Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 12
2.1. Общие сведения о полиовирусс 12
2.2. Модели генетической рекомбинации 13
2.3. Доказательства существования репликативной рекомбинации между молекулами РНК 18
2.4. Возможные механизмы репликативной рекомбинации 27
2.5. Возможные механизмы расщепления и лигирования молекул РНК 33
2.6. Доказательства существования нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК 37
3. Материалы и методы 45
3.1. Ферменты и реактивы 45
3.2. Плазмида 45
3.3. Бактериальный штамм 45
3.4. Синтетические олигонуклеотиды 46
3.5. Базовые методы молекулярного клонирования 48
3.6. Получение плазмидных конструкций, содержащих кДНК фрагментов 53
3.7. Получение полноразмерных транскриптов 59
3.8. Модификации концевых нуклеотидов транскриптов 61
3.9. Анализ вирусных клонов 65
3.10. Определение нуклеотидной последовательности RT PCR-фрагментов и плазмидной ДНК 69
3.11. Моделирование вторичной структуры РНК 70
4. Результаты 71
4.1. Конструирование 5'- и З'-фрагментов РНК полиовируса, точно дополняющих друг друга 72
4.2. Образование рекомбинантов между 5'- и З'-фрагментами РНК полиовируса, точно дополняющими друг друга 79
4.3. Конструирование 5'- и З'-фрагментов РНК иолиовируса, имеющих область перекрывания 86
4.4. Образование рскомбинантов между 5'- и З'-фрагмснтами РНК полиовируса, имеющих область перекрывания 87
4.5. Отклонение от точности при образовании рекомбинантов между фрагментами РНК полиовируса 91
5. Обсуждение результатов 99
5.1. Доказательство существования нерепликативной рекомбинации между фрагментами РНК полиовируса 99
5.2. Лигирование фрагментов РНК полиовируса 101
5.3. Рекомбинация между перекрывающимися фрагментами РНК полиовируса 104
5.4. Точность при образовании рекомбинантов между фрагментами РНК полиовируса 107
5.5. Репликативная и нерепликативная рекомбинация у РНК-содержащих вирусов 113
5.6. Биологическая значимость нерепликативной рекомбинации между молекулами РНК 117
Выводы 119
- Модели генетической рекомбинации
- Плазмида
- Образование рекомбинантов между 5'- и З'-фрагментами РНК полиовируса, точно дополняющими друг друга
- Лигирование фрагментов РНК полиовируса
Модели генетической рекомбинации
Несмотря на то, что первые указания на существование рекомбинации между молекулами РНК были получены еще 40 лет тому назад (Hirst, 1962; Ledinko, 1963), до настоящего времени биохимические процессы, приводящие к появлению рекомбинантной РНК, остаются малоизученными. Хотя было проведено много экспериментов и выдвинуто немало гипотез, объясняющих это явление, в большинстве случаев полученные результаты не позволяли сделать строгие выводы о механизме рекомбинации. Теоретически можно предложить два принципиально разных пути, по которым могут идти геномные перестройки, - репликативный и нерепликативный (рис. 2.1). При репликативном способе происходит смена матрицы: синтез комплементарной цепи начинается на одной молекуле, а заканчивается на другой. Этот путь в литературе упоминается как модель «смена матрицы». С другой стороны, при нерепликативиом способе образование рекомбинантной молекулы происходит в результате разрыва и лигирования предварительно синтезированных молекул - модель «разрыв-лигирование». Теоретически на основе обеих моделей можно объяснить образование одинаковых рекомбинантных молекул. Отличие заключается в материале, из которого построен рекомбинант: в первом случае он состоит из новосинтезированных последовательностей, тогда как во втором - из фрагментов родительских молекул. Ранее такую проблему решали при выяснении механизма гомологичной рекомбинации ДНК. Поскольку для гомологичной рекомбинации необходима точная стыковка родительских последовательностей, второй путь казался маловероятным, так как трудно было придумать механизм, обеспечивающий согласованный разрыв обеих родительских молекул в одинаковых точках. Однако впоследствии выяснилось, что именно этот способ играет основную роль в рекомбинации ДНК (гомологичной и негомологичной), и что рекомбинация ДНК является сложным процессом, катализируемым рядом белков и не требующим согласованного разрыва родительских молекул (Грагеров, 1990). Вклад репликативного механизма в рекомбинацию ДНК в физиологических условиях еще предстоит определить. В то же время, было получено экспериментальное доказательство смены матрицы при репликации ДНК. Было показано, что в условиях PCR благодаря периодическому повышению температуры с целью расплавления ДНК-дуплексов, недостроенные растущие цепи оказываются в одноцепочечном состоянии и в следующем цикле могут служить праймерами для синтеза рекомбинантиых молекул (Frohman and Martin, 1990). При рекомбинации РНК теоретически также возможны оба этих пути и, как в случае ДНК, гомологичную рекомбинацию легче объяснить с помощью смены матрицы.
Однако, в отличие от ДНК, эта проблема пока не решена. В то же время, отсутствие хорошо охарактеризованных ферментативных систем, способных расщеплять и лигировать различные фрагменты вирусных РНК, и наличие множества свидетельств, указывающих на связь рекомбинации РНК с синтезом РНК, привели к тому, что модель «смена матрицы» на сегодняшний день стала общепринятой. И с ее помощью начали объяснять не только случаи гомологичной рекомбинации РНК (Kirkegaard and Baltimore, 1986; Cascone et al., 1990; Nagy and Bujarski, 1995; Gal-On et al., 1998), но и множество примеров негомологичной рекомбинации (Li and Ball, 1993; Raju et al., 1995; Hajjou et al., 1996; Figlerowicz, 2000). Согласно репликативной модели, при рекомбинации РНК (Cooper, 1977) может происходить следующее. После того, как РНК-зависимая РНК-полимераза (далее РНК-полимераза) начала синтез комплементарной цепочки на З -конце молекулы РНК, процессивная элонгация цепи по какой-то причине может приостановиться. Далее незаконченная рождающаяся цепь вместе с РНК-полимеразой (или без нее) диссоциирует от матрицы, а затем служит затравкой для возобновления синтеза на другой матрице (или с «неправильного» места на той же матрице). В рамках этого сценария, РНК-полимераза также может использовать в качестве праймеров фрагменты РНК, образующиеся после нуклеолитической деградации вирусной РНК (Agol, 1997). Однако диссоциация вновь синтезируемой цепи не всегда является обязательным условием для рекомбинации. Так, например, Kuge et al. (1986) постулирует, что донорный и акцепторный участки родительских матриц (или матрицы) могут быть сведены и зафиксированы вместе поддерживающей последовательностью. В этом случае РНК-полимераза может сменить матрицу методом «шунтирования», а не диссоционно-ассоционным механизмом. Хотя до недавнего времени нерепликативная рекомбинация РНК считалась событием маловероятным, были получены первые свидетельства в ее пользу (Chetverin et al., 1997; Gmyl et al, 1999). Образование рекомбинантов по нерепликативному пути происходит через расщепление и лигирование предварительно синтезированных молекул РНК. Процессы расщепления и лигирования могут происходить как взаимосвязано, так и независимо друг от друга (Chetverin et al., 1997; Gmyl et al., 1999). В первом случае, расщепление и лигирование молекул РНК происходят одновременно, и образование одной фосфодиэфирной связи непосредственно связано с разрывом другой фосфодиэфирной связи. Во втором случае, стадия расщепления предшествует стадии лигирования молекул РНК, при этом образование и разрыв фосфодиэфирных связей не взаимосвязаны. В образование разрывов и лигирование молекул РНК могут быть вовлечены ферментативные активности, обладающие РНКазными и РНК-лигазными свойствами. Эти активности могут быть как белковой, так и РНК-природы (Agol, 1997). В то же время, образование рекомбинантов нерепликативным путем может происходить и без участия такого рода активностей (Chetverina et al., 1999).
Надо отметить, что обе представленные модели могут объяснить не только образование рекомбинантов, но и другие ковалентные перегруппировки (делении, вставки), возникающие у вирусных РНК-геномов. Так как на сегодняшний день репликативная модель получила широкое признание, сначала рассмотрим доказательства в ее пользу. Доказательства существования репликативной рекомбинации между молекулами РНК Для многих вирусов было показано, что они имеют высокую частоту рекомбинации (Lai, 1992; Simon and Nagy, 1996; Agol, 1997). Это наблюдение позволило разработать модельные системы для изучения механизмов рекомбинации. Примерами таких систем являются системы на основе вируса полиомиелита, коронавирусов, вируса мозаики костра (Brome mosaic virus -BMV), вируса скрученности турнепса (Turnip crinkle virus - TCV). На сегодняшний день в каждой из этих модельных систем были получены данные, свидетельствующие в пользу существования репликативной рекомбинации между молекулами РНК. а) Рекомбинация РНК может быть связана с синтезом РНК В пользу того, что рекомбинация РНК может быть связана с синтезом РНК, говорят данные Kirkegaard and Baltimore (1986). Авторы изучали рекомбинацию РНК in vivo между полиовирусом дикого типа и вирусом, содержащим мутации по двум разным локусам, один из которых определял устойчивость к гуанидину, а другой - термочувствительность. При использовании непермиссивных условий для репликации вирусов были получены результаты, указывающие на то, что для образования рекомбинантных вирусов важен синтез РНК. Эти данные согласуется с моделью «смена матрицы». В пользу того, что рекомбинация между молекулами РНК и вирусная репликация могут быть связанными процессами, говорят также данные, полученные Eggcr and Bienz (2002). Авторы изучали рекомбинацию между иолиовирусными молекулами РНК в смешанных репликативных комплексах. При заражении клеток двумя штаммами полиовируса образовывались смешанные репликативные комплексы, включающие РНК от обоих штаммов. Было показано, что первые рекомбинаитные цепи РНК могут быть обнаружены только с началом репликации РНК в таких репликативных комплексах.
Плазмида
Все использованные в работе рестриктазы и ферменты нуклеинового обмена были произведены фирмами "Promega" и "Gibco BRL". В работе, как правило, использовали реактивы фирм Fluka, Serva, Merk и др., а также отечественные категории "о.с.ч". Фенол и этиловый спирт перед использованием дополнительно перегоняли. 3.2. Плазмида PT7PV1 Плазмида pT7PVl (Van der Werf et al., 1986), любезно предоставлена Э. Виммером. Она состоит из трех функционально важных участков: 1. Фрагмента плазмиды pBR322 между сайтами ВатШ (375) и EcoRl (4360). Этот участок содержит информацию, необходимую для автономной репликации плазмиды в Е. coli, а также ген атрг. 2. Фрагмента, содержащего транскрипционный промотор для РНК полимеразы фага Т7. 3. Полной кДНК вируса полиомиелита типа 1 Mahoney. 3.3. Бактериальный штамм ". С0//НВ1О1: F , ІеиВб, ргоА2, гесАІЗ, thil, ara-14, lacYl, galK2, xyl-5, mtl-1, rpsL.20, Г, supE44, hsdS20(r B, пг в) - хорошо растет и эффективно трансформируется описанным ниже методом. Наличие мутации гесА снижает частоту рекомбинации. Фенотип F" исключает возможность конъюгации. 3.4. Синтетические олигонуклеотиды Использованные в работе олигонуклеотиды синтезированы в фирме Синтол (Москва). Приготовление компетентных клеток Е. coli НВ101 Клетки НВ101 высевали штрихом на чашку с агаризованной средой LM (1% Bacto триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 10 гаМ NaCl, рН 7,5). На следующий день отдельную колонию высевали в 3 мл среды SOB (2% Bacto триптона, 0,5 % дрожжевого экстракта, 10 mM NaCl, 2,5 тМ КС1, рН 7,5) и растили ночь при 37С, непрерывно встряхивая в ротационной качалке. 250 мкл ночной культуры пересевали в 50 мл среды SOB и инкубировали на качалке при 37С до тех пор, пока титр клеток не достигал 4-7x107 на 1 мл. Для этого определяли оптическую плотность при Я.=550 нм. Нужному титру соответствует оптическая плотность (D550), равная 0,5. Клетки осаждали центрифугированием в стерильных пробирках при 3500 g в течение 15 мин. Осадок тщательно суспендировали стерильной пипеткой в 22,5 мл буфера RF1 (100 mM RbCb, 50 тМ МпСЬ, 30 тМ ацетата калия, 10 mM СаСЬ, 15% глицерина, рН 5,8) и выдерживали 120 мин в ледяной бане. После этого клетки снова собирали центрифугированием в том же режиме, суспендировали в 4 мл буфера RF2 (10 mM MOPS, 10 тМ RbCh, 75 тМ СаСЬ, 15% глицерина, рН 6,8) и инкубировали 30 мин в ледяной бане.
Суспензию клеток расфасовывали по 200 мкл в стерильные пробирки и хранили при -70С. б) Трансформация компетентной культуры клеток плазмидной ДНК К 200 мкл компетентных клеток добавляли раствор ДНК (до 1 мкг в обьеме до 25 мкл), тщательно перемешивали стерильным наконечником и оставляли в ледяной бане на 30 мин. Затем пробирку переносили в водяную баню с температурой 42С на 2 мин, после чего охлаждали в ледяной бане в течение 3 мин, добавляли 800 мкл среды SOB и инкубировали в термостате при 37С 1 ч. После этого бактерии высевали на чашки с агаризованной средой LM, содержащей 10 mM MgSC 4 (для HB10I) и 50 мкг/мл ампициллина. в) Выделение плазмидной ДНК Для выделения плазмид, содержавшихся в выросших на чашках колониях, применяли метод щелочного лизиса. Отдельные колонии высевали в 3 мл среды SOB, содержащей 10 mM MgCh, 10 mM MgS04 и 100 мкг/мл ампициллина и растили ночь при 37С в ротационной качалке. Выросшую культуру переносили в пробирки типа Eppendorf, и клетки осаждали при 12000 об/мин в течение 3 мин. Осадок промывали 500 мкл буфера TNE (10 mM Tris.HCl рН 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA), суспендировали в 100 мкл раствора I (50 mM глюкоза, 25 тМ Tris.HCl рН 8,0, 10 mM EDTA) с 5 мг/мл лизоцима (лизоцим растворяли в растворе I непосредственно перед использованием) и оставляли при комнатной температуре на 30 мин. Затем в каждую пробу добавляли по 200 мкл свежеприготовленного раствора II (0,2 М NaOH, 1%-ный SDS) и аккуратно перемешивали. После 10 минутной инкубации в ледяной бане добавляли по 150 мкл раствора, содержавшего 3 М К+ и 5 М СНзСОО", энергично встряхивали и выдерживали 40 мин при 4С. После этого пробы центрифугировали в течение 15 мин на микроцентрифуге и отбирали супернатант. Нуклеиновые кислоты экстрагировали один раз 500 мкл смеси фенола, насыщенного TNE, с хлороформом (1:1) и осаждали добавлением 1 мл этанола в течение 30 мин при -70С. Осадок собирали центрифугированием на микроцентрифуге в течение 15 мин, промывали 70%-ным этанолом и высушивали в вакуумном эксикаторе. Сухой осадок растворяли в 100 мкл НгО, добавляли 1 мкл РНКазы А (20 мг/мл) и инкубировали 1 ч при 37С. ДНК осаждали добавлением 80 мкл раствора, содержащего 20% полиэтиленгликоля (вес/объем) и 2,5 М NaCl, в течение 1 ч при 4С. Осадок собирали центрифугированием в течение 15 мин, растворяли в 100 мкл НгО, дважды экстрагировали 100 мкл смеси фенола, насыщенного TNE, с хлороформом (1:1) и переосаждали путем добавления 80 мкл 5 М ацетата аммония и 600 мкл этанола в течение 60 мин при -70С или ночи при -20С. Для дальнейшей работы плазмиду осаждали на микроцентрифуге (15 мин), промывали 70%-ным этанолом, высушивали в вакуумном эксикаторе и растворяли в требуемом объеме НгО. г) Полимеразная цепная реакция (PCR) К водному раствору, содержащему 100 нг плазмидной ДНК, добавляли 9 мкл lOxPCR буфера (100 mM Tris-HCl рН 10, 500 тМ КС1, 15 тМ MgCl2, 0,1% желатин), по 0,005 о.е. соответствующих праймеров (обратного и прямого), объем смеси доводили водой до 90 мкл и сверху наслаивали 100 мкл минерального масла. Смесь прогревали 3 мин при 95С, охлаждали до 50С и добавляли 10 мкл Taq-смсси (1 мкл lOxPCR-буфера, 9 мкл смеси 2.5 mM dNTP и 2.5 ед. термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus). Реакционный цикл [20 с при 95С (денатурация), 50 с при 50С (огжиг праймеров) и 30 с при 72С (синтез ДНК)] выполняли 35 раз. Амплифицированную ДНК экстрагировали равным объемом хлороформа и переосаждали равным объемом 5М ацетата аммония и 4 объемами этанола. д)
Обработка плазмидной ДНК рестриктазами К 9-150 мкл водного раствора, содержащего 0,05-30 мкг ДНК (в зависимости от цели рестрикции - анализ клонов, получение фрагментов, подготовка матриц для транскрипции и т. д.), добавляли 1/9 объема соответствующего 10х рестриктазного буфера, 1-100 ед. рестриктазы (в зависимости от количества ДНК и степени ее чистоты) и инкубировали от 1 до 2 часов при температуре 37С. е) Аналитический электрофорез в агарозном геле В зависимости от величины разделяемых молекул, использовали 2%-ный, 1%-ный или 0,8%-ный гели. К рассчитанному количеству порошка агарозы (Sigma type I) добавляли 5 мл 10х буфера ТВЕ (0,9 М Tris, 0,9 М Н3В03, 200 тМ EDTA) и доводили объем водой до 50 мл. Лгарозу расплавляли на кипящей водяной бане и добавляли 3 мкл насыщенного раствора бромистого этидия. Гель заливали в плашку и оставляли застывать при комнатной температуре, вставив гребенку для образования лунок для нанесения образцов. Раствор ДНК перед нанесением на гель смешивали с 1/4 объема буфера для нанесения (5хТВЕ, 30% глицерина, 0.25% бромфенолового синего). Электрофорез проводили в ТВЕ при напряженности 5-7,5 В/см. Для электрофореза РНК в ТВЕ добавляли SDS до 0,01%. ж) Препаративный электрофорез и выделение фрагментов ДНК Препаративный электрофорез проводили в геле из легкоплавкой агарозы (Sigma type VII). Гель готовили так же, как описано в предыдущем разделе. Электрофорез проводили при напряженности 3 В/см, чтобы избежать излишнего выделения тепла. После окончания фореза полосу геля, содержащую нужный фрагмент, вырезали, помещали в стеклянную пробирку, добавляли 5 мл воды и расплавляли в водяной бане при 65С в течение 20 мин. Затем ДНК трижды экстрагировали 5 мл фенола, насыщенного TNE. Водную фазу концентрировали бутанолом-1 до 200 мкл. ДНК осаждали при -20С в течение ночи, добавлением 100 мкл 5 М ацетата аммония и 800 мкл этанола. з) Обработка щелочной фосфатазой ДНК растворяли в 40 мкл НгО, добавляли 5 мкл ЮхСІР буфера (500 тМ Tris.HCl рН 9,0, 10 тМ MgCb, 1 тМ ZnC , 10 тМ спермидин) и 5 мкл (3,5 ед.) фермента. Смесь инкубировали 30 мин при 37С, добавляли еще такое же количество фермента и продолжали инкубацию в течение 30 мин. Фермент инактивировали добавлением 5 мкл 10%-ного SDS и прогреванием при 68С в течение 10 мин. ДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ (1:1) и осаждали этанолом в присутствии 2 М ацетата аммония. Осадок промывали 70%-ным этанолом, сушили и растворяли в необходимом объеме НгО.
Образование рекомбинантов между 5'- и З'-фрагментами РНК полиовируса, точно дополняющими друг друга
Ранее полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что лигирование 5 - и З -фрагментов может зависеть от структуры их концевых нуклеотидов. На основании этого в большинстве случаев фрагменты были приготовлены в одной из двух форм (фосфорилированной либо нефосфорилировашюй) - 5 -фрагмент содержал З -концевой фосфат (ЗР) или гидроксил (ЗОН), а З -фрагмент нес 5 -гидроксил (50Н) или 5 -трифосфат (5РРР). При ко-трансфекции клеток Vero 5 -фрагментом (ЗР) Hrpl и 3 -фрагментом (50Н) Hrpl, было получено жизнеспособное вирусное потомство. Вирусные бляшки появлялись на 2-4 день после трансфекции. Выход полученных вирусов варьировал в различных экспериментах от 100 до 200 вирусных бляшек на 1 мкг каждого из фрагментов (табл. 1). При ко-трансфекции клеток Vero 5 -фрагментом (ЗР) Нгр2 и 3 -фрагментом (50Н) Нгр2, также было получено жизнеспособное вирусное потомство. Вирусные бляшки появлялись на 2-4 день после трансфекции. Выход полученных вирусов был сравним с выходом, наблюдаемым при ко-трансфекции парой фрагментов Hrpl, несмотря на отсутствие принуждения к тесной близости реагирующих нуклеотидов и независимо оттого, какими остатками (А или С) был представлен З -концевой нуклеотид 5 -фрагмента (табл. 1). При ко-трансфекции клеток Vero 5 -фрагментом (ЗР) Sup и 3 -фрагментом (50Н) Sup, также было получено жизнеспособное вирусное потомство. Вирусные бляшки появлялись на 2-4 день после трансфекции. Несмотря на отсутствие потенциала для образования стабильного гетеродуплекса, выход полученных вирусов был сравним с выходом, наблюдаемым при ко-трансфекции парами фрагментов Hrpl и Нгр2 (табл. 1). Использование для трансфекции иных комбинаций фрагментов Sup, чем (ЗР) и (50Н), привело к значительному понижению (или отсутствию) выхода жизнеспособных вирусов (табл. 1; рис. 4.6). Подобные результаты были получены и для случаев трансфекции фрагментами Нф1 и Нф2 (табл. 1). При ко-трапсфекции Р формы 5 -фрагмента с трифосфорилированной формой (5РРР) 3 -фрагмента, но и с его дифосфорилированной (5РР) и монофосфорилированной (5Р) формами также не происходило эффективного образования жизнеспособного вирусного потомства (рис. 4.6). С целью подтверждения рекомбинантной природы полученных вирусов, из некоторых вирусов выделялась РНК для последующего секвенирования.
Выделенную РНК подвергали обратной транскрипции, используя праймер ЗЕР4, и PCR, используя праймеры KOR1 и ЗЕР4, по стандартной методике (см. гл. 3.9). Полученные PCR-фрагменты секвенировали, используя метод Сенгера, с праймера ЗЕР15 для конструкций Hrpl и Нгр2 и с праймера ЗЕР16 для конструкции Sup. Рекомбинантная природа РНК была продемонстрирована одновременным присутствием последовательностей, происходящих от 5 - и 3 -фрагментов: все молчащие мутации, принадлежащие этим фрагментам, были сохранены у каждого из вирусных геномов (рис. 4.7). Места перекреста были точны и совпадали с предполагаемыми для каждой пары фрагментов. Для случая конструкции Hrpl секвенирование области, содержащей место перекреста, проводилось не только у вирусов, отобранных непосредственно из бляшек, но и у вирусов, подвергшихся дополнительным двум пассажам в культуре клеток (таких вирусов было 3). Секвенирование проводилось только с помощью обратной транскрипции без дополнительной PCR. Результаты показали полную идентичность первичной структуры РНК регионов мест перекреста этих вирусов и вирусов, отобранных с тех же колоний, но не подвергшихся дополнительным двум пассажам in vitro. На основании этого был сделан вывод, что полученные результаты достоверны и не являются артефактом метода RT-PCR. Кроме этого, полученные результаты указывают на то, что рекомбинанты генетически стабильны, по крайней мере, при этих тестируемых условиях. Выше изложенные результаты демонстрируют возможность лигирования фрагментов полиовирусной РНК в трансфицированной клетке при условии наличия у 5 -фрагмснта З -концевого фосфата, а у З -фрагмента 5 -концевого гидроксила. Однако такие молекулы РНК вряд ли могут рассматриваться в качестве хороших субстратов для РНК-лигазы. Логично было предположить, что в клетке, возможно, происходит активация одного из фрагментов. Так как в РНК-лигазных реакциях приемлемым партнером для 5 -ОН группы является 3 -концевой 2 ,3 -циклофосфат (Abelson et al., 1998; Reid and Lazinski, 2000; Salgia et al., 2003), был проверен эффект циклизации З -концевого нуклеотида 5 -фрагмента Нгр2 (форма Р) на эффективность его лигирования с 3 -фрагментом Hrp2 (50Н). Циклизация достигалась при обработке 5 -фрагмента циклазой З -концевого фосфата РНК (Filipowicz et al., 1983, 1985, 1998; Genschik et al., 1997; В вышеуказанных случаях была изучена возможность лигирования двух взаимодополняющих фрагментов РНК полиовируса.
Существование частиц вирусного генома, точно дополняющих друг друга, возможно, но маловероятно. Чтобы максимально приблизить условия эксперимента к природным и, фактически, изучить истинную рекомбинацию РНК, а не ее лигирование, мы решили разорвать ген РНК-полимеразы таким образом, чтобы образовались взаимодополняющие фрагменты, имеющие область перекрывания. Четвертую пару фрагментов Ovl было решено сконструировать на основе взаимодополняющих фрагментов из предыдущих пар. Таким образом, пара Ovl состояла из 5 -фрагмента Sup и 3 -фрагмента Нгр2 с 6 дополнительными маркерными мутациями (рис. 4.9). Когда 5 -фрагмент содержал З -концевой фосфат, фрагменты имели область перекрывания длиной 177 нт, а когда 5 - фрагмент пес на З -конце гидроксил, фрагменты имели область перекрывания длиной 178 нт. Такая разница в размере перекрывающей последовательности объясняется тем, что образование 5 -фрагмента, содержащего 3 -концевой фосфат, происходило в результате окисления/р -элиминирования З -концевого нуклеотида 5 -фрагмента. Это обуславливало разницу в длине области перекрывания. Так как при конструировании фрагментов не было предпринято специальных попыток для облегчения формирования гетеродуплекса и не было введено других структурных ограничений, фрагменты могут рассматриваться как возникшие в результате случайного расщепления вирусного генома. 4.4. Образование рекомбинантов между 5 - и З -фрагментами РНК полиовируса, имеющих область перекрывания При ко-трансфекции клеток Vero фрагментами, имеющими область перекрывания, эффективно образовывалось жизнеспособное вирусное потомство (рис. 4.10; табл. 2). Для подтверждения рекомбинантной природы полученных вирусов были определены первичные структуры у части вирусных РНК в области перекрывания. Для этого выделенную РНК подвергали обратной транскрипции, используя праймер ЗЕР4, и PCR, используя праймеры KOR1 и ЗЕР4. Полученные PCR-фрагменты секвенировали с праймеров KOR1 и ЗЕР16. Рекомбинантная природа РНК была продемонстрирована одновременным присутствием последовательностей, происходящих от 5 - и З -фрагментов (рис. 4.11). Большая часть рекомбинантов представляла собой точные рекомбинанты. В то же время были и такие рекомбинанты, у которых места перекреста были неточны (см. гл. 4.5).
Лигирование фрагментов РНК полиовируса
При ко-трансфекции фрагментами РНК, точно дополняющими друг друга, рекомбинанты могли быть получены, если 5 -фрагмент содержал З -фосфат, а 3 -фрагмент - 5 -гидроксил. Однако такие концевые группы без дополнительной активации не могут выступать в качестве субстратов для известных РНК-лигаз, независимо от их белковой или рибозимной природы. В качестве приемлемых субстратов для РНК-лигаз могут выступать З -концевой 2 ,3 -циклофосфат и 5 -концевые фосфат или гидроксил (Abelson et al., 1998; Reid and Lazinski, 2000; Ho and Shuman, 2002; Salgia et al., 2003). Кроме этих групп, приемлемыми субстратами могут быть З -концевой гидроксил и 5 -концевые фосфат или трифосфат (Cruz-Reyes et al., 2002; Simpson et al., 2003). Резонно предположить, что активация «неудобных» концевых групп и, соответственно, само лигирование происходят внутри клетки при участии ферментов. Вклад в идентификацию клеточных активностей, участвующих в активации «неудобных» концов, могли бы внести недавно разработанные бесклеточные системы для изучения полиовирусиой рекомбинации (Tang et al., 1997; Duggal et al., 1997). Так как удобным партнером для 5 -гидроксила выступает 2 ,3 -циклофосфат можно было предположить, что в клетке происходит циклизация 3 -концевого фосфата 5 -фрагмента. Такую работу мог бы выполнить клеточный фермент - циклаза 3 -концевого фосфата РНК. Этот фермент АТФ-зависимо переводит З -концевой фосфат в 2 ,3 -циклофосфат, при этом в качестве субстратов может использовать различные высокомолекулярные РНК и синтетические олигонуклеотиды (Filipowicz and Shatkin, 1983; Filipowicz et al., 1983). Известно, что в клетке существуют, по крайней мере, две РНК-лигазные активности, которые лигируют молекулы РНК, содержащие концевые 2 ,3 -циклофосфат и 5 -гидроксил. Эти РНК-лигазы вовлечены в ядерный сплайсинг тРНК у эукариот (Westaway and Abelson, 1995). Свидетельством того, что одна или обе РНК-лигазные активности могли бы вносить вклад в частоту образования рекомбинантов в пашей системе, является работа Filipowicz et al. (1983). Было показано, что экстракт клеток HeLa, содержащий как циклазу концевого 3 -фосфата, так и РНК-лигазу, способен лигировать синтетические олигонуклеотиды, содержащие З -концевой фосфат и 5 -концевой гидроксил. Кроме этого, Reid and Lazinski (2000) показали, что в эукариотической клетке может происходить лигирование широкого круга рибозим-процессированных РНК, несущих на своих концах 2 ,3 - циклофосфат и 5 -гидроксил.
В связи с этим, можно было бы предположить, что такого рода клеточная активность принимает участие при лигировании фрагментов РНК полиовируса в нашей системе (рис. 5.1). Чтобы определить возможное участие 2 ,3 -циклофосфата в реакции лигирования, было решено перед трансфекцией 5 -фрагмент обработать циклазой З -концевого фосфата РНК. Однако превращение З -концевого фосфата 5 -фрагмента Нгр2 в 2 ,3 -циклофосфат не привело к активации рекомбинационного потенциала этого фрагмента РНК. Для объяснения полученных результатов можно предложить две гипотезы. Возможно, что циклизация З -концевого фосфата не является необходимой стадией в реакции лигирования 3 -фосфата и 5 -гидроксила. Вторая гипотеза (более вероятная) предполагает, что для лигирования этих групп циклизация З -фосфата необходима, однако эта стадия не является лимитирующей в реакции лигирования. Эффективное лигированис взаимодополняющих фрагментов вирусного генома наводит на мысль, что концевые нуклеотиды двух фрагментов могут находить друг друга с относительно высокой вероятностью, по крайней мере, при условиях, когда клетки трансфицируются большим количеством РНК. Потенциал для формирования гетеродуплекса, в котором лигируемые нуклеотиды находились бы в тесной близости, по-видимому, не играет в образовании рекомбинантов решающей роли. 5.3. Рекомбинация между перекрывающимися фрагментами РНК полиовируса Образование рекомбинантов между перекрывающимися фрагментами -более многогранный процесс, чем образование рекомбинантов между точно дополняющими друг друга фрагментами. Фактически, при рекомбинации между перекрывающимися фрагментами были обнаружены три типа ковалентного объединения фрагментов РНК. Первые два типа - это интервенция либо 3 -концевого нуклеотида 5 -фрагмента, либо 5 -концевого нуклеотида З -фрагмента во внутреннее положение их партнеров. Третий тип - это перекрест между внутренними положениями перекрывающихся последовательностей. В образовании рекомбинантов между перекрывающимися фрагментами РНК могут принимать участие различные механизмы. Одна группа гипотетических механизмов предполагает существование предварительного расщепления соответствующей фосфодиэфирной связи(ей) и образование концов, которые могут участвовать в дальнейшем лигировании. Такое растепление может быть вызвано различного рода нуклеазами, присутствующими в клетке, или может быть результатом криитической рибозим-подобной активности (Gmyl et al., 1999). Согласно другим механизмам, расщепление одной фосфодиэфирной связи непосредственно связано с образованием другой фосфодиэфирной связи (трансэтерификация) (Chetverin et al., 1997). Пока трудно сказать, по какому механизму идет образование конкретного типа рекомбииантного генома: не исключено, что у каждого типа - свой механизм, но возможно, что все типы подчиняются одному механизму. На основании того, что вставки целых фрагментов в рекомбинантный геном наблюдались только в тех случаях, если 5 -фрагмент содержал 3 -концевой фосфат, а 3 -фрагмент - 5 -концевой гидроксил, можно предложить возможный механизм образования таких рекомбинантов. Согласно этому механизму происходит расщепление фрагмента-партнера с образованием на концах 2 ,3 -циклофосфата и 5 -гидроксила. В том случае, если происходит вставка 5 -фрагмента, в лигировании участвуют З -фосфат 5 -фрагмеита, который переходит в 2 ,3 -циклофосфат, и 5 -гидроксил расщепленного фрагмента-партнера, если же происходит вставка З -фрагмента, в лигировании участвуют 5 -гидроксил 3 -фрагмента и 2 ,3 -циклофосфат расщепленного фрагмента-партнера (рис. 5.2). Таким образом, механизмы лигирования сходны с механизмами лигирования, предложенными для точно дополняющих друг друга фрагментов (см. выше). Предполагая предварительное расщепление молекул РНК с образованием 2 ,3 -циклофосфата и 5 -ОН группы, можно объяснить и образование рекомбинантов, имеющих места перекреста внутри области перекрывания двух фрагментов.
В то же время не исключено, что ковалентные взаимодействия между внутренними нуклеотидами происходят согласно другим механизмам. 5.4. Точность при образовании рекомбинантов между фрагментами РНК полиовируса Образование точных рекомбинантов между точно дополняющими друг друга фрагментами РНК закономерно. Продукты лигирования представляли собой точные рекомбинанты потому, что структуры фрагментов не предполагали образование иных продуктов. Образование точных рекомбинантов между перекрывающимися фрагментами РНК более удивительно. Было показано, что точные нерепликативные места перекреста могут располагаться в разных местах и включать различные нуклеотиды. В принципе, точность может быть результатом трех механизмов рекомбинации. (1) Исходя из того, что разрыв и образование межнуклеотидной связи потенциально могут произойти между любыми двумя нуклеотидами фрагментов РНК, можно предложить «случайную» модель образования рекомбинантов (рис. 5.3). Согласно этой модели, вначале случайным образом происходят разрывы фрагментов РНК. Затем вновь образованные фрагменты случайно соединяются друг с другом. При этом будут образовываться в подавляющем большинстве случаев неточные рекомбинанты, в то время как точные будут представлены лишь незначительной частью от общего числа рекомбинантов. После таких случайных ковалентных взаимодействий будет происходить селективный отбор жизнеспособных, точных или почти точных, геномов. Такой путь рекомбинации предполагает образование рекомбинантов с огромным набором различных мест перекреста. Со «случайной» моделью согласуется образование в подавляющем большинстве случаев неточных (негомологичных) рекомбинантов между взаимодополняющими фрагментами РНК, имеющими разрыв в 5 НТО (Gmyl, et al. 1999). (2) Точная рекомбинация может быть результатом ограниченного набора горячих точек разрыва и лигирования фрагментов РНК (модель «горячие точки») (рис. 5.3). В этом случае, селекция по жизнеспособности включает много более ограниченный набор потенциально возможных рекомбинантов. (3) Третья модель «специфическая» разрешает только сопряженные ковалентные взаимодействия между парами визави-нуклеотидов у фрагментов РНК (рис. 5.3). Такие взаимодействия заведомо будут приводить к образованию точных рекомбинантов. Таким образом, в этом случае образование жизнеспособных рекомбинантов не является результатом селекции.
