Введение к работе
Актуальность, За последние 15 лет было показано, что в организме животных и человека практически во всех органах и тканях ферментативным путем непрерывно продуцируется простейшее химическое соединение - оксид азота (N0). Оказалось, что в качестве универсального регулятора это соединение управляет многочисленными биохимическими процессами. Оксид азота необходим для установления нормального тонуса кровеносных сосудов, для нормального функционирования секреторных тканей. Продуциру-ясь в нервных окончаниях вегетативной нервной системы, оксид азота участвует в регуляции функционирования желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы. Оксид азота продуцируется и в центральной нервной системе, обеспечивая установление длительных связей между нейронами мозга (долговременная память), так что N0 необходим для обучения и творческой деятельности человека.
Синтез N0 осуществляется так называемыми NO-синтазами (NOS), в качестве единственного субстрата NOS выступает аминокислота L-аргинин (L-Arg.).
Стационарный уровень N0, определяемый .скоростями его синтеза и гибели, в норме не превышает нескольких микромолей. Именно при этих концентрациях N0 оказывает регуляторное действие на метаболические процессы. Вместе с тем, стационарный уровень N0 может повышаться до сотни микромолей. Эта ситуация характерна для активированных иммучо-компетентных клеток - макрофагов и нейтрофилов.
N0, генерируемый в больших концентрациях иммунокомпетентными клетками, оказывает цитотоксическое действие, что позволяет ему функционировать в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета. Предполагается, что это оружие используется иммунной сисге-
, jC ЕІЛЦНОНАДЬМЯІ ) БН6ЛНОТОД I
_2_ мой для защиты организма, как от бактериальной, так и злокачественной инвазии.
В настоящее время становится все более очевидным, что функционирование N0 в организме как свободно диффундирующей между клетками и тканями молекулы, малоэффективно. В свободном состоянии молекула N0 быстро погибает в различных реакциях, приводящих к его окислению в нит-ррты и нитраты. Есть основание полагать, что реализация действия N0, как правило, обеспечивается включением N0 в некоторые соединения, защищающие его от быстрой гибели. В качестве таких соединений предположительно выступают S-нитрозотиолы (RS-NO) или динитрозильные комплексы негемового железа (ДНКЖ). Эндогенное происхождение этих соединений, по крайней мере на клеточных культурах, в настоящее время доказано; - их образование связано с ферментативной генерацией N0 из L-аргинина и оно подавляется ингибиторами NO-синтаз. Оба типа соединений легко синтезировать in vitro, что позволяет использовать эти соединения для детального исследования их поведения в организме животных. Очевидно, что в этом случае перед исследователем встают три основные проблемы: во-первых, какие превращения совершают указанные соединения в клетках и тканях; во-вторых, какое действие они могут оказывать на системы и на организм в целом1; в-третьих, какие вещества могут влиять на время их жизни в клетках, тканях и т.д. Изучению этих проблем и посвящена настоящая диссертационная работа. Кроме того, понимание особенности поведения S-нитрозотиолов и ДНКЖ в организме животных может способствовать установлению механизмов биологического действия лекарственных соединений, активным началом которых выступает N0. К таковым относятся, например, органические нитраты, наиболее известным представителем которых является нитрогли-цеэин.
Сейчас происходит усиленный поиск и синтез NO-доноров, которые могут составить основу будущих лекарственных средств. Не исключено, что
метаболизм этих лекарственных средств сопряжен с синтезом из них RS-NO иДНКЖ.
Цель работы состоит в изучении факторов, влияющих на образовав ие ДНКЖ в организме животных по L-аргинин-зависимому пути. Ранее та вое образование было обнаружено только на клеточных культурах. Единственным методом, позволившим зарегистрировать в них эндогенные ДНКЖ, является спектроскопия ЭПР: ДНКЖ характеризуются специфическим сигналом ЭПР с gq, = 2,03 (сигналом 2,03). В связи с этим в задачи исследования входит:
Проверка способности экзогенных спиновых ловушек - желе:ю-дитиокарбаматных комплексов - образовывать в организме животных парамагнитные мононитрозильные комплексы, регистрируемые методом ЭПР.
Изучение методом ЭПР поведения экзогенных ДНКЖ в организме животных.
Проверка возможности образования ДНКЖ в организме животных при участии экзогенных S-нитрозотиолов.
Изучение влияния железа, как компонента ДНКЖ, на образование ск-сида азота в организме животных.
Изучение влияния разнообразных агентов (восстановителей, желеча, тиолов и т.д.) на образование ДНКЖ в организме животных.
Материалы и методы исследования. В работе использованы методы электронного парамагнитного резонанса и оптической спектрофотометрии. Эксперименты проведены на белых беспородных мышах-самцах (18—20 г) и крысах-самцах линии Вистар (100—150 г). Дня улавливания оксида азота в тканях животных использована его способность образовывать с Fe2+ и ди-этилдитиокарбаматом (ДЭТК) парамагнитные мононитрозильные комплексы железа (МНКЖ), регистрируемые методом ЭПР.
_4 -Спектры ЭПР. изолированных тканей регистрировались при 77 К на радиоспектрометрах "Radiopan" (Польша), "Bruker" (Германия) и ЭПР-В в X-диапазоне при СВЧ-мощности 5 мВт, амплитуде модуляции магнитного поля 0,5 мТ или при комнатной температуре, при СВЧ-мощности 1 мВт и ВЧ модуляции поля 0,5 мТ. В экспериментах были использованы липополисаха-риц из Е.соК (serotype 005 :В5) ("Sigma", США), диэтилдитиокарбамат натрия ("Serva", США), FeS04 ("Fluka", Швейцария), глутатион восстановленный ("Reanal", Венгрия), L-цистеин ("Sigma", США), тиосульфат натрия (хл.), нигро-Ь-аргинин (NLA) ("Sigma", США). ДНКЖ с L-цистеином, глутатио-ном, тиосульфатом натрия или фосфатом натрия были получены обработкой газообразным N0 в сосуде Тунберга при давлении NO 150-200 мм рт.ст. при молярном соотношении FeS04 к вышеперечисленным реагентам 1:2 или
1:20, как описано ранее /Vanin et al, 1996/. Для количественной оценки концентрации МНКЖ-ДЭТК, возникающих в печени мышей, их сигналы сопоставляли с сигналами аналогичных комплексов с известной концентрацией, синтезированных в растворе диметилсульфоксида по методике, разработан-ноя профессором Ваниным А.Ф. /Vanin, 1998/ Оценивались средняя величина и среднеквадратичное отклонение (М+м) для 10-25 измерений на различных животных.
Научная новизна.
Впервые обнаружено образование ДНКЖ в тканях животных при участии NO, продуцируемого ферментативным путем из L-аргинина. Показано, что для этого необходимо вводить животным тиосульфат, ослабляющий действие супероксида на ДНКЖ.
Показано, что использование железо-дитиокарбамагньгх комплексов позволяет обнаруживать методом ЭПР в организме животных оксид азота, образующийся по L-аргинин-зависимому пути. АВС-модификация метода, устраняющая влияние супероксица на уровень парамагнитных нитрозо-адцуктов железо-дитиокарбаматных комплек-
сов, резко повышает количество регистрируемого таким образом оксида азота в организме животных. 3. Показано, что введение животным железа вместе с ДЭТК повышает уровень МНКЖ в печени. Предполагается, что в ответ на проокси-дантное действие железа в клетках быстро активизируется антиоксидантная защита (например, генерация восстановленного глутатиона), что и приводит к снижению уровня супероксида и повышению уроння МНКЖ. Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для создания нового класса фармакологических средств — доноров N0, ионов нитрозония (NO"1) и групп Fe+(NO+)2, которые могут выступать в качестве сердечно-сосудистых и антитромботических лекарств. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции «Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве», Казань, 1988; Международной конференции "EPR-spectroscopy of nitric oxide in biological systems", Суздаль, 1996; Всероссийской конференции «Физика.и химия элементарных химических процессов», Черноголовка, 1997; The 5 International Conference of Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes, Moscow, 1997; International Symposium on Nitric Oxide in Health and Diseases. Kumamoto, Japan, 1997.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 научные статьи и 5 тезисов докладов. Основные положения, выносимые на защиту:
комплексы железа с диэтилдитиокарбаматом (ДЭТК) способны выступать в качестве ловушки оксида азота. .
динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), вводимые в организм
животных, разрушаются ДЭТК с образованием парамагнитных
мнкж-дэтк.
ЛПС резко усиливает образование МНКЖ-ДЭТК, что обусловлено усилением синтеза N0, осуществляемого iNOS.
введение железа (II) усиливает синтез N0 в организме животных.
введение тиосульфата в организм животных, обработанных ЛПС, приводит к стабилизации эндогенных ДНКЖ и возможности их регистрации методом ЭПР.
— проведенные исследования показывают, что ДНКЖ могут возникать в
организме животных при участии оксида азота, образующегося по L-
аргинин-зависимому пути. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 106 страницах текста, содержит 3 таблицы, 15 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, списка литературы (14Q источника).
