Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор. 5
2.1 Вкусовые клетки млекопитающих. 5
2.2 Сигнальные каскады вкусовых клеток . 6
2.3 Межклеточные коммуникации и сигнальные молекулы вкусовой почки. 12
2.4 Пуринорецепторы и сопряжённые с ними сигнальные каскады. 15
2.5 Кальциевая сигнализация. 21
3. Материалы и методы. 33
3.1 Выделение вкусовых клеток и их подготовка к эксперименту. 33
3.2 Метод микрофотометрии и экспериментальная установка . 34
4. Результаты и обсуждение. 37
4.1 Феноменология действия АТР. 37
4.2 Активация фосфолипазы С и 1Рз рецепторов под действием АТР . 44
4.3 Вклад SOC каналов в АТР-ответы. 48
4.4 Механизмы удаления Са из цитоплазмы. 55
4.5 Модуляция сАМР и фосфорилированием . 59
4.6 Моделирование динамики Са2+ сигналов во вкусовых клетках в ответ на АТР 64
Заключение 73
Выводы. 74
Список литературы. 77
Список сокращений. 92
- Сигнальные каскады вкусовых клеток
- Метод микрофотометрии и экспериментальная установка
- Активация фосфолипазы С и 1Рз рецепторов под действием АТР
- Модуляция сАМР и фосфорилированием
Введение к работе
Сенсорные системы обеспечивают организмы информацией об окружающем мире, которая жизненно важна для их существования. Основной функцией вкусовой системы является оценка качества пищи. Так вещества, имеющие сладкий (т.е., привлекательный) вкус, являются высококалорийными, а большинство горьких веществ являются ядовитыми. Считается, что человек способен различать пять базовых вкуса: кислый, соленый, сладкий, горький и умами (шпаті), который вызывается глютаматом и некоторыми другими аминокислотами. Поведенческие эксперименты, а также регистрации активности вкусовых нервных волокон дают основания полагать, что данные вкусовые модальности скорее всего применимы к животному миру в целом. Это предполагает существование молекулярных структур на рецептирующей поверхности вкусовых клеток, которые специализируются в распозновании вкусового стимула соответствующей модальности. Достижения последних лет молекулярной биологии вкуса свидетельствуют о том, что это действительно так. В частности, идентифицированы мембранные рецепторы для сладких и горьких веществ и аминокислот, вызывающих умами вкус. Тем не менее, молекулярные механизмы вкуса во многом не ясны, поскольку во вкусовой клетке ни для одного из вкусовых стимулов не прослежена вся последовательность событий от взаимодействия с молекулярным рецептором до выброса нейромедиатора.
Одной из задач физиологии вкусового органа, которую предстоит решить, является исследование межклеточных коммуникаций во вкусовой почке. Популяция вкусовых клеток гетерогенна. Во вкусовой почке идентифицировано три морфологически различных типа веретенообразных клеток, функциональная роль которых доподлинно неизвестна, но которые, по-видимому, выполняют рецепторную, поддерживающую и/или
секреторную функции. Эти клетки обмениваются примерно раз в двадцать дней, развиваясь из клеток предшественников и в конце жизни подвергаясь апоптозу. Поскольку вкусовые клетки устанавливают афферентные синапсы с вкусовыми нервами, то их непрерывное обновление требует постоянного установления новых синаптических связей во вкусовой почке. Кроме того, подобно тому, как это происходит в сетчатке или обонятельной луковице, сенсорная информация также может подвергается первичной обработке во вкусовой почке. Протекание всех этих гетерогенных но синхронизированных процессов несомненно требует хорошо отлаженных коммуникаций между клетками вкусовой почки. Ряд фактов, установленных в последние годы, свидетельствуют в пользу подобной точки зрения. В частности, присутствие сигнальных молекул нескольких типов (ацетилхолин, ГАМК, субстанция Р) во вкусовой почке было показано иммуногистохимически, в то время как рецепторы к ним были найдены во вкусовых клетках методами молекулярной биологии и электрофизиологии. Недавно нами было установлено, что экстраклеточный АТР мобилизует
"7-і*
Са в цитоплазме вкусовых клеток. Фармакология эффектов АТР не оставляет сомнения в том, что действие нуклеотида опосредуется метаботропными рецепторами P2Y типа. Эти и другие наблюдения свидетельствуют о том, что АТР может быть еще одной сигнальной молекулой, обеспечивающией коммуникации между вкусовыми клетками. Поэтому основной целью данной работы было изучить механизмы генерации внутриклеточных Са2+ сигналов во вкусовых клетках в ответ на АТР и очертить возможную роль пуринэргической сигнальной системы в функционировании органа вкуса.
^Литературный обзор.
Сигнальные каскады вкусовых клеток
Для восприятия внешних сигналов различной физической и химической природы разнообразные клетки используют специфические рецепторные белки и биохимические каскадыусиления, генерирующие внутриклеточные сигналы в ответ на внешнее воздействие. Хотя в настоящий момент известно несколько разных типов сигнальных систем, по большей части возбуждение передается в цитоплазму клетки при участии G-белков, взаимодействующих с трансмембранным GPC-рецептором (G-protein coupled) (Lindemann, 2001), который переходит в возбужденное состояние под действием внешнего стимула. Ключевым событием является катализируемая возбужденным рецептором диссоциация нескольких сотен гетеротримерных G-белков на ос-субъединицу и комплекс Р- и у-субъединиц. Каждый из них может регулировать активность ионных каналов и/или эффекторных ферментов, которые генерируют внутриклеточные сигналы в виде быстро диффундирующих молекул - вторичных мессенджеров. Подобные механизмы усиления используются при гормональной регуляции и в фототрансдукции, они участвуют в процессах формирования памяти и развития (Gilman 1987; Neer 1995; Edition and Watling 1998). Ряд данных свидетельствует о том, что такие каскады используются и вкусовыми рецепторными клетками (ВРК) для трансдукции горьких и сладких стимулов и ряда аминокислот (Herness, Gilberson, 1999; Lindemann 2001; Margolskee 2002). Что касается действия солёных и кислых стимулов, то предполагается что для их трансдукции достаточно модуляции ионных потоков через апикальную мембрану, обусловленной изменением ионного состава среды (Na+, в случае солёного; Н4", в случае кислого стимула) во вкусовой поре (Lindemann, 1996; Herness, Gilberson, 1999). В контексте нашего исследования вкусовых клеток мы рассмотрим ниже лишь данные, касающиеся того, что известно на настоящий момент о внутриклеточных сигнальных каскадах, функционирующих во вкусовых клетках.
В последнее десятилетие методами молекулярной биологии, биохимии и электрофизиологии интенсивно исследовались сигнальные каскады вкусовых клеток и были идентифицированы многие сигнальные молекулы. Одними из первых были идентифицированы восемь а субъединиц G-белков, которые являются своего рода визитной карточкой сигнального каскада. Наиболее представлено семейство Gi/Go, четыре представителя которого экспрессируются во вкусовых клетках: а-гастдуцин, а-трансдуцин, Gi.2j и Gj.3. Кроме того, найдены G-белки Gs (а-Gs) и Gq (a-Gq, a-Gi4, a-G)5) типа (Margolskee, 2002). Их специфическая роль в физиологии вкусовых клеток практически не известна, за исключением, быть может, гастдуцина: поведенческие эксперименты и регистрации от вкусового нерва показывают, что мыши, у которых была подавлена (knock out) экспрессия гастдуцина, оказались на два порядка менее чувствительны к горьким и сладким (но не к соленым и кислым) веществам по сравнению с нативными мышами (Wong et al., 1996). Это однозначно говорит о принципиальной роли гастдуцина в формировании горького и сладкого вкуса, а-субъединица которого скорее всего активирует фосфодиэстеразу (PDE), а ру-комллекс контролирует фосфолипазу С (Margolskee, 2002). На примере разнообразных клеточных систем было показано, что G-белки из семейства Gs активируют аденилатциклазу (АС) и модулируют активность потенциал-зависимых Са2+ каналов (Dascal, 2001); G-белки из семейства Gi/Go ингибируют АС, активируют фосфолипазу С (PLC) и PDE и модулируют активность К+ каналов и Са2+ каналов (Dascal, 2001). Эти и перечисленные выше данные говорят о том, что потенциально возбуждение вкусовых клеток может происходить путем модуляции активности ионных каналов G-белками или в результате изменения внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов или за счет генерации 1Рз и мобилизации Са . Действительно, многие элементы циклонуклеотидного и фосфоинозитидного каскадов найдены во вкусовых клетках и в частности: AC (Abaffy, et al., 2003), PDE (Kinnamon and Margolskee, 1996), цикло-нуклеотид-зависимые каналы (Kaupp and Seifert, 2002), PLC (Asano-Miyoshi et al., 2000), 1Р3-рецепторы (Yan et al., 2001 ) и TRP-каналы (Zhang, et ah, 2003). Однако, вклад этих каскадов в возбуждение вкусовых клеток химическими стимулами фактически не исследован и мало что известно какие рецепторы контролируют активность этих сигнальных систем. Недавно было идентифицировано семейство генов кодирующих GPC-рецепторы, получивших название T2R/TRB (Adler et al, 2000), которые специфически экспрессируются во вкусовых клетках, и которые, по-всей видимости, функционируют как вкусовые рецепторы (Lindemann, 2001). Со структурной точки зрения T2R/TRB рецепторы лишь отдаленно связаны с другими GPCR, такими как VIR (рецепторы на феромоны), и даже внутри семейства степень гомологии составляет 30-70%. Эти рецепторы имеют высоко консервативные области в цитоплазматических петлях и прилежащих к этим областям трансмембранных сегментах (предположительно выполняющих функцию взаимодействия с G-белками) и сильно дивергирующие экстраклеточные области (потенциальные сайты связывания с лигандами) (Gilbertson, et al., 2000). У крыс и мышей T2R/TRB рецепторы экспедируются в 15-20% ВРК желобоватых и листовидных сосочках и в очень малом количестве ВРК грибовидных сосочков (Margolskee, 2002).
Основываясь на данных in situ гибридизации, показано, что T2R/TRB рецепторы экспрессируются в определенных типах ВРК (Adler et al., 2000). В частности, T2R/TRB рецепторы экспрессируются в клетках экспрессирующих гастдуцин (Gilbertson, et al., 2000; Margolskee, 2002). В биохимических экспериментах было показано, что T2R5 - рецептор, распознающий горькое вещество цикл ore ксимид, селективно активирует гастдуцин, но не другие G-белки, экспрессируемые во вкусовых клетках (Chandrachekar et al., 2000). Это дает основание думать, что именно гастдуцин связывает T2R5 и возможно другие рецепторы к горьким веществам с эффекторньши ферментами. Методом single cell RT-PCR анализировалась экспрессия субъединиц G-белков и было показано, что гастдуцин скорее всего состоит из а-гастдуцина и рЗ и у13 субъединиц (Huang et al., 1999). Было также показано, что горькие вещества стимулируют синтез 1Р3 и что этот ответ блокируется
Метод микрофотометрии и экспериментальная установка
Изолированные вкусовые почки и клетки помещали в перфузируемую фотометрическую камеру в виде эллипса с полимерными стенками на покровном стекле, покрытом адгезивным материалом Cellak. (BD Biosciences, Bedford, МА).Объём каждой камеры составлял примерно 150 мкл. Вкусовые клетки и почки инкубировали в экстраклеточном растворе, содержащем мембрано-проникающий Са -индикатор FURA-2/AM (5 мкМ) + 0,02 % Pluronic (Molecular Probes, Eugene, OR) в течение 40 минут.
Гидролиз FURA-2AM клеточными эстеразами преобразует последний в Fura-2, который накапливаетя в цитоплазме и Са2+-зависимая флуоресценция которого позволяет оценивать концентрацию внутриклеточного Са . После этого почки (клетки) в течение 30 минут инкубировались в среде без красителя, для то го чтобы весь негидролизованный краситель вышел из клеток. Для возбуждения красителя на длинах волн 340 и 380 нм использовался DeltaRAM иллюминатор (High-Speed Multi-Wavelength Illuminator), a регистрация флуоресценции прокрашеных FURA-2 клеток регистрировалась на частоте 510 нм, используя фотоумножитель (Photomultiplier Detection Systems, Model 814.) в режиме счёта фотонов (Photon Technology International, South Brunswick, NJ) на базе инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 100S (Zeiss, Germany), на объективе Fluar 40x. Накопление и первичная обработка данных производилась с помощью программы FELIX v 1.42 ( PTI ). Для количественного определения внутриклеточного Са использовалась формула Гринкейвича: флуоресценции при возбуждении на 340 и 380 нм, Rmin - значение Ratio в отсутствие кальция , Rmax - значение Ratio при насыщении FURA-2 кальцием, S2 = F3so в отсутствие кальция, Sb2 = F3go при насыщении FURA-2 кальцием. Схема эксперимента приведена ниже: Помимо фотометрии анализировалось изображение вкусовых клеток и почек в флуоресцентном свете (imaging).
Этот метод в значительной степени аналогичен фотометрии, описанной выше, с тем отличием, что флуоресценция клеток анализируется не ФЭУ, который интегрирует ее интенсивность по пространству, a CCD камерой, которая позволяет визуализировать изображение во флуоресцентном свете, т.е. позволяет анализировать распределение интенсивности в пространстве. Для измерения пространственного распределения Са сигнала использовалась CCD camera IC-200 (8 bits, РТІ). Накопление и обработка данных производилась с помощью программы ImageMaster v 1.50 (РТІ). Изменение Са приводятся в виде отношения изменения интенсивности флуоресценции к ее значению в покое (AF/F0). Для анализа полученных данных и аппроксимации кривых использовалась программа SigmaPIot 8.0 (SPSS Chicago, IL). Математическое моделирование динамики Са ответов производилось с помощью программы Matlab Version 6.5.0.180913а Release 13. Все эксперименты проводились в растворе следующего состава ( мМ ) : 130 NaCl, 5 KCI, 1 СаС12, 1 MgS04, 1 Na2HP04, 1 NaH2P04, 5 NaHC03, 10 HEPES (натриевая соль), 5 Глюкоза, 5 Na-пируват, РН - 7.4 при температуре 25 - 27 С. Часть экспериментов проводилась в растворе содержащем 100 нМ СаС12 в котором дополнительно присутствовало 0,1 мМ EGTA. В описываемых ниже экспериментах внутриклеточный Са измерялся как в изолированных ВРК, так и в клетках в составе вкусовых почек (Рис. 2А, В). Вкусовые клетки и почки выделялись из листовидных и желобоватых сосочков и существенных отличий в их чувствительности к АТР в зависимости от типа вкусового сосочка обнаружено не было. Изолированные ВРК (Рис.2С-Е) исследовались в меньшей степени, поскольку они были намного менее чувствительны к АТР, показывая насыщающие ответы в 1-3 мм АТР в отличие от 100-500 цМ АТР полученные на вкусовых почках. Возможно, более сильная ферментативная и механическая обработка, которая требовалась для диссоциации почки на одиночные вкусовые клетки, уменьшала чувствительность последних к АТР.
Активация фосфолипазы С и 1Рз рецепторов под действием АТР
Теоретически может существовать несколько трансдукционных путей, результатом активации которых является мобилизация внутриклеточного Са . В зависимости от сопрягающих G-белков это может быть фосфоинозитидный каскад, каскад сАМР (модуляция кальциевых каналов сАМР), модуляция Са2+ каналов непосредственно G-белками (Burnstock, 2001; Di Virgilio and Solini, 2002).
Характерной особенностью Ca2+ сигналов, индуцируемых ATP,9-4 является первоначальный быстрый пикообразный подъем Са с последующим относительно медленным уменьшением его концентрациии выходом на плато (рис. 7А). Эксперименты, проведённые в бескальциевой среде показывают, что ответ на экстраклеточный АТР сохраняется, хотя и снижается по амплитуде, а плато и вовсе исчезает (рис 7Б). Эти данные свидетельствуют о том, что плато целиком определяется входом внешнего, кальция, а пик связан с выходом Са2+ из внутриклеточных депо. Поскольку в бескальциевой среде амплитуда ответа уменьшается, возможно, что поток внешнего Са2+ вносит определенный вклад в формирование пика. Кальциевые сигналы, аналогичные представленным на Рис.7, характерны для многих типов клеток и наблюдаются при активации рецепторов, в том числе пуринорецепторов, сцепленных с фосфоинозитидным каскадом.
Основываясь на способности клеток воспроизводить ответы вбескальциевой среде, мы предположили, что мобилизациявнутриклеточного Са является результатом активациифосфоинозитидного каскада. Действительно, прединкубация ВРК в присутствии ингибитора PLC U-73122 (10 цМ) в течение 1-3 минут приводила к практически полной потере чувствительности вкусовых клеток к АТР (Рис.7В) (8 клеток). Отметим, что действие U-73122 было практически необратимым. В качестве контроля, мы использовали ингибитор U-73343 (10 цМ), который значительно менее эффективен, чем U-73122, но оказывает сходные неспецифические эффекты согласно данным производителя. U-73343 вызывал лишь 10-15 % уменьшение амплитуды ответов (Рис.7Г) (3 клетки), тем самым подтверждая, что эффекты U-73122 специфичны и обусловлены ингибированием фосфолипазы разных клетках. (В) - ингибитор фосфолипазы С U73122 практически полностью подавляет чувствительность вкусовых клеток к АТР. (Г) - менее эффективный ингибитор фосфолипазы С U73343 слабо подавляет АТР-ответы. В (В) и (Г) данные получены на различных клетках. Все вещества были апплицированы в концентрациях, как отмечено над горизонтальными линиями, которые указывают начало и продолжительность стимуляции.
Хотя эффекты U-73122 несомненно свидетельствовали о ведущей роли фосфолипасы С, а значит и 1Р3 рецепторов, в ряде экспериментов мы попытались доказать непосредственно из участие в генерации кальциевых ответов на АТР. При аппликации ингибитора 1Р3 рецепторов 2-АРВ (50 цМ) ответы на АТР уменьшались на 50-70 % (рис. 8А). Данный эффект был обратимым в 40% случаях (Рис. 8А), а в остальных случаях частично обратимым (данные не показаны). Помимо прямого действия на 1Р3 рецепторы, 2-АРВ известен как блокатор различных Са -транспортирующих каналов, в частности запас-управляемых каналов ( Diver et al., 2001; Kukkonen et al., 2001).
Рисунок 8. Действие ингибитора 1Рз - рецептора 2-АРВ на кальциевые ответы, индуцируемые АТР. (А) 2-АРВ обратимо ингибирует ответы вкусовых клеток на АТР, (Б) 2-АРВ подавляет плато посредством ингибирования 1Рз —рецептора иблокирования входа Са . Эксперименты, представленные на (А) и (Б) проводились в присутствии I мМ экстраклеточного кальция. (В) 2-АРВ ингибирует АТР индуцируемый выход Са2+ из внутриклеточных депо в условиях пониженного внешнего Са2+. Линия, расположенная ниже графика показывает изменение концентрации экстраклеточного Са24". Для того чтобы клетки не теряли способность воспроизводить Са ответы, после первого ответа клетки инкубировались в нормальных условиях (1 мМ Са2+) в течение 5 минут для пополнения Са2+ депо. Данные, представленные в (А), (Б) и (В), получены на трёх различных вкусовых почках. (Б) и (В), шкалы для изменения Са и времени те же, что и в (А). Все вещества были апплицированы в концентрациях, указанных над горизонтальными линиями, указывающих момент и продолжительность стимуляции.
Поскольку в формирование пика может вносить вклад вход внешнего кальция, то принципиально существуют две возможности ингибирования Са ответов: 1) прямое блокирование самого рецептора, 2) блокирование Са2+ входа. Чтобы внести ясность в этот вопрос, мы провели специальную серию экспериментов. В присутствии наружного Са2+ ингибитор быстро уменьшал плато ответа на АТР, причем концентрация внутриклеточного Са2+ падала даже ниже уровня в покоя (рис. 8Б). Это свидетельствовало о том, что 1) 2-АРВ действительно блокирует вход наружного Са2+; 2) АТР активирует откачку Са2+ из цитоплазмы вкусовых клеток. В условиях с пониженным наружным Са2+ (100 нМ) преинкубация клеток с 2-АРВ наблюдалось заметное уменьшение амплитуды Са ответа (рис. 8В). Эти эксперименты ясно указывают, что хотя 2-АРВ блокирует Са2+ каналы, 1Рз рецепторы являются главной мишенью 2-АРВ, ответственной за ингибирование Са ответов. Описанные ваыше результаты позволяют утверждать, что фосфолипаза С и 1Рз рецепторы являются ключевыми сигнальными элементами в трансдукции АТР.
Существует множество Са2+-проницаемых катионных каналов, которые регулируют Са2+ вход при возбуждении клеток. (Wei et al., 1998; Lewis,1999; Eatock, 2000; Clapham et al., 2001). К ним также относятся запас-управляемые каналы (SOC, store operated channels), которые открываются в ответ на опустошение Са2+ депо. Считается, что при активации фосфоинозитидного каскада за вход Са2+ в невозбудимых клетках в основном отвечают именно SOC каналы. (Lewis, 1999; Stojilkovic et al., 2000; Venkatachalam et al. 2002). В частности, ряд данных свидетельствует о том, что SOC каналы вовлечены в генерацию ответов вкусовыми клетками мыши на горькие стимулы (Ogura et al., 2002).
Как отмечалось выше (Рис. 7Б), ингибитор фосфолипазы С U73122 полностью подавляет как пик так и плато АТР-ответов. Следовательно, активация PLC является необходимым условием для АТР-зависимо го входа наружного Са . В силу этого, можно исключить возможную активацию Са2+ каналов вторичными месенджерами, генерируемыми вследствии активации P2Y рецепторов, такими как G-белки или циклические нуклеотиды. Поэтому АТР-зависимая активация Са2+ входа принципиально может осуществляться лишь сигнальными молекулами, генерируемыми фосфолипазой С (1Рз и DAG), либо как результат деградации Р1Р2 и активации Р1Р2-ингибируемых каналов. Отметим, однако, что, насколько нам известно, последние пока еще не обнаружены.
В ряде экспериментов (4 клетки) мы апплицировали синтетический аналог DAG (1,2-Dioctanoyl-sn-glycerol), но не наблюдали увеличения Са в цитоплазме вкусовых клеток (данные не показаны). Это привело нас к заключению, что D AG-активируемые С а24" каналы не функционируют в АТР-чувствительных клетках и поэтому генерация 1Р3 - необходимый и достаточный процесс в АТР-зависимой активации входа внеклеточного Са . Последний, скорее всего, обусловлен активацией SOC каналов.В силу сказанного, мы провели ряд экспериментов, в которых попытались идентифицировать SOC каналы в АТР-чувствительных вкусовых клетках мыши и оценить их вклад в генерацию ответов на АТР. Для увеличения чувствительности метода концентрация внеклеточного
Модуляция сАМР и фосфорилированием
Как уже отмечалось выше, наши эксперименты свидетельствуют в пользу той точки зрения, что в процессе АТР-зависимого возбуждения вкусовых клеток наружный Са2+ входит в их цитоплазму преимущественно через SOC каналы. Это предполагает, что в присутствии АТР ретикулум (ER, endoplasmic reticulum) частично опустошен и что требуется некоторое время для его пополнения после удаления АТР. Это время можно оценить, исходя из величины рефрактерного периода между последовательными аппликациями АТР, который составляет примерно 1000 секунд. Поскольку рефрактерный период (время, требуемое для полного восстановления чувствительности каскада) определяется, в принципе, скоростью протекания двух процессов - деактивации сигнального каскада (P2Y рецептор - G-белок — фосфолипаза С) и пополнения Са2+ депо. В хорошо исследованных клеточных системах инактивация рецептора, обусловленная его фосфор илированием и связыванием аррестина, и деактивация G-белка, обусловленная гидролизом GTP, протекает быстрее 100 сек.
Можно поэтому думать, что в нашем случак 1000 секунд требуется для полного восстановления ретикулума, опустошенного АТР. С другой стороны, восстановление цитоплазматического Са происходит в течение 40 — 180 секунд после удаления АТР из внеклеточного раствора, что в значительной степени меньше рефракторного периода, т.е. характерного времени инактивации SOC каналов. Чтобы объяснить данное противоречие мы предположили, что АТР-зависимая мобилизация Са2+ сопровождается активацией Са2+ АТРазы плазмолеммы (см. Рис. 8), которая в компенсирует Са2+ поток через частично активированные SOC каналы. Для проверки данной идеи, а в дальнейшем, чтобы оценить вклад основных компонент каскада в его кинетические характеристики, нами была разработана математическая модель, схематично представленная на Рис.15. Рисунок 15. Схема Са потоков и их регуляций, участвующих в формировании АТР 2+ зависимых
Са сигналов. 1Л и Т З - потоки через Са+ каналы ретикулярной и плазматической мембран, соответственно. V2nV4- потоки, создаваемые Са2+ - АТР-азами. Пунктирные линии со знаками + и - обозначают соответственно активацию и угнетение Са2+ потоков. Количественно представленная выше схемы описывается системой дифференциальных уравнений, где в качестве переменных фигурируют цитоплазматический и ретикулярныйо Са+, а также функция е, 9+ характеризующая медленную активацию Са АТР-азы плазматической мембраны. В моделе учтены активация входа внеклеточного С а ретикулярным Са (SOC каналы) и кальций-зависимая регуляция 1Р3-рецептора. [Cad - концентрация цитоплазматического кальция. [Cas] - концентрация ретикулярного кальция. [Са0] - концентрация экстраклеточного кальция. Безразмерные параметры аир характеризуют хелатирование Са буфером цитозоля и ретикулума, соответственно. 2+ V\ -поток Са через ІРз-чувствительные каналы. ц. — утечка Са2+ через ретикулярную мембрану. К— константа полу насыщения по IPj. V2 — поток Са2+, создаваемый ретикулярной АТР-азой, V2 - максимальная скорость ретикулярной АТР-азы. К2 - константа полунасыщения по Са2+ для ретикулярной АТР-азы. п2 - коэффициент Хилла. Vb — поток Са2+ через плазматическую мембрану. 6 - утечка через плазматическую мембрану. Ki — константа ингибирования. пі - коэффициент Хилла. па - параметр, характеризующий кооперативнось открывания S ОС-каналов, b - параметр, характеризующий электодвижущую силу. V4 - поток Са2+, создаваемый плазматической АТР-азой. К4 — константа полунасыщения по Са для ретикулярной АТР-азы. п4 — коэффициент Хилла. Кб О = V4 - максимальная скорость плазматической АТРазы. Є - отношение концентрации активированной АТР-азы к ее тотальной концентрации e = Ea/Et.
