Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 7
1.1. Пластичность нервной системы 7
1.1.1. Проблемы пластичности нервной системы 7
1.1.2. Строение и морфологическая изменчивость синапсовэлементов пластичности нейронов 9
1.1.3. Длительная потенциация как проявление пластичности нервной ткани 19
1.1.4. Роль акина в синаптической пластичности 25
1.2. Маутнеровские нейроны, как объект для изученияп ластичности 29
1.2.1. Структура и функция Маутнеровского нейрона 29
1.2.2. Морфофункциональные исследования Маутнеровскихнейронов рыб и амфибий 34
2. Объекты и методы исследования 38
2.1. Объекты исследования 3 8
2.2. Естественная стимуляция Маутнеровских нейронов 38
2.3. Адаптация МН к длительной естественной стимуляции 39
2.4. Оценка функционального состояния Маутнеровских нейронов по поведению рыб в кольцевой камере 39
2.5. Электрофизиологические методы исследования 41
2.6. Электронно-микроскопические методы 43
2.7. Морфометрический анализ 44
2.8. Аппликация на МН веществ, полимеризующих и деполимеризующих актин 45 2.8.1. Аппликация цитохалазина D на МН 45
2.8.2. Аппликация фаллоидина на МН 45
2.9. Опыты с маркером фаллоидин коллоидное золото 46
2.10. Цитохимический метод изучения синаптических контактов МН 46
Обсуждение 73
Выводы 78
Приложение 79
Список литературы 87
- Маутнеровские нейроны, как объект для изученияп ластичности
- Естественная стимуляция Маутнеровских нейронов
- Оценка функционального состояния Маутнеровских нейронов по поведению рыб в кольцевой камере
- Опыты с маркером фаллоидин коллоидное золото
Введение к работе
Нервная система играет важнейшую роль в процессе взаимодействия между живыми организмами и средой их обитания. В основе такого взаимодействия лежит способность нервной системы приобретать, хранить и воспроизводить информацию о прошлом опыте. Эта способность обеспечивается пластичностью нейронов, т.е. их способностью изменять реактивность под влиянием последовательных раздражений рецептивных органов. [Конорски, 1970]. Однако клеточные механизмы, лежащие в основе пластичности, как отдельного нейрона, так и синапсов, изучены недостаточно хорошо.
В настоящее время большинство нейробиологов считает, что суть памяти, а в более широком смысле - адаптации нервной системы к повторяющимся стимулам - заключается в длительных изменениях эффективности межнейрональных взаимодействий, которые осуществляются через синапсы. Реальные доказательства этого положения отсутствуют. С другой стороны, известны модельные (искусственные) формы стойкого изменения синаптической функции - долговременная потенциация (ДП) и долговременная депрессия (ДД), участие которых в модификации естественного поведения животных тоже не доказано.
ДП тесно связана с адаптацией нервной системы к воздействию внешней среды [Wickens, 1988; Calvarley, Jones, 1990; Stevens, 1996]. Возможно, ДП является физиологической основой для определенных видов естественной адаптации, обучения и памяти [Stevens, 1998]. Возлагались определенные надежды на то, что ее всестороннее исследование объяснит, как осуществляется обучение и запоминание в нейронах на функциональном, структурном и молекулярном уровнях. Вместе с тем, со времени открытия ДП [Брагин, Виноградова, 1973; Bliss, Lomo, 1973], несмотря на многочисленные данные о ее механизмах, участие ДП в памяти до сих пор остается неясным. Вовлечение модельных форм памяти, чаще всего ДП и ДД, в формирование естественной памяти пытаются выявить, используя
преимущественно различные физиологические и фармакологические
подходы JBaudry, 2000; Абрамцев, 2000; Большаков, 2001], Пока к особому
успеху это не привело. Морфофункциональные исследования
взаимоотношения модельных и естественных форм памяти на системном
уровне или на целостном мозге и его крупных отделах тоже оказались
непродуктивными [Bailey, 1999; Thomson, 2000]. Это связано с
чрезвычайной сложностью организации нервных центров, в которых их
изучают, и невозможностью точно определить вклад функции этих центров
в естественное поведение. По нашему мнению, адекватным объектом для
этих целей могут служить Маутнеровские нейроны (МН) золотой рыбки,
имеющие определенную и легко регистрируемую экспериментально
изменяемую функцию, проявляемую в специфическом поведении. В них
удалось обнаружить различные виды естественной и искусственной
(модельной) пластичности: модификацию поведения, обусловленную
изменениями функционального состояния МН, ДП и ДЦ смешанных
синапсов, адаптацию (депрессию) химических синапсов [Мошков, 1985;
Yang, Faber, 1990; Yang et al., 1991; Павлик, 1997, 1999; Moshkov et. al.,
1998; Oda et. al., 1998; Faure, 2000]. Остается непонятной роль элементов
синапсов, вовлекаемых в повышение проводимости при ДП. Неизвестно,
вовлекается ли ДП в адаптацию, естественную модификацию функции МН.
Для понимания роли различных синаптических структур в регуляции
функционирования мозга необходимы сравнительные
морфофункциональные исследования механизмов ДП и естественной адаптации.
Такая постановка проблемы обозначила цель работы - определить специфические ультраструктурные признаки посттетанической (модельной) ДП в смешанных синапсах МН, а затем исследовать, не обнаруживаются ли они в этих синапсах при естественно выработанной модификации функции, проявляемой в свободном поведении рыбок.
Были поставлены следующие задачи:
Изучить ультраструктуру МН золотой рыбки в двух функциональных состояниях: ДП электротонического ответа (модельной формы памяти) и адаптации (естественной формы памяти).
Выявить похожие структурные изменения в афферентных смешанных синапсах.
Произвести сравнительный качественный и количественный ультраструктурный анализ контактов афферентных смешанных синапсов и других структурных изменений (мостиков).
Научная новизна работы. Впервые в сравнительном аспекте изучена ультраструктура МН золотой рыбки в двух функциональных состояниях: ДП электротонического ответа, модельной формы синаптической памяти, и адаптации, резистенции к утомлению, естественной формы нейрональной памяти. В обоих случаях в щели десмосомоподобных контактов (ДПК) афферентных смешанных синапсов МН выявлено пропорциональное увеличение числа фибриллярных мостиков. Показано, что фибриллярные мостики в щели ДПК смешанных синапсов являются специфическим признаком, отличающим их от ДПК химических синапсов. Впервые с помощью метки фаллоидин — золото установлено, что мостики содержат филаментозный (Ф-) актин. При сравнительных цитохимических исследованиях пироантимонатным методом локализации ионов кальция в смешанных синапсах адаптированных МН, а также при аппликации блокатора или активатора проницаемости щелевых контактов (ЩК) впервые показано, что ЩК при адаптации оказываются заблокированными, индикатором чего было заполнение щели ЩК плотными преципитатами, отсутствующими в контроле и при усилении проводимости. В то же время мостики в щели ДПК интенсивно декорировались преципитатом. Это указывало на вероятность функционирования мостиков в этих условиях как своеобразных катионных транссинаптических шунтов. Обнаружение структурного признака ДП, имеющего, по-видимому, такие же
функциональные последствия и в смешанных синапсах адаптированных МН, дает основание предположить, что ДП, модельная форма пластичности, может быть естественным свойством нервной системы.
Маутнеровские нейроны, как объект для изученияп ластичности
Выбор объекта при исследовании различных проблем нейробиологии имеет важное значение. В настоящее время накоплено много данных, касающихся ультраструктурных перестроек, возникающих под воздействием разнообразных природных естественных, и экспериментальных условий. Эти результаты получены в основном на мозговых структурах или на клеточных популяциях, состоящих из большого числа нейрональных элементов, гетерогенных и по морфологии, и по функции [Боголепов, 1975]. Однако обилие и сложность связей между клетками, недостаточность знаний об их исходном состоянии, невозможность контролировать одну и ту же клетку от опыта к опыту создают затруднения в получении однозначных результатов [Бабминдра, 1980; Мошков, 1985]. В этом отношении удобным объектом в разнообразных нейробиологических исследованиях служат Маутнеровские нейроны (МН) костистых рыб и амфибий. Эти нейроны отличаются рядом уникальных свойств: 1) они имеют большие размеры, вместе с дендритным деревом - более 0.5 мм и потому достаточно легко доступны для прямого экспериментального вмешательства [Diamond, 1971; Eaton et. al., 1981; Zottoli et. al., 1987; Canfield, Rose, 1993]. 2) они легко фиксируются для последующего морфологического анализа и идентифицируются на гистологических срезах [Ниукканен, Мошков, 1977]. 3) их парное расположение в мозге, по одному в каждой половине, позволяет, стимулируя один нейрон, сравнивать его с зеркальным двойником, не подвергавшимся воздействию [Retzlaff, Fontaine, 1960]. 4) каждый МН представляет собой двигательный центр, собственно командный нейрон [Cochran, 1980]. Он получает массу афферентных входов и контролирует плавательную активность рыб, управляя движением хвостового плавника, инициирует унилатеральный удар хвостового плавника [Eatonn et al., 1981], главного движения рыб [Gray, 1933].
Это позволяет судить о функциональных изменениях в нейронах по поведению животного и направленно влиять на него различными экспериментальными воздействиями [Мошков, 1985]. Таким образом, эти клетки очень удобны для проведения совместного морфофункционального исследования, одинаково доступны для электронномикроскопи-ческого методов анализа. Маутнеровские нейроны - две гигантские клетки симметрично расположенные в продолговатом мозге рыб и личинок амфибий, были названы в честь немецкого ученого Маутнера, который впервые описал их гигантские аксоны в спинном мозге щуки [Mauthner, 1859] (рис. 6). С того времени морфологическим исследованиям этих нервных клеток у различных представителей низших позвоночных посвящено бесчисленное число работ [Stefanelli, 1951; Diamond, 1971; Pastor et al., 1994]. He уменьшается поток публикаций и по настоящее время, что вызвано непрекращающимся интересом ученых к этому уникальному объекту, позволяющему изучать самые различные проблемы нейробиологии. Основные вопросы, рассматриваемые в морфологических работах на МН касаются распространенности этих нейронов у животных разных видов и классов, видоспецифических различий морфологии, размеров и топографии МН и их основных элементов [Bodian, 1937; Stefanelli, 1951; Otsuka, 1964; Zottoli, 1978; Hackett er al., 1979; Stefanelli, 1980]. Эти данные послужили весьма ценным материалом для обоснования представлений о предполагаемых функциях МН задолго до того, как появилась возможность прямой электрофизиологической регистрации активности этих нейронов и ее последствий в моторных актах животного. В настоящее время известно, что Маутнеровская клетка рыб состоит из 4-х основных частей - клеточного тела (сомы), имеющего максимальный диаметр 60 мкм, а длину 100 и более мкм, аксона, распространяющегося от самой клетки в продолговатом мозгу до кончика хвостового плавника и инервирующего мотонейроны спинного мозга [Bodian, 1937], и двух дендритов, латерального и вентрального, отходящих от сомы под углом около 90 друг к другу. Латеральный дендрит простирается от клеточного тела в латеро-каудальном направлении на расстояние около 360 мкм, вентральный - в вентральном направлении на расстояние более 500 мкм, дистальные окончания дендритов имеют несколько бифуркаций [Nakajima, 1974; Kimmel, Schabtach, 1974; Stefanelli, 1980; Zottoli et. al., 1987; Zottoli and Faber, 1999]. Ультраструктура МН амфибий повторяет структуру этих клеток у рыб, главное отличие состоит в том, что у амфибий отсутствует вентральный дендрит. Ультраструктурно МН могут быть уже идентифицированы у 4 - 5 дневных мальков [Stefanelli, Caravita, 1964]. И уже на ранних стадиях личиночного развития эти нейроны получают афферентные синаптические окончания [Мошков и др., 1980]. По ультраструктурным признакам у рыб различают б типов афферентных синапсов на соме и дендритах, у амфибий - по крайней мере 5 типов [Nakajima, 1974; Cochran, 1980]. При этом различные типы синапсов расположены на поверхности МН не случайно, а так, что окончания определенного рода формируют дискретные группы, кластеры; поверхность клетки при этом представляет собой мозаику кластеров. В онтогенезе, по мере развития особи, число синаптических окончаний приходящих на эти нейроны, существенно увеличивается [Мошков и др., 1980; Kimmel et. al., 1981; Мошков, 1985]. На основании комплексных сравнительно - морфологических, экспериментально - эмбриологических и физиологических исследований было выявлено, что развитие МН в эволюции низших позвоночных животных связано с общей плавательной активностью, формой тела и способом движения с помощью хвостового плавника [Сахаров, 1961].
Дальнейшее развитие электрофизиологических методов исследования расширило возможности изучения функции МН. Регистрация их спайка и сопоставление активности нейронов показало, что возбуждение единичного МН вызывает сильный удар хвостового плавника в контралатеральную сторону и, как следствие, быстрый бросок животного в сторону [Diamond, 1971; Zottoli etal., 1977]. Таким образом, к уже известным представлениям о функции МН добавилось еще одно - вовлечение их в мгновенную «реакцию страха» (startle - reflex) - комплекс поведенческих реакций животных на быстрый неожиданный, как правило, слуховой стимул [Kimmel et al., 1978; Eaton, Bombardieri; 1978; Foreman, Eaton, 1993; Eaton et al., 1991]. Эти данные подтвердились при использовании метода конфокальной кальциевой регистрации, где активность МН в ответ на стимул регистрировалась по изменению концентрации внутриклеточного кальция [Fetcho, O Malley, 1995; Сох, Fetcho, 1996; O Malley etal., 1996; Ritter, Fetcho, 1998; Liu, Fetcho, 1998].
Естественная стимуляция Маутнеровских нейронов
Сенсорную стимуляцию МН через вестибулярный аппарат, главный источник афферентации МН [Eaton et al., 1988], проводили в специальной установке [Мошков, 1985], вращающей рыб в 2-х плоскостях (рис. 1) со скоростью 42 оборота в минуту. Число вращающихся стаканчиков в установке 7 штук. Каждый стаканчик вращается вокруг своей оси. Объем стаканчика и его геометрические размеры (диаметр - 3 см; высота - 7 см) позволяют одновременно помещать в один стаканчик 2 рыбки. Таким образом, общее количество рыбок, одновременно подвергаемых стимуляции, составляет 14 штук. Стенки стаканчика, изнутри совершенно гладкие, изготовлены из пластмассы и имеют множество отверстий для свободного доступа воды. Предварительные испытания показали отсутствие травматичности для рыб, длительного воздействия вертушки и безопасность для рыб во время длительно пребывающих в стаканчиках без вертушки. Скорость вращения и продолжительность стимуляции были установлены ранее как наиболее соответствующие и адекватные для максимально полного вовлечения вестибулярных рецепторов полукружных каналов внутреннего уха рыб, чтобы максимально стимулировать МН. Для выработки адаптации МН использовали тренинг, систему воздействий, которые делают структуру и функцию МН устойчивыми к длительной естественной стимуляции [Тирас и др., 1995]. Методика основана на дозированном раздражении вестибулярного аппарата, главного афферентного входа МН [Zottoli, Faber, 1979] путем вращения рыб в двух плоскостях. Адаптацию проводили в той же установке, которая использовалась для естественной стимуляции МН, по модифицированной схеме. Рыбок в течение 15 дней, 2 раза в сутки, утром и вечером, подвергали коротким стимуляциям, с каждым разом, удлиняющимся на 1 минуту. В первый день она продолжалась 1 мин. утром и 2 мин. вечером, интервал составлял 9 часов.
Во второй день - 3 мин. утром и 4 мин. вечером, и т.д., до 30 мин. на 15 сутки. Оценку адаптации проводили через 3 суток после окончания стимуляций путем наблюдения активности рыбок до и после длительной вестибулярной стимуляции и сравнения ее с аналогичными данным, полученными на интактных рыбках. Утомление МН индуцировали непрерывной 2-х часовой стимуляцией. Оценку функциональной активности МН проводили косвенным путем по поведению рыбки в кольцевой камере (рис. 2) [Мошков, Подольский и др. 1982], подсчитывая в течение 10 мин. число поворотов, совершаемых рыбкой с помощью унилатерального удара хвостового плавника, инициируемого активацией МН [Canfieldetal., 1993]. Кольцевая камера имеет круговой канал 18 мм шириной, высота уровня воды 25 - 30 мм. Дно камеры разделено на 8 равных секторов. В описанной камере рыбы спонтанно передвигаются по кругу и периодически меняют направление движения -поворачиваются. Таким образом, наблюдая за поведением рыбки, есть возможность измерять количественно скорость ее движения, и, кроме того, частоту поворотов. Обе формы движения являются стереотипной двигательной реакцией рыб. Тест двигательной активности заключается в следующем: рыбку помещали в камеру и за каждые 30 секунд времени измеряли визуально два показателя - число пройденных секторов и частоту совершенных поворотов или смен направлений движения. Продолжительность тестирования во всех экспериментах была 10 минут. Тестирование рыб в одной серии экспериментов проводили в одно и то же время, чтобы максимально сократить разброс количественных данных, так как двигательная активность животных существенно зависит от того, в какое время суток проводится тестирование.
Многолетние морфо-функциональные эксперименты на рыбках с использованием кольцевой камеры и последующие изучения ультраструктуры выявили прямую корреляцию функционального состояния МН (степень утомления) и количеством совершаемых рыбкой поворотов в единицу времени. Пример регистрации адаптированного состояния МН косвенным методом представлен на рис. 3. В настоящее время установлено, что такая косвенная неинвазивная регистрация функции МН in vivo тесно коррелирует с электрической активностью тех же нейронов, регистрируемой в виде спайка в электрофизиологических экспериментах in vitro [Михеева, 1999; Тирас и др., 2002]. Пример прямой регистрации адаптированного состояния МН представлен на рис. 4. Рис. 3. Проявление адаптированного состояния МН в поведении золотой рыбки. Видно, что в то время как интактные рыбки. утомляются после 2-х часовой сенсорной стимуляции, адаптированные рыбки остаются нечувствительными к ней. - достоверно отличается от контрольных значений, р 0,05.
Оценка функционального состояния Маутнеровских нейронов по поведению рыб в кольцевой камере
Для электронномикроскопических исследований часть контрольных и подопытных рыбок декапитировали, быстро выделяли мозг и сразу помещали его в каплю фиксирующего альдегидного раствора под бинокуляр. Из продолговатого мозга вырезали участок, содержащий Маутнеровские нейроны, и немедленно погружали его в фиксирующий раствор большого объема, составленный по прописи Piccard (1976) с некоторыми модификациями, разработанными в нашей лаборатории.
Использовали фиксатор следующего состава: 4% параформ на 0.1 М какодилатном буфере 5,6 мл, диметилсульфоксид 0.25 мл, 25 % глутаральдегид 2.04 мл, 1 М какодилатный буфер 0.44 мл, вода дистиллированная 1.57 мл, рН раствора 7.2 - 7.4. Фиксацию в этом растворе продолжали не менее 12 часов при комнатной температуре. После промывки 0.1 М какодилатным буфером, кусочки мозга дофиксировали 2-3 часа в 2 % растворе четырехокиси осмия на том же буфере, обезвоживали их в спиртах возрастающей концентрации 50, 70, 90 и 100 % (по 15-20 минут) ив 100 % ацетоне (3 смены по 30 минут). Затем пропитывали смесью ацетон - эпон в пропорции 3 : 1 первые сутки и 1 : 3 вторые сутки, после этого образцы заключали в Эпон - 812. Полимеризацию проводили в течение 24 часов в термостате при 37 и последующие 24 часа при 60. Полученные эпоновые блоки резали фронтально на пирамитоме LKB для гистологического изучения. Изготовленные срезы толщиной 10 мкм помещали на-предметное стекло и изучали под световым микроскопом NU - 2Е. Срезы, содержащиесому, латеральный и вентральный дендриты нейрона, переклеивали на эпоновые столбики и готовили ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома LKB - 3 с тепловой подачей ножа. Срезы переносили на сеточки, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата (1.5-2 часа при 137 С) и 20 - 40 мин при комнатной температуре цитратом свинца по Рейнольдсу [Reynolds, 1963]. Препараты просматривали и фотографировали в электронном микроскопе TESLA BS - 500 при увеличении 10000 и 14000х,
Электронномикроскопические исследования МН в переживающих срезах проводили после электрофизиологической регистрации их активности. После инкубации, тетанизации и идентификации ДП в течение 2-х часов срезы переносили в фиксирующий раствор. При оценке ультраструктуры МН в качестве контроля использовали срезы продолговатого мозга, не подвергаемые стимуляциям, находящиеся в инкубационной камере то же время, что и подопытные срезы.
Для морфометрического анализа при одном и том же увеличении фотографировали аксонные окончания, расположенные по периметру плазматической мембраны МН. Отбирали только те бутоны, которые одновременно содержали активные зоны (A3), демосомоподобные контакты (ДПК) и щелевые контакты (ЩК), наиболее надежный критерий идентификации синапсов химического типа (A3 + ДПК) и смешанного типа (ДПК + ЩК) МН. Негативы проецировали на экран установки Микрофот (Carl Zeiss), непосредственно на нем производили измерения при окончательном увеличении структур в 90000 раз. РЬмеряли протяженность сечения всего синаптического контакта (прилегания смешанного или химического синапсов к поверхности дендрита), длину индивидуальных профилей специализированных контактов — A3, ЩК и ДПК, число исуммарную длину их в пересчете на синапс. Подсчитывали так же число мостиков в ДПК. Морфометрические данные обрабатывали стандартными статистическими методами.
Хроматографически чистый цитохалазин D (Calbiochem, США) растворяли до концентрации 4 мкг/мл в физиологическом растворе с добавлением диметилсульфоксида до конечной концентрации 0,25 % и при холодовой анестезии в объеме 5 мкл апплицировали на МН. Контрольным рыбкам на МН апплицировали физиологический раствор. Примерно через 20 часов после инъекции мозг выделяли. Электрофизиологическую часть выполняли по выше описанной методике.Хроматографически чистый фаллоидин (Sigma, США) разводили в дистиллированной воде до концентрации 10 мг/мл. Раствор фаллоидина объемом 5 мкл при холодовой анестезии апплицировали на МН. Контрольным рыбкам вводили равный объем дистиллированной воды. Мозг выделяли через 5 часов после аппликации. При проведении электрофизиологических исследований применяли метод изучения влияния парных стимулов на эффективность синаптической передачи в смешанных синапсах [Павлик и др., 2003].
Декорацию маркером фаллоидин - коллоидное золото с размером частиц 15нм проводили по ранее описанному методу [Lachapelle, 1988]. Для выявления актина на ультратонких срезах МН мозг фиксировали в растворе 2% параформа и 0,1% глутаральдегида и заключали в смолу LR-White или К4М.
Опыты с маркером фаллоидин коллоидное золото
Качественный анализ ультраструктурных данных показывает, что 7-ми часовая инкубация не оказывала значительного разрушительного воздействия на нейроны и афферентные смешанные синапсы (приложение, рис. 12 а). Это касается как клетки в целом, так и тонкой структуры митохондрий, ретикулума, цитоскелета и специализированных синаптических контактов. Тетанизация, индуцирующая увеличение проводимости смешанных синапсов на 75% и на 90%, не приводила к существенным структурным изменениям афферентных бутонов. Тем не менее, в прилегающей дендроплазме наблюдалась вакуолизация, которая прогрессировала с возрастанием силы стимуляции: цитоплазма повреждалась больше при более высоком уровне потенциации. Кроме этого, тетанизация влияла и на ультраструктуру специализированных синаптических контактов. Контакты, имеющие после длительной инкубации вид, близкий кинтактному, после стимуляции изменялись: цитоплазма вблизи контактов просветлялась, очертания мембран становились более извитыми. Такое просветление цитоплазмы позволило увидеть контакт ДПК с цитоскелетными структурами бутона. Более наглядно это прослеживалось при высоких уровнях потенциации. Другой особенностью потенциированных синапсов была опушенность щелевых контактов, которая усиливалась с ростом уровня потенциации. Такое же опушение ЩК мы наблюдали после аппликации фаллоидина на МН, которая сама по себе приводила к усилению электротонической проводимости смешанных синапсов [Павлик, Дзебан, 2003]. Учитывая свойство фаллоидина специфически и избирательно полимеризовать актин и вызывать близкое к потенциации функциональноесостояние, можно предположить, что опушение ЩК при потенциации вызвано изменением агрегатного состояния примембранного актина в этой зоне синаптического контакта.
В таблице 1 представлены результаты количественного анализа основных компонентов смешанных синапсов после длительной инкубации (контроль) и тетанизации, вызывающей потенциацию различного уровня (75% и 90%) (опыт).
При изучаемых в данной работе уровнях потенциации синапсы характеризовались уменьшением средней протяженности их профилей прилегания к дендриту на 35% и 29% соответственно. В обоих случаях почти на 30% снижалось среднее число ДПК в синапсе и на 24% и 21%, соответственно, падала протяженность сечений индивидуальных ДПК. Примерно так же изменялись размеры ЩК, среднее число которых в потенциированных синапсах снижалось примерно на 30% по сравнению с контролем. Средняя протяженность профилей ЩК при высоком уровне потенциации оставалась такой же, как и после инкубации, однако при среднем уровне потенциации она уменьшалась почти на 30%. Таким образом, мы наблюдали существенные сдвиги в структуре контактных специализаций смешанных синапсов, которые могут принимать участие в передаче электротонических сигналов через синапс на МН.Это в первую очередь уменьшение размеров ЩК, главных участников процесса электрической межклеточной коммуникации [Bruzzone et al., 1996], а также ДПК, участие которых в указанных процессах сигнализации было предположено ранее [Moshkov et al., 1998] на основании ряда экспериментальных данных. Из полученных в настоящей работе результатов изучения структуры специализированных контактов видно, что при возрастании электротонической проводимости смешанных синапсов размер ЩК уменьшается весьма значительно, что не укладывается в представления об их исключительной роли в создании и поддержании электротонической связи в этих типах межклеточных соединений. То же можно сказать и о ДПК, если судить об их протяженности. В то же время обнаружилось, что изменение одного из ультраструктурных параметров прямо коррелирует с увеличенной электротонической проводимостью синапсов.
В щели ДПК нами выявлены фибриллярные мостики, соединяющие пре- и постсинаптические мембраны под некоторым углом (приложение, рис. 12 а). Тонкая структура мостиков однообразна. Как правило, диаметр формирующей его фибриллы соизмерим с толщиной мембраны. Чаще всего на один профиль ДПК (из тех, где мостики обнаруживались) приходится один мостик. Вместе с тем, попадались ДПК с двумя мостиками, которые располагались близко или далеко друг от друга, под углом или параллельно. Встречались ДПК с несколькими мостиками.
Потенциированные синапсы по сравнению с контролем характеризуются качественно, во-первых, увеличенным количеством мостиков в ДПК, во-вторых, повышенным диаметром фибрилл, в-третьих, появлением парных мостиков (приложение, рис, 12 б). В этих случаях пары фибрилл следуют параллельно друг к другу с примерно равным небольшим промежутком. Другой особенностью мостиков ДПК потенциированных синапсов было различие диаметров фибрилл по их длине.
При подсчете мостиков видно, что их количество в щели ДПК смешанных синапсов при ДП увеличивается в 2,5 раза по сравнению с инкубированнымконтролем, в то же время протяженность ДПК при ДП снижается (таблица 1). Такая изменчивость этих контактов отмечена ранее как реакция на инкубацию и стимуляцию [Мошков и др., 1997; Тирас и др., 2002]. В то же синапсах потенциированных МН, наоборот, увеличивается почти на 12%, хотя тетанизация не затрагивала передних
