Содержание к диссертации
Введение
1. Прекурсорная стратегия синтеза олигоыуклеотидных конъюгатов. Методы синтеза аминомодифицированных по сахарному остову нуклеозидов - базовых соединений для реализации орекурсорной стратегии 9
1.1. Подходы к получению модифицированных олигонуклеотидов 9
1.1.1. Реакционноспособные (прекурсорные) группы для постсинтетической модификации олигонуклеотидов. Группы, требующие защиты в условях олигонуклеотидного синтеза 13
1.1.1.1. Аминогруппа: методы защиты и получения конъюгатов 14
1.1.1.2. Тиольная группа: методы защиты и получения конъюгатов 19
1.1.1.3. Методы защиты и модификации карбоксильной и альдегидной групп 22
1.1.2. Активированные линкерные группы-предшественники 24
1.1.2.1. Прекурсорная модификация гетероциклических оснований 24
1.1.2.2. Мономеры ненуклеозидной природы, несущие активированные линкерные группы 31
1.1.2.3. Прекурсорные группы в 2'-положениирибозы 34
1.1.2.4. Прекурсорные группы в реакциях циклоприсоединения Дильса-Ал ьдера и 1,3-диполярного азид-ал кино во го циклоприсоединения 38
1.2. Методы синтеза модифицированных по сахару нуклеозидов 40
1.2.1. Основные методы введения аминогруппы по углеводному фрагменту природных нуклеозидов 41
1.2.1.1. Нуклеофильное замещение сульфоэфиров 41
1.2.1.2. Раскрытие реакционноегюсобных &,2'-, 02,У- или О'^'-ангидроциклов пиримидиновых нуклеозидов азид-ионом 45
1.2.1.3. Раскрытие реакционноегюсобных О ,2'- ,0 ,3'- или 02,5'-ангидроциклов пиримидиновых нуклеозидов другими нуклеофилами 52
1.2.1.4. Раскрытие реакционноспособных 0,2'-; Os,34 0К,5'-циклов пуриновых нуклеозидов 56
1.2.1.5. Реакция Мицунобу (замещение гидроксильной группы нануклеофил в присутствии пары: диэтилазодикарбоксилат - трифенилфосфип) 58
1.2.2. Синтез нуклеозидов, исходя из гетероциклических оснований и модифицированного рибозного остатка. Реакция гликозилирования/перегликозилирования 61
2. Результаты и их обсуждение 71
2.1. Синтез 2'-амино-2'-дезоксинуклеозидов 71
2.1.1. Препаративный синтез 2'-амино2'-дезоксиуридина. Синтез 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2'-дезоксиуридина 71
2.1.2. Синтез 5,-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-амино-2,-дезоксицитидина 75
2.1.3. Синтез 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-Р~В-рибофуранозил]-Аг-бензоиладенина (2'-амино-2г-дезоксиаденозина) 77
2.1.4 Синтез 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-Р-О-арабино фуранозил]-Л/й-беязоиладенина 78
2.2. Синтез фосфамидитов на основе 2'-аминопроизводяых уридина, цитидина и аденозина, содержащих в 2'-положении линкеры с одной (двумя) метоксиоксалиламидными (М.ОХ) группами 79
2.2.1 .Синтез 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3,-(2-цианоэтокси-ДЛг-диизопродил- аминофосфинил)-2,-метоксиоксалиламидо-2'-дезоЕсиуридинаи 5'-0-(4,4'- диметокситратил)-3'-(2-цианоэтокси-Л^ЛГ-диизопропиламинофосфинил)- 2,-[Лr,iV-ди-{2-мeтoкcиoкcaлилaмидoэтил)aминoэтил]aмидooкcaлилaмидo-2,- дезоксиуридияа 79
2.2.2. Синтез ІУ4-бензоил-5'-С,~(4,4'-диметоксиі-ритил)-3'-(2-цианозтокси-Лґ,Лг- диизопропиламинофосфинил)-2,-метоксиоксалиламидо-2'-дезоксицитидина, 9- [5 - 0-(4,4' -диметокситритил)-3 -(2 -цианоэтокси-jV.iV- диизодрояштминофосфинил)-2-метоксиоксалиламидо-2-дезоксй-Р-П- рибофуранозил]-і/-бензоиладенинаи 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-3-(2- цианоэтокси-уУЛг-диизопропиламинофосфинил-2-метоксиок:салиламидо-2- дезокси-р-В-арабинофуранозил]-Л'6-бензоиладенина 81
2.3. Синтез фосфамидитов уридина и арабиноаденозина, несущих в рибозном фрагменте активированные линкерные группы различной длины на основе дикарбоновых кислот 82
2.3.1. Синтез фосфамидита 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-метоксикарбонигшетил-карбониламино-2'-дезоксиуридина 83
2.3.2. Синтез фосфамидитов 5'-0-(4,4'-диметокситритйл)-2,-[2-(цианметокси-карбонил)этилкарбониламино]-2'-дезоксиуридина, 5'-0-(4,4,-диметокситритил)-2'-[3-(цианметоксикарбонил)пропилкарбониламино]-2'-дезоксйуридина, 5'-0-(4,4,-диметокситритил)-2'-[4-(цианметоксикарбонил)бутилкарбониламино]-2'-дезоксиуридинаи 9-[5-0-(4,4'-диметокситритил)-2-{3-(цианметоксикарбонил)-лропилкарбониламяно}-Р-0-арабинофуранозил]-Л/6-бензойладенина 84
2.4. Синтез фосфамидитов на основе тимидина, цитидина и аденозина, несущих линкеры с МОХ-группами в гетероциклических основаниях 87
2.4.1. Синтез 5,'(4,4'-диметокситритил}-3'-(2-цианоэтокси-ЛСЛг-диизопропил-аминофосфинил)-5-{3-[Лг,іУ-ди-(2-метоксиоксалиламидозтил)аминозтил]-амидооксалиламидопропил}оксиметил-2'-дезоксиуридина 88
2.4.2. Синтез Л,4-{3^[Лг,Л''-ди--(2-метоксйоксалиламидоэтил)аминоэтил]амидо-оксалиламидопропил}-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цйаноэтокси^Ч7У-диизопропиламйиофосфинйл)-2'-дезоксицитидина 89
2.4.3. Синтез Л^-{3-[Л^,^-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтил]амидо-оксалиламидопропил}-5,-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-(2-цианозтокси-МіУ-диизопролиламинофосфинил)-5-метил-2'-дезоксицитидина 90
2.4.4. Синтез /Абензоило- {3-[;УЛ-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)амииоэтил]-амидооксшіиламидопропил}оксиметил-5'-С-(4.4'-диметокситритил)"Зг-(2-цианоэтокси-ЛА,Лг-диизопропиламинофосфинил)-2'-дезоксицитидина 91
2.4.5. Синтез /^r-{3-[N,N-ди,-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэгил]амидо-оксалиламидопропил}"5,-0-(4,4'-диметокситритил)"3'-(2-цианоэтокси-Л'',Лг-диизопропяламинофосфинил)-2'-дезоксиаденозина 92
2.5 Синтез фосфамидитных мономеров, несущих дендримерные конструкции с метоксиоксалиламидными (или су-планметоксикарбонялалкил- карбониламино)-группами 93
2.5.1, Синтез Лг*-(3-метоксиоксалиламидодропил)-5,-0-(4,4'-диметокситритил)- 3'-(2'Цианоэтокси-Лг^У-диизопропиламинофосфинид)-2'-дезоксицитидина и А*4- {3-[Лг,/У-ди-(Л'!Л/-ди-(2-метоксиоксалиламйдоэтил)аминоэтил)амидо- оксалиламидоэтил]амидооксаламидопропил-5'-С)-(4,4'-диметокситритил)- 3'-(2-цианоэтокси-ДЛг-диизопропиламинофосфинил)-2'-дезоксицитидина 94
2.6 Конструирование и синтез дендримерных конструкций с активированными линкерньши группами для постсинтетической модификации олигонуклеотидов 96
2.6.1. Синтез Л'-(12-аминододецил)^\р-{2-[бис-(2-{[2-(1Я-имидазол-4-ил)-этилшинооксалил]шино}этил)амино]этил}оксалилдиамида 96
2.6.2. Синтез трис{2-[бис-(2-метоксйоксаяиламидоэтил)амино]этилоксалил-амидоэтил} амина 97
2.7 Синтез олигонуклеотйдных конъюгатов, несущих активированные линкерные группы и последующая постсинтетическая модификация по ним флуоресцентными метками и другими реакционноспособными группами 98
2.7.1. Сравнение степени включения в олигонуклеотид арабино- и рибомодифици-рованыых мономеров 99
2.7.2. Применение 5'-0-(4.4'-диметокситритил)-3,-(2-цианоэтокси-Лг,;У-диизопропиламинофосфинил)-2'-метоксиоксалиламидо-2,-дезоксиуридина для синтеза олигонуклеотйдных конъюгатов, несущих фотоактивируемую группу 102
2.7.3. Применение 5-0-(4,4'-диметокситритил)-3 -(2-цианоэтокси-К,К-диизоиропиламинофосфинил)-2'-[3-(цианметоксикарбонил)-пропилкарбониламино]-2'-дезоксиуридинадля синтеза олигонуклеотидных конъюгатов 103
3. Экспериментальная часть 105
3.1. Реактивы и материалы 105
3.2. Методы 105
3.3. Органический синтез 107
Выводы 130
- Методы синтеза модифицированных по сахару нуклеозидов
- Синтез нуклеозидов, исходя из гетероциклических оснований и модифицированного рибозного остатка. Реакция гликозилирования/перегликозилирования
- Синтез фосфамидитов на основе 2'-аминопроизводяых уридина, цитидина и аденозина, содержащих в 2'-положении линкеры с одной (двумя) метоксиоксалиламидными (М.ОХ) группами
- Применение 5'-0-(4.4'-диметокситритил)-3,-(2-цианоэтокси-Лг,;У-диизопропиламинофосфинил)-2'-метоксиоксалиламидо-2,-дезоксиуридина для синтеза олигонуклеотйдных конъюгатов, несущих фотоактивируемую группу
Введение к работе
Синтетические аналоги нуклеиновых кислот, содержащие различные функциональные группы, являются важнейшими инструментами в молекулярно-биологических исследованиях. Область их применения чрезвычайно широкая: фундаментальные исследования, направленные на изучение субстратной специфичности и механизма действия ферментов нуклеинового обмена и НК-связывающих белков; структурно-функциональные исследования биополимеров; регуляция экспрессии генетического материала, а также его направленная реконструкция. Большое практическое применение модифицированные олигояуклеотиды находят в медицинской ДНК-диагностике [2-4].
Особый интерес вызывает синтез модифицированных олигонуклеотидов с различными заданными свойствами не присущими природным фрагментам ДНК и РНК, такими как устойчивость к ыуклеазной деградации, способность к проникновению через клеточные мембраны, к ковалентному связыванию с молекулами ДНК и белков, а также содержащие в своем составе группы, которые по реакционной способности значительно отличались бы от природных.
Введение каждой новой модификации в практику олигонуклеотидного синтеза связано с решением комплекса проблем как на стадии получения модифицированного мономера, так и при включении его в олигонуклеотидную цепь.
В настоящее время наибольшее распространение получили три основных способа получения модифицированных олигонуклеотидов:
Постсинтетическая модификация функциональных групп, исходно присутствующих в олигонуклеотиде;
Использование в химическом или ферментативном олигонуклеотидном синтезе мономерных синтонов (фосфамидитов или трифосфатов соответственно), несущих предполагаемую модификацию;
3) Встраивание в олигонуклеотидную цепь одного или нескольких мономеров,
несущих группы-предшественники, которые могут образовывать целевые конъюгаты на
различных этапах олигонуклеотидного синтеза.
Возможности первого метода ограничены получением олигонуклеотидных аналогов, имеющих множественные модификации (например, модифицированные экзоциклические аминогруппы цитидина). Исключением является избирательная модификация концевой фосфатной группы окислительно-восстановительной парой трифенилфосфин/дипиридил-дисульфид в присутствии нуклеофильных катализаторов или особые случаи, когда модифицируемый нуклеозид присутствует в олигонуклеотиде в единственном числе.
Второй и третий способы подразумевают синтез соответствующих мономериых сиытонов, вводимых на той или иной стадии олигонуклеотидного синтеза. При этом второй метод подразумевает синтез фосфамидита (или трифосфата в случае ферментативного синтеза) с заранее введенными функциональными группами, что делает подход к синтезу каждого олигонуклеотидного конъюгата индивидуальным, начиная со стадии конструирования соответствующего мономериого звена. В то же время последний метод позволяет' получать широкий спектр олигонуклеотидных конъюгатов на базе одного мономера, что, безусловно, делает такой подход чрезвычайно перспективным.
В связи с этим, особый интерес приобретает как поиск новых функциональных групп, являющихся основой для постсинтетической модификации олигонуклеотидов, так и создание на базе таких групп-предшественников мономеров, позволяющих получать олигонуклеотидные конъюгаты с широким спектром структурных параметров. Создание оіраниченного набора таких мономеров не только будет являться одним из решений проблемы универсальности синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, но и позволит применять при их синтезе приемы и методы комбинаторной химии.
Целью настоящей работы является конструирование и синтез мономеров для стандартного амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза, содержащих в различных положения нуклеотидов активные линкерные группы и обеспечивающих получение широкого спектра олигонуклеотидных конъюгатов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать простые препаративные методы синтеза 2'~амино-2'-дезоксинуклеозидов, которые являются базовыми соединениями для синтеза нуклеозидов с прскурсорными группами;
сконструировать активированные линкерные группы различной длины и жесткости, включая дендримериые линкерные группы с двумя и более функциональными остатками;
синтезировать мономеры для стандартного амидофосфитного олигонуклеотидного синтеза, содержащие активные линкерные группы на основе моноамида монометилового эфира щавелевой кислоты и моноамидов моноциан метиловых эфиров янтарной, глутаровой и адипиновой кислот;
продемонстрировать возможность использования полученных мономеров в синтезе олигонуклеотидных конъюгатов.
Методы синтеза модифицированных по сахару нуклеозидов
Существуют две основные стратегии синтеза модифицированных но углеводному остатку нуклеозидов: 1) Модификация природных нуклеозидов [] 13-118]; 2) Синтез нуклеозидов, исходя из гетероциклических оснований и модифицированного углеводного остатка [119-125]. При модификации природных нуклеозидов схема синтеза ойредёЖйЙ-я--;п6и оже нием модификации и, как правило, включает в себя использование большого количества защитных групп в комбинации с реакциями окисления/восстановления или замещения. К достоинствам следует отнести дешевизну исходных соединений, сравнительно небольшое число стадий. Ключевой стадией второй стратегии является реакция гликозилирования (neperликозилирования). Синтез, как правило, многоступенчатый, с относительно небольшими выходами. В процессе получения желаемого продукта возникает необходимость разделения энантиомеров. Преимуществом данной стратегии является возможность синтеза нуклеозидов с неариродными гетероциклическими основаниями. Синтез не лимитируется коммерчески доступными нуклеозидами. Степень сложности модификации гликозидного остатка без основания может быть значительно выше, чем та, которую можно достичь, модифишруя природный нуклеозид. Становятся возможными синтезы L-энантиомеров [126]. 1.2.1. Основные методы введения аминогруппы по углеводному фрагменту природных нуклеозидов Наиболее распространенный путь введения аминогруппы в рибозный остаток нуклеозида - это нуклеофильное замещение активированной гидроксильной группы под действием азид-иона с последующим восстановлением азидопроизводного до соответствующего амина. Синтез нуклеозидов, содержащих азидогруппу в углеводном фрагменте, представлен в обзоре [127]. Мы рассмотрим работы, которые не были упомянуты в этом обзоре либо были рассмотрены кратко. В основу метода положена реакция сульфоэфиров, протекающая, преимущественно, с замещением кислорода в спиртовой компоненте на нуклеофил. В качестве сульфокомпоненты наиболее часто используется остаток трифторметансульфокнслоты (трифлаты). Оптимальными условиями перевода нуклеозидов в трифлатные эфиры являются взаимодействие с трифторметансульфонилхлоридом в присутствии 3 экв. диметиламинопиридина в хлористом метилене при О С. Нуклеофильное замещение протекает по механизму SN2 с обращением конфигурации исходного нуклеозида [116]. Исходный аденозин (84) имеет нормальную конфигурацию. Суммарный выход на трех первых стадиях: ацилирование 2 -гидроксильной группы ангидридом трифторметан-сульфокислоты, нуклеофильное замещение азидом лития и восстановление азида составляет 33 %.
В работе показано, что обращение конфигураЦ.ии при С-2 -атоме не влияет на реакционную способность введенной аминогруппы. Использованию в синтезе природных нуклеозидов способствует их большая доступность, а также тот факт, что введение в олигонуклеотидную цепь мономеров с арабиноконфигурацией, при прочих равных условиях, в меньшей степени дестабилизирует дуплексные структуры. В работе [129], основываясь на данной стратегии, получены фосфорамидиты 2 -аминоарабиноаденозина и 2 -аминоарабиногуанозина. При этом, для блокирования 2 -аминогруппы использовали 2-(4-нитрофенил)этильную защиту, а для экзоциклических 42 аминогрупп 2-(4-нитрофенил)этоксикарбонильную. Реакция нуклеофильного замещения трифторметилсульфонильной группы азидом лития в ДМФА протекала с высоким выходом (92 %). Для синтеза модифицированных по рибозному остатку нуклеозидов, имеющих природную конфигурацию, используют в качестве исходных соединений их обращенные энантиомеры. Так были получены уридин и аденозин (U, А) с различными заместителями по 2 -рибоположеншо [130]. Замещение трифлата в С-2 -положении проходит с хорошими выходами не только с азид-ионом, но и с другими нуклеофилами; анионами СГ, Вг", Г, AcS\AcO"[131J. В работе [132] после введения по 3 - и 5 -положениям защиты Маркевича V-гидроксильная группа была переведена в трифлат с выходом 79 %. Нуклеофильное замещение в присутствии LiBr, NaOAc, и L1N3 в гексаметаполе дает соответствующие 2 -замещенные аналоги арабиноаденозша с выходами 55 %, 44 % и 58 % соответственно. Вместо труднодоступного UN] можно использовать NaN3, выходы в этом случае достигали 68 % для аденозина [133] и 50 % для гуанозина [134]. Тозилирование 5 -гидроксильной группы 2,,3 -0-изопропйлиденаденозина л-толуол-сульфонилхлоридом в пиридине делает эту позицию предпочтительной для атаки широкого спектра азотных, серных, селеновых и галогеновых нуклеофалов.
Так, реакцией 5 - 9-тозил-2 ,3 -0-изопропйлиденаденозина (85) с избытком первичных алкиламинов была получена серия 5 -ашшламино-5 -дезокси-2 ,3,-(9-изопропилиденаденозиновых гомологов (86 a-g) [ 135] (схема 1.37). Реакция проходит быстро, с выходами 60 - 75 %. В работе [136] нуклеофильньш замещением тозильных эфиров были получены 5 -азиды уридина и аденозина с выходом 71-75 %. Реакция трифлата арабиноуридина или арабиноаденозина с /V-гидроксилфталимидо-М в присутствии ДБУ приводит к З -гидроксифтадимидзамещеппым пуклеозидам с высокими выходами (70 %) [138]. Позднее этими авторами был описан синтез 2 -амино производных уридина, цитидина и аденозина (89). В качестве нуклеофила использовали фталимид в присутствии ДБУ при 60 С. Фталимидные производные (90) легко переводились в амшюпроизводные (91) 40%-ным водным метиламином. Общий выход (89) в расчете на защищенный арабинонуклеозид составил 40 - 50 % (схема 1.39) [139]. Чаше всего дла получения ангидроциклов используют обработку дяфенилкарбояатом в присутствии бикарбоната натрия в качестве катализатора [93,140-144] либо соответствующие сульфоэфиры [145]. Образование ангидроциклов протекает, как правило, с высокими выходами. Первым полученным пиримидиновым ангидронуклеозидом был тозилат г З -О-изоиропилиден- -цнклоцитидина [146]; он был получен нагреванием в ацетоне изомерного ковалентного соединения, 2 ,3 -0- изолропилиден 5 -0-и-толуолсульфонилцитдщша. С тех пор был синтезирован ряд шримидиновых ангидронуклеозидов, которые послужили удобными синтетическими интермедиатами. При обработке аммиаком или разбавленной щелочью 2 -0-сульфонатов (рибонуклеозидов) легко образуются С Д -циклонуклеозиды. Авторами работы [147] предложен метод получения 2,2 -ангидро-1-р4 арабинофураяозилурацила реакцией этиленкарбоната с уридином при нагревании и пониженном давлении с выходом 71 %. Легкость образования циклонуклеозидов из рибонуклеозидных предшественников изменяется в ряду: 02,У- 02,5 - 02,- [148]. Нагреванием З -дезокси-З - и 5 -дезокси-5 -йоднуклеозидов с ацетатом серебра и в присутствии основания были получены 02,У- и 02,5 -циклотимидины [149]. Наиболее удачным одностадийным синтезом с выходом 65 % был получен О ,3 -циклотимидин при нагревании тимидина с избытком дифенилсульфита в диметилацетамиде [150]. Также О ,3 -нуклеозиды образуются из З -О-сульфонатных эфиров, синтез идет в присутствии гидроксида калия или триэтиламина в спирте при нагревании или без него [151,152]. В этих работах также рассмотрены условия конверсии 0\3 -ангидроциклов в С ,2 ангидроциклы. Ключевой стадией модификации с использованием реакционноспособных 0 ,2 - или О З -ангидроциклов является взаимодействие синтезированного тем или иным способом ангидропроизводного (94) с нуклеофилышми частицами (схема 1.41),
Синтез нуклеозидов, исходя из гетероциклических оснований и модифицированного рибозного остатка. Реакция гликозилирования/перегликозилирования
Реакция гликозилирования (конденсации) представляет собой сборку нуклеозидов, исхода из глйкозидных остатков и гетероциклических оснований (схема 1.61). Наиболее известные разновидности этого метода - реакция Кенигса-Кнорра (гликозилирование в присутствии тяжелых металлов), метод Гилберта-Джонсона (силильный метод), а также метод Гельфериха (процедура сплавления) [148]. Использование реакции гликозилирования позволяет получать широкий набор нуклеозидов, содержащих модификации как в рибозном фрагменте, так и в гетероциклическом основании. Основными проблемами данного метода являются: невысокие выходы в реакции гликозилирования, образование смеси а- и Р-аномеров, сложность синтеза модифицированных сахарных остатков. Авторами работы [126] были проведены систематические исследования и показано, что для гликозидного донора необходимы стабильные защитные группы, которые не принимали бы участия в реакции (Bz), ацильная группа при С -С-атоме (R С(О)) и хорошая уходящая группа при С -атоме (X) (схема 1.61). Было показано, что: 1. Для каждого гликозидного донора нужно подбирать оптимальные условия реакции гликозилирования, особенно это касается защитных групп, растворителя и катализатора; 2. Возможно получение апомерных смесей нуклеозидов; 3. Заместитель в С(5)-положении хоть и расположен далеко от реакционного центра, может влиять на выход реакции, возможно из-за стерических затруднений; 4. Существует узкий интервал температур, при которых возможно протекание реакции гликозилирования (перегликозилирования): при нагревании реакционной смеси выше 80 С разрушается гликозильный донор, но реакция начинается при 60 С; 5. Дг-Бензоиладенин дает плохой выход в этой реакции, лучше использовать более богатые электронами ароматические системы. Исходя из этих выводов, была создана новая стратегия проведения реакции гликозилирования: 1. Использование небольшой метоксикарбонильной группы для защиты С5-гидроксилыгой группы; 2. Использование 1 -О-метил-2-О-бензоильной защиты для гликозильного донора; 3. Использование в реакции Л -хлорпуринов вместо Л -бензошшуринов. Такой подход позволяет получать широкий спектр нуклеозидов с различными основаниями, однако, зачастую имеет недостатком низкие выходы продукта, состоящего из смеси энантиомеров. Так, при синтезах 2 -азидо и 2 -амино- 2 -дезоксипуринов возникает много проблем. Они, как правило, многостадийные [191] (до 14 стадий), проходят с низкими выходами и с большим количеством побочных продуктов [114].
В качестве катализатора используется хлорид олова (IV). Было установлено, что пропорция аномеров зависит от количества SnCL}. С его уменьшением выход продукта понижается до 32 %, но соотношение аномеров становится а:[3 = 1:6. Общий выход а и р-аномеров при переходе от уридина к аденозину составил 2,6 и 6,8 %, соответственно. Более успешно была проведена реакция гликозилирования пуринов защищенной 2-азидо-2-дезоксйрибозой (154), Так как 2 -азидо- или 2 -аминодезоксиуридин (155) может быть сравнительно легко получен из уридина, авторы работы исследовали возможности отделения сахарного остатка от нуклеозида и использования его для синтеза соответствующих пуришвых нуклеозидов (схема 1.62), однако, при этом также была получена смесь а- и [З-аяомеров целевых 2 -азидо-2 -дезоксирибонуклеозидов (в случае гуаиозина образуются 7- и 9-изомеры (156) и (157)) [121]. Конденсацией 3 0-ацетил-5-0-бензоил-2-азидо-2-дезокси-В-арабинофураноз ил- хлорида, полученного многостадийным синтезом из D-глюкозы, с силилированным цитозином был получен 1-(2-азидо-2-дезокси-Р-В-арабинофуранозил)цитозин с выходом 37 %. В этом случае таїске наблюдалось образование сс-аномера, выход которого составил 10% [192]. Конденсацией хлормеркурий 6-оензамидопурина с 1-0-ацетил-2,5-ди-0-бензоил-3-ацетамидо-З-дезокси-П-рибофуранозой в присутствии тетрахлорида титана и последующего деблокирования был получен З -амино-З -дезоксиаденозин [119]. Для осуществления одного из подходов стратегии антиСмысловых олигонуклеотидов необходимо получить о 2 -дезоксинуклеозиды. В работе [195] это было основной задачей и для ее решения использовали стерическое экранирование р-положения для атаки иуклеофила путем введения объемного заместителя в 2 -положение арабиногликозида (160).
Реакция гликозилирования по стандартной методике (силилированное гетероциклическое основание, ацетонитрил, ЗпСЦ) гликозильных аномеров с силилированными урацилом, цитозином, аденином и гуанином была осуществлена с выходами сс-аномера(Ш) 69, 33, 76 и 79 %, соответственно (схема 1.64), Когда же условия благоприятствуют накоплению триметилсшшлхлоряда, предпочтительно образуется а-аномер (163) [148] (схема 1.65). » Исходными соединениями для получения гликозильного донора могут быть природные нуклеозиды, как предлагалось выше. Источником сахара также может служить коммерчески доступная D-ксилоза и L-ксилоза, которую переводят в фуранозное производное. Общий выход D-энантиомера З -амино-З -дезоксиаденозина при использовании этих соединений в качестве исходных составил 17 %, L-энантиомера - 19 % [126]. Примером получения нуклеозидов с искусственным гликозильным донором может служить работа [196]. В качестве исходного соединения брали 3,5-ди-0-бензил-4-С- гидрокси метил-1 Д-ди-О-изопропилиден-а-О-рибофуранозу. Реакцией гликозилирования были получены 4 -С-аминометил-2 -0-метил и 4 -С-аминометил-2,-дезокси-2 - фторпроизводные тимидияа с общими выходами 29 и 13 %, соответственно, В последнее время существует большой интерес к 2 ,3 -ненасыщенным нуклеозидам как к потенциальным агентам против вируса иммунодефицита человека. Работы ведутся по двум направлениям: синтез дидезоксипроизводных исходя из гетероциклических остатков и рибозного фрагмента, несущего двойную связь, а также путем введения в рибозный остаток групп, которые элиминируются с образованием двойной связи после синтеза соответствующих нуклеозидов. Поскольку двойная связь лабильна в условиях "fc реакции конденсации в присутствии кислот Льюиса, авторами работы [197] предложен прямой путь конденсации гликозидного остатка (164) уже несущего двойную связь с силилированным гетероциклическим основанием, используя Аг-бромсукцинимид для инициирования решении (схема 1,66), Был получен модифицированный уридин (165) и цитидин с выходами реакции гликозилирования 59 и 67 %, соответственно, преимущественно р-аномер.
Синтез фосфамидитов на основе 2'-аминопроизводяых уридина, цитидина и аденозина, содержащих в 2'-положении линкеры с одной (двумя) метоксиоксалиламидными (М.ОХ) группами
Из литературных данных [13] известно, что диэтиловый эфир щавелевой кислоты легко вступает в реакцию с алифатическими аминами, образуя моноамиды, при этом сохраняется возможность замещения второй метоксигруппы, хоть она и становится менее реакционноспособной. Эта особенность была использована для создания прекурсорных групп на основе моноамидов щавелевой кислоты - сокращенно МОХ - групп [95,98]. 2.2.1.Синтез 5 -0-(4,4 -диметокситритил)-3 -(2-цианоэтокси-М,М-диизопропил-аминофосфинил)-2 -метоксиоксалиламидо 2 -дезоксиуридина и 5 -0-(4,4 -диметокситритил)-3 -(2-цианоэтокси-М,№диизопропш1аминофосфинил)-2 -[М,М-ди-(2-метоксиоксалиламидоэтил)аминоэтал]амидооксалиламидо-2 -дезоксиуридина Реакцией аминонуклеозида (14) с диметилоксалатом при 50 С соединение (36) бьшо получено с выходом 52 % (в литературе есть краткие сведения о синтезе 5 -0-(4,4 -диметокситритил)-2 -метоксиоксалиламидо-2 -дезоксиуридина (36) [95], наша схема синтеза этого соединения аналогична представленной в работе [13]). Фосфитилирование соединения (36) проводили по стандартной методике: к раствору защищенного нуклеозида со свободной З -гидроксигруппой и диизопропиламмоний-тетразолида в свеженерегнанном хлористом метилене при перемешивании добавляли Л А Л -теіраизопропил-(2-циано)зтилфосфоДиамидит. Таким образом был получен фосфамидит (37). 5 -0-(4,4 -Диметокситритил)-2 -[, \/Д-ди-(2-метоксис1Ксалиламидоэтил)амииоэтил]-амидооксалиламидо-2 -дезоксиуридин (39) может быть получен из яуклеозида (14) последовательным наращиванием линкерной цепи (схема 2.7, путь А) либо обработкой предварительно синтезированным трис-(карбометоксикарбамоилэтил)амином (38) (схема 2.7, путь Б). Путь Б выглядит предпочтительным в связи с меньшим числом стадий синтеза, однако при взаимодействии соединения (38) с 2 -амяноуридином (14) наблюдается образование лишь следовых количеств целевого соединения (39).
В то же время последовательные реакции иуклеозида (14) с диметилоксалатом, трис-(2-амино:угил)амином и снова диметилоксалатом без выделения промежуточного соединения (40) позволили получить соединение (39) с суммарным выходом 30 %. Реакция диметилоксалата с аминогруппами линкерной цепи протекает значительно легче (при комнатной температуре, быстрее), нежели первая реакция с аминогруппой в 2 -положении рибозного остатка. Фосфитилирование соединения (39) по стандартной методике приводит к фосфамидиту (41). 2.2.2. Синтез Іч-бензоші-5 -0-(4,4 -диметокситритил)-3 (2-u,uaii03moKcu-N,N-диизопропиламинофосфинил)-2 -метоксиоксалиламидо-2 -дезоксицитидина, 9-[5-0 (4,4 -duMemoKcumpummi)-3-(2-nuaH03moKcu-N,N duu3onponiuiaMUHo-фосфинил)-2-метоксиоксалшіамидо-2-дезокси-/}--рибофуранозил/-ІУ-бензоиладенина и 9-[5-0-{4,4 -duMemoKcumpumwt) 3-(2-u.uaH03moKCU-N,N-диизопропиламинофосфинил-2-метоксиоксалиламидо-2-дезокси- -В-арабинофуранозил]-М-6ензоиладенина Реакция диметилоксалата с аминогруппой 5 -0-(4,4, диметокситритил)-2 -амино-2 -дезоксицитидина (15) (схема 2.8) идет быстрее и в более мягких условиях (при комнатной температуре), чем аналогичная реакция с 5 -0-(4,4 -диметокситритил)-2 -амино-2 -дезоксиуридином (14) (схема 2.7). При этом экзоциклическая аминогруппа основания не затрагивается. Последующая защита этой аминогруппы с помощью бензойного ангидрида по методике, описанной в работе [210], приводит к образованию соединения (43) с общим выходом 33 %. Фосфитилирование.нуклеозида (43) по стандартной методике приводит к мономеру для олигонуклеотидного синтза (44) с выходом 60 %. Аналогичным образом были синтезированы производные аденозина. Введение метоксиоксапильной группы в соединение (24) и синтез целевого фосфамидита (46) (схема 2.8) осуществляли по описанной выше процедуре. Выходы реакций составили 44 % и 75 %, соответственно. Для сравнения степени включения в олигонуклеотнд арабино- и рибомодифицироеанных фосфамидитов нами был также синтезирован 9-[5-0-(4,41-диметокситритил)-3-(2-цианозтокси"Лг,ІУ-диюопропиламинофосфиниЛ"2-метоксйоксалил-амидо-г-дезокси-р-О-арабинофуранозил /У-бензоиладенин (48). 9-[5-0-(4,4 -Диметокси-трйтил)-2-метоксиоксалиламидо-2-дезокси-Р-В-арабинофуранозил]-Л -бензоиладенин (47) (схема 2.8) был получен реакцией 9 [5 -0-(4,4 -диметокситритил)-2-амино-2-дезокси-p-D-арабинофуранозил]- -бензоиладенина (28) с диметилоксалатом в присутствии диизопропилэтиламина. Отмечено, что время введения метшгоксалильного линкера по 2 -аминогрулпе в рибо- и арабиноположеаии 2 -дезоксиаденозина было одинаковым. Но выход реакции во втором случае составил 55 % по сравнению с 44 % для рибоаналога. Фосфамидит (48) арабиномодифицированного нуклеозида был получен по стандартной методике с выходом 83 %, что также несколько больше чем для рибоаналога (46), выход которого составил 75 %. Это подтверждает предположения о стерических затруднениях при введении заместителей в 2-рибо положение. Несмотря на то, что метоксиоксалиламидная группа зарекомендовала себя как хорошая прекурсорная группа, использование в олигонуклеотидном синтезе фосфамидитов, содержащих в 2 -положении такую группу, выявило ряд проблем. Для достижения приемлемых выходов олигонуклеотидных конъюгатОв необходимо значительное увеличение времени конденсации и применение более активного катализатора - этилтиотетразола [95]. При использовании мономера с арабиномодификацией подобных проблем не наблюдалось. Причина этого явления до конца не выяснена.
В литературе высказано предположение о стерических затруднениях со стороны жесткой метоксиоксалиламидной группы в 2 -положении [95]. Возможно также, что низкие выходы связаны с внутримолекулярной дезактивацией амидофосфитной группы близко расположенной карбонильной группой метоксиоксалиламида. 2.3. Синтез фосфамидитов уридина и арабиноаденозина, несущих в рибозном фрагменте активированные динкерные группы различной длины на основе дикарбоновых кислот С целью уйти от жесткой конструкции МОХ-группы и одновременно разнести эти реакционные центры, нами было предложено использовать в качестве активированных Соответствующий нуклеозид (51) может быть получен из 2 -амино-2 -дезоксиуридина (10) как показано на схеме 2.9, путь А. Этот путь включает в себя 4 стадии. Путь Б, состояший из двух стадий, кажется более рациональным, однако реакция 2 -амино-2 -дезоксиуридина с диметиловым эфиром малоновой кислоты приводит к основному продукту, которому на основании спектральных характеристик Н-ЯМР, С-ЯМР и ИК (в спектре присутствует полоса колебания для сложноэфирной группы и отсутствует полоса колебания для карбоксильной группы, в то время как в Н-ЯМР спектре отсутствует сигнал протонов С (0)ОС#ггруппы) была присвоена структура циклического соединения б-(2,4-диоксо-3,4-дигидро-2Я-пиримидин-1-йл)-8-гидроксиметил-тетрагидро-фуро[3,4-(3]-[1,4]оксазепин-2,4-диона (49). Поэтому нуклеозид (51) был получен реакцией диметилового эфира малоновой кислоты с 5 -0-(4,4 -диметокситритил)-2 -амино 2 -дезоксиуридином (14). После хроматографического разделения выход продукта (51) составил 30 %. Фосфитилирование 5,-0-(4,4 -диметокситритил)-2 -метоксикарбонилметил-карбониламино 2 -дезокеиуридина (51) проводили по стандартной методике. Выход соединения (52) составил 64 %. Дополнительная метиленовая группа между двумя карбонильными атомами углерода в метоксималониламидном линкере незначительно снижает реакционную способность сложноэфирной группы по отношению к аминам. Были проведены параллельные реакции, обработка 10-кратным избытком пропилендиамина метоксиоксалиламидного и метоксималониламидного производных 2 -дезоксиуридина. Через час обе реакции привели к количественному образованию соответствующих амидов. Были также синтезированы нуклеозиды, несущие в 2 -положении этоксикарбоншшетилкарбониламино-грутщу (реакцией З -О- Д -диметокситритил) -амино-2 -дезоксиуридина (14) с диэтиловым эфиром малоновой кислоты) и этоксикарбонилбромметилкарбониламино-гругшу (реакцией 5 -0-(4,4 -диметокситритил)-2 -амиио-2 -дезоксиуридина (14) с диэтиловым эфиром броммалоновой кислоты). Реакционная способность этиловых эфиров малоновой и броммалоновой кислот по отношению к 5 -0-(4,4 -диметокситритил)-2 -амино-2 -дезоксиуридину (14) очень низкая.
Применение 5'-0-(4.4'-диметокситритил)-3,-(2-цианоэтокси-Лг,;У-диизопропиламинофосфинил)-2'-метоксиоксалиламидо-2,-дезоксиуридина для синтеза олигонуклеотйдных конъюгатов, несущих фотоактивируемую группу
В ряде случаев, когда допустимо введение заместителей в гетероциклическое основание, для постсинтетической модификации олигонуклеотидов могут быть использованы фосфамидиты, содержащие линкерные группы в гетероциклах. Использование в процессе автоматического олигонуклеотидного синтеза фосфамидитных реагентов на основе нуклеозидов с соответствующим образом модифицированными гетероциклическими основаниями также позволяет вводить модифицированные звенья в различные положения олигодезоксирибонуклеотида. Возможность введения модификации в различные положения пуриновых и пиримидиновых оснований позволит всесторонне изучить процесс взаимодействия модифицированных олигонуклеотидов с комплементарными нуклеиновыми кислотами, так как в зависимости от места введения реакционноспособных групп они могут располагаться как в малой, так и в большой бороздках дуплекса [212]. Как правило, для получения модифицированных по гетероциклическому основанию аналогов тимидина в качестве исходного соединения используют 2 -дезоксиуридин или его производные [213,214]. Однако ввиду большей коммерческой доступности в качестве исходного соединения был использован тимидин. В работе [215] были получены производные тимидина, содержащие 5-(2-аминоэтил)оксиметильный линкер. Аналогичным образом мы получили производное тимидина (67), содержащее 5-(3-аминопропил)оксиметильный остаток (схема 2.12). В работе [13] получение производного с двумя метоксиоксалиламидными группами достигалось путем последовательной обработки аминогруппы исходного соединения диметилоксалатом, трис-(2-аминоЗтил)амином и снова диметилоксалатом. Для сокращения числа стадий синтеза производного тимидина с двумя метоксиоксалиламидными группам нами был синтезирован трис- (метоксиоксалиламидоэтил)амин (38). фосфитилировааия нуклеозида был получен фосфамидит (71) (схема 2.12) для использования в стандартном олигонуклеотидном синтезе. В случае 2 -дезок:сицитидина введение алкильного заместителя по положению не приводит к полной потере способности образовывать водородные связи при комплементарном взаимодействии, хоть и снижает их прочность [214]. Получение аналогов 2 -дезоксицитидина, содержащих моноалкилированную экзоциклическую аминогруппу, возможно при использовании 2Чдезоксиуридина в качестве исходного соединения по реакции его 4-триазолид- или 4-тиопроизводных с соответствующими аминами [216,217].
Поиск методов синтеза производных 2 -дезоксицитидина с использованием более доступных исходных соединений обратил наше внимание на работу [218], где был предложен простой метод получения защищенного по 5 -гидроксильной группе Л/4-(6-амнногексил)-2 -дезоксицитидина в одну стадию из 7V4-бензоил-5 -0-(4,4 -диметокситритил)-2,-дезоксицштидина (72) с помощью реакции переаминирования. Аналогично нами был получен защищенный по 5 -гидроксильной группе Л?4-(3-аминопропил)-2 -дезоксицитидин (73) (схема 2.13). Несмотря на относительно невысокий выход реакции переаминирования (40 %), доступность исходного соединения (72), являющегося предшественником фосфамидитного реагента для стандартного олигонуклеотидного синтеза, а также возможность регенерации исходного нуклеозида из основного побочного продукта - 5 (4,4 -диметокситритил)-2 -дезоксищшщина (74) (схема 2.14) делает данный метод получения производного (73) удобным и практичным. На следующем этапе синтеза в модифицированный нуклеозид (73) вводили линкер с реакционноспособными метоксиоксалиламидными группами аналогично реакции модификации аминопропильного производного тимидина (67) (схема 2,12, /). На последней стадии синтеза З -гидроксильную группу нуклеозида (75) фосфитшгароваля, получая фосфамидит (76). Для расширения спектра возможных олигонуклеотидных коньюгатов мы также синтезировали фосфамидит (77) (схема 2.14), отличающийся от мономера (76) только метальной группой в положении 5 гетероцикла. Дяя синтеза соединения (77) 5 -0-(4,4 -дйметокситритил)тимидин (78) обрабатывали триметилхлорсиланом, затем - хлорокисыо фосфора и 1,2,4-триазолом. Промежуточное триазолидное производное без выделения обрабатывали 1,3-диаминопропаном аналогично методике из работы [220]. После обработки водным аммиаком получали Л -(3-аминопропил)-5 -0-(4,4/-диметокситритил)-5-метил-2 -дезоксицитидин (79) (схема 2.14), Затем вводили линкер с активными метоксиоксалиламидными группами реакцией с соединением (38) и фосфитшшровали модифицированный нуклеозид (80) с получением целевого фосфамидита (77) с выходом 90 %. Ключевым соединением в синтезе производных 2 -дезоксиаденозина по Л -вдложению служит 9-{2-дезокси-Р-Л-рибофуранозил)-6-хлорпурин [221 -223], который получают хлорированием 2 -дезоксиинозина [224] или дезаминированием 2 -дезоксиаденозина под действием амилнитрита в присутствии CCU [225].
Недостатком данных методов синтеза является частичная апуринизация производных 2 -дезоксиаденозина в кислых условиях, что понижает выход реакций. В работах [209,226] предложен метод синтеза производных 2 -дезоксиаденозина по -положению через образование промежуточных триазолидных соединений. По аналогии с данными работы [226] мы синтезировали Л -(3-аминопропил)-5 -0-(4,4 -диметокситритил)-2 - дезоксиаденозин (89) (схема 2.16). После введения линкера с метоксиоксалиламидными группами по реакции с соединением (38) и фосфитилирования нуклеозида (90) получали целевой фосфамидит (91). Таким образом, нами получены синтоны для олигодезоксирибонуклеотидного синтеза которые содержат активированные линкерные группы в гетероциклических основаниях тимидина (71), 2 -дезоксидитидина (76), (81), 5-метил-2 -дезоксицитидина (77), и 2 -дезоксиаденозина (91). Предложенные соединения позволяют вводить реакционнослособные метоксиоксалиламидные группы практически в любую позицию олигодезоксирибонуклеотидной последовательности. Синтез всех модифицированных нуклеозидов не требует дорогостоящих исходных веществ, хорошо воспроизводится и позволяет получать целевые соединения с относительно высокими выходами. 2.5. Синтез фосфамидитных мономеров, несущих дендримерные конструкции с метоксиоксалиламидными (или у-цианметоксикарбонилалкилкарбонил-амино)-группами Имидазольная и амидная группы играют ключевую роль при создании «искусственных рибонуклеаз»- синтетических катализаторов расщепления фосфодиэфирньк связей в РНК [227]. В то же время, для достижения высокой эффективности гидролиза РНК необходимо, чтобы каталитические группы искусственных рибонуклеаз бьши ориентированы относительно гидролизуемой фосфодиэфирной связи оптимальным образом. Одним из подходов, позволяющих этого достичь, является синтез дендримерных конструкций, содержащих большое число ацилированных остатков гистамина. Вполне возможно, что при достаточной длине линкерных групп и большом числе потенциальных каталитических групп часть из них окажется в оптимальном для протекания гидролиза положении. При синтезе олигонуклеотидных конъюгатов использовалась прекурсорная стратегия с применением диэтиловых эфиров щавелевой кислоты и симметричного трис(2-аминоэтил)амина. Исследования показали, что максимальная гидролитическая активность наблюдается в случае соединений, несущих 4 и 8 имидазольных фрагментов [228]. Для значимого уменьшения стабильности комплекса между олигонуклеотидным конъюгатом и продуктами расщепления РНК каталитическую группу предпочтительно вводить во внутреннее положение олигонуклеотидного адреса. В том числе для реализации данного подхода потребовалось разработать общий метод введения каталитических групп в различные положения олигонуклеотидного конъюгата.
