7 хорошо совпадают. Однако сдвиг сигналов СН3-18 (8 0.74 м.д.) в сильное поле, протонов при Н-12, Н-17 (5 2.19 и 2.70 м.д соответственно) и СН3-21 (1.57 м.д.) в слабое поле и отсутствие сигналов СН3-26/27 групп свидетельствуют об идентичности стероидных частей молекул и укороченной боковой цепи соединения 9. Наблюдается сходство его ЯМР-спектров с характеристиками, приведенными ранее в работах [34, 181] и предполагаемого эталона. Соединение 9 идентифицировано как сидистерон, выделенный ранее из растений Silene dioica, Silene otites (Caryophyllaceae) [181], Briza maxima (Gramineae) [34]. 2-Дезоксиэкдизон 22(3-Р-гликозид 10 . Весьма характерным для рода Silene является частая встречаемость гликозидов. Так например, обнаружен ряд гликозидов - силенеозиды А, В, С, D, Е в S.brachuica [53-57], S.nutans, S.scabrifolia, S.supina, S.viridiflora [128], S.otites - 25-гликозид 20E [23], Melandrium turkestanica - меландриозид, силенеозиды A, D [119]. Наличие в растениях гликозидных соединений экдистероидов является свидетельством их активной роли в метаболических процессах [17].
