Введение к работе
Актуальность работы. Одной из основных задач социально-экономического развития страны является обеспечение населения высококачественными веществами лекарственного и пищевого назначения.
Учитывая тенденцию роста численности населения , увеличения потребления лекарственных препаратов и необходимость расширения сырьевых источников для производства пищевых добавок, а также реальную ограниченность имеющихся природных ресурсов, задача разработки усовершенствованных методов получения сложных биологически активных веществ пищевого и медицинского назначения является актуальной.
В настоящее время в промышленном и опытно-промышленном масштабе выпускаются многие вещества, выделяемые из природного сырья животного происхождения, однако достижения биотехнологии последнего десятилетия, связанные прежде всего с созданием высокоэффективных процессов получения веществ сложного химического строения на базе селективных хроматографических методов и их сочетания с возможностями мембранной технологии, а также использование достижений генной инженерии, позволяют исследователям разрабатывать технологические процессы получения высо-коочищенных веществ пищевого , медицинского и микробиологического назначения с достаточно высоким выходом из мало используемых видов сырья.
Учитывая тот факт, что увеличивающаяся потребность в биотехнологической продукции определяет постоянно возрастающие объемы производства и , следовательно, растет количество образующихся отходов, возникает настоятельная потребность в разработке не только эффективных способов получения необходимых веществ, но и в обеспечении использования образующихся отходов, то есть комплексное решение организации производства по максимально замкнутому циклу.
Выбор объектов исследований определялся важностью получения сложных белковых и полисахаридных веществ природного происхождения для практических нужд. Так, гепарин является важнейшим антикоагулянтом крови, производство которого традиционно осуществлялось в нашей стране только из животного сырья пищевого назначения (легких крупного рогатого скота). Использование электрохимических свойств гепарина в условиях ионного обмена на синтетических ионитах
предопределяет возможность разработки высокоэффективной ионообменной технологии получения гепарина и других ценных мукополиса-харидов. Способность генетически модифицированных клеток интенсивно продуцировать некоторые вещества обуславливает выбор в качестве источника получения БАВ генно-инженерных клеточных продуцентов. Использование промышленного штамма-продуцеша ре-комбинантного белка, включающего аминокислотную последовательность инсулина человека, предопределило возможность разработки процесса получения важнейшего антидиабетического препарата - инсулина человека, который необходим для сохранения жизни значительной доли населения, страдающей от заболевания диабетом. Изучение современных биотехнологических процессов с точки зрения уменьшения опасности для окружающей среды требует решения экологических проблем, в том числе утилизации образующихся белковых отходов. В качестве объектов для изучения процессов гидролитической деградации выбраны мало используемые отходы, в том числе боенская кровь, а также остатки животной и микробной клеточной биомассы, остающихся после осуществления процессов вьщеления целевых БАВ.
Цель и задачи работы. Основной целью данной работы было исследование факторов, определяющих взаимосвязь физико-химических и биохимических свойств белков, полисахаридов и продуктов их трансформации, разработка способов их получения из природного и генетически модифицированного сырья для получения БАВ медицинского , микробиологического и пищевого назначения.
В соответствии с целью было необходимо решить следующие задачи:
изучить основные физико-химические процессы, обеспечивающие выделение БАВ белковой и полисахаридной природы из животной ткани и микробиологического сырья,
исследовать зависимость основных показателей качества получаемых продуктов от операционных условий технологического процесса,
изучить и обосновать оптимальные операционные параметры получения веществ с заданными физико-химическими свойствами,
разработать технологические схемы получения БАВ медицинского, микробиологического и пищевого назначения.
разработать способы переработки белковых отходов животной ткани и клеточной биомассы.
Экспериментальные исследования проводились на кафедре химии и
биотехнологии Московского государственного университета леса, во Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков и во Всероссийском научно-исследовательском институте мясной промышленности, отдельные разделы работы выполнялись в сотрудничестве с лабораторией технологии органопрепаратов ВНИИТКГП и кафедрой технологии полимеров МХТИ им. Д.И. Менделеева. Работы по теме диссертации проводились в соответствии с комплексной научно-технической профаммой Минвуза РФ "Продовольствие" (1986-90 гг.), комплексными планами ГКНТ СССР и Российской научно-технической профаммой 02.06 "Комплексные безотходные технологии переработки мяса. п. 05 "Разработать безотходные технологии пе-реработки вторичных нетрадиционных продуктов" на 1992-1999 гг.
Научная новизна. Проведены исследования физико-химических и биохимических свойств белковых и полисахаридных продуктов и показана взаимосвязь операционных технологических параметров получения и структурно-функциональных свойств БАВ.
Разработаны новые технологические процессы получения гепарина (Ах. СССР NN 1108629, 1202106), рекомбинантного белка с фрагментом проинсулина человека (Ах. СССР N 1828133), а также гидролиза-тов пищевого и микробиологического назначения (Положительное решение о выдаче патентов по заявкам NN 97115280 , 971152793).
Предложен способ иммобилизации панкреатина на карбоксиметил-целлюлозе, сохраняющий протеазную и эстеразную активности фермента. Совместной иммобилизацией в полиакриламидный гель трипсина и карбоксипептидазы В получен иммобилизованный катализатор для гидролитического расщепления проинсулина человека.
Из микробной биомассы выделен укороченный 150-звенныйре-комбинантный белок и определены условия его дальнейшей химико-ферментативной трансформации в инсулин.
Для осуществления очистки рекомбинантного белка синтезированы высокоустойчивые фторалкиловые иошгговые мембраны и определены условия эффективного обессоливания белка при длительном сохранении работоспособности мембран в электродиализаторе (А.с. СССР NN 689238, 770114, 909959, 969013).
Разработаны методики аналитического контроля процессов получения БАВ сложного химического строения из животного и микробного сырья.
Изучен процесс гидролиза белков крови комплексным химико-энзиматическим методом. Получены белковые гидролизаты, перспективные для пищевых и микробиологических целей ( Положительное решение о выдаче патента по заявке N 97110591).
Основные положения, выносимые на защиту:
-способы получения гепарина из животного сырья различных видов ионообменным методом,
-способ получения рекомбинантного белка и его трансформация в генно-инженерный инсулин человека,
-результаты изучения химико-ферментативной трансформации полипептидной структуры гибридного белка, включающего аминокислотную последовательность проинсулина человека.
-результаты изучения свойств полученных полисахаридов и полипептидов,
-способы иммобилизации протеаз и пептидаз на органических носителях методом ковалентного связывания,
- результаты исследований гидролиза белков крови комплексным химико-энзиматическим методом и способы получения обогащенных аминокислотами гидродизатов крови.
Практическая значимость работы. На основе проведенных исследований разработан технологический процесс получения гепарина , создана и испытана технология получения генно-инженерного инсулина человека, разработана технология получения белковых гидролиза-тов, которая может служить основой переработки отходов мясной, пищевой и микробиологической промышленности.
Разработаны методики аналитического контроля процессов выделения и очистки из ткани убойных животных и микробной биомассы, сложных веществ белковой и полисахаридной природы. Апробированные методики использованы в практических пособиях для обучения студентов.
Реализация результатов исследований. Разработаны и предложены для практического использования технологические схемы и технологии производства ряда важных биотехнологических продуктов. Разработанная технология производства гепарина внедрена на Московском, Каунасском, Минском заводах эндокринных препаратов. Проведена опытно-промышленная проверка процессов получения рекомбинантного белка и сухих гидролизатов крови.
Материалы работы использованы в учебных пособиях для вузов, справочных пособиях и научных статьях , посвященных физико-химическим и технологическим аспектам производства биотехнологических продуктов.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на научно-техничеких конференциях: II Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органопрепаратов"(Москва, 1982), Всесоюзной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990), Международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек" (Москва,1995), Международной конференции "Лечебно-профилактическое и детское питание" (С.-Петербург, 1996 ), 2-й Всероссийской конференции "Прогрессивные экологически безопасные технологии хранения и переработки с/х продуктов повышенной пищевой и биологической ценности" (Углич, 1996).
Результаты работы опубликованы в трудах Мелшународных конгрессов: 17th Int. Symposium on column liquid chromatography. (Hamburg, 1993), 44-th Simposium "Achievements and development of meat hygiene and technology"( Beograd, 1995), The 41-th Annual Int. Congress of meat science and tecnology (San Antonio, 1995), "Meat for the consumer" 42 JCMS&T (Norvegian, 1996), The 43-nd Congress ICOMST (New Zeland, 1997).
Публикации. Основное содержание диссертационной работы опубликовано в 51 публикации, в том числе получено 7 авторских свидетельств и 3 положительных решения о выдаче патента на изобретение.
В диссертации обобщены результаты, выполненные как самим автором, так и при его непосредственном участии и руководстве.
Структура работы. Диссертация написана на 383 стр. машинописного текста и состоит из введения 7 стр., обзора литературы 20 стр., экспериментальной части 297 стр., выводов 2 стр., списка литературы 40 стр. и приложения 10 стр. Библиография включает 462 литературных источников, из них 211 на русском языке. Работа содержит 68 рисунков и 60 таблиц.
