Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Экспериментальные методы
1.1. Термочувствительные полимеры 32
1.2. Методы исследования термочувствительных полимеров в растворах 36
1.3 Методы получения термочувствительных покрытий 37
1.4. Методы исследования термочувствительных покрытий 43
1.5. Методы анализа клеточных популяции, цитосовместимости и бесферментного снятия клеток и клеточных пластов 52
1.6. Методы исследования доставки лекарств из термочувствительных полимеров 58
Глава 2 Физико-химические характеристики термочувствительных покрытий 62
2.1 Характеристики термочувствительных полимеров в растворах .68
2.1.1 Термочувствительные полимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) 68
2.1.2 Термочувствительные полимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-ЕПМ) 71
2.2. Исследование термочувствительных покрытий 76
2.2.1. Покрытия, полученные методом центрифугирования 76
2.2.2. Термочувствительные гидрогели 80
2.2.3. Покрытия, полученные методом высушивания из растворов 92
2.2.4. Термочувствительные покрытия, модифицированные факторами адгезии 101
Выводы к главе 2 105
Глава 3 Взаимодействие термочувствительных покрытий и клеток 106
3.1. Адгезия и пролиферация клеток на термочувствительных покрытиях 114
3.2. Бесферментное открепление клеток от термочувствительных покрытий 136
3.3. Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки человека на термочувствительных подложках 149
Выводы к главе 3 156
Глава 4 Термочувствительные полимеры для доставки лекарств 158
4.1. Исследование кинетики выхода лекарств из термочувствительных покрытий 161
4.1.1. Математическая модель 162
4.1.2. Экспериментальное исследование доставки лекарств из термочувствительных покрытий 168
4.2 Система доставки лекарств из термочувствительных полимеров на основе элемента Пельтье 175
Выводы к главе 4 184
Заключение 185
Благодарности 188
Список литературы
- Методы исследования термочувствительных полимеров в растворах
- Термочувствительные полимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)
- Бесферментное открепление клеток от термочувствительных покрытий
- Экспериментальное исследование доставки лекарств из термочувствительных покрытий
Методы исследования термочувствительных полимеров в растворах
Открепление клеток от термочувствительного покрытия происходит в результате набухания полимера. При этом в случае линейных несшитых полимеров происходит растворение и выход полимера в водную фазу. Отрыв клетки от субстрата неизменно сопровождается разрушением цитоскелета и осфериванием клетки.
Сравнительный анализ открепления клеток от покрытий на основе поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) с толщиной 5 мкм продемострировал зависимость скорости открепления от гидрофобности субстрата. Характерное время открепления клеток линии L929 составляло 0.5, 2.0, 30 и 180 мин для полимеров с молярным отношением N-ИПААм и N-трет-БААм 100/0, 85/15, 65/35 и 50/50 соответственно. Скорость открепления зависела не только от гидрофобности субстрата, но и от метода получения покрытия. Для покрытий на основе поли-N-ИПААм, полученных методом центрифугирования, характерное время открепления клеток, как правило, составляло 10 мин. Как и в случае традиционной трипсинизации клеток, скорость открепления в сильной степени зависела от типа клеточной культуры.
При анализе процессов открепления клеток от термочувствительных субстратов целесообразно различать механизмы открепление единичных клеток и клеточных пластов. Механизм открепления клеточных пластов связан с внутренними механическими напряжениями, которые приводят к локальному отделению пласта клеток, после чего пласт волнообразно открепляется от подложки. Клетки в пластах фибробластов сохраняют механическую связность за счет элементов внеклеточного мактрикса, но не за счет межклеточных контактов. В случае эндотелиальных клеток клеточные контакты сохраняются и при откреплении клеточного пласта (Moran et al., 2007).
Нами было исследовано влияние факторов адгезии на скорость открепления клеток линии 3Т3. Скорость открепления клеток от наиболее гидрофильного сополимера поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) (85/15) не зависела от белка, которым модифицированы термочувствительные покрытия. Для сополимеров (65/35) и (50/50) скорость открепления клеток резко уменьшалась, при этом динамика открепления зависела от типа ФА. В отдельном параграфе рассматривается поведение МСК человека на термочувствительных покрытиях. В экспериментах по росту и бесферментному откреплению клеток нами было исследовано поведение 12-ти типов первичных клеток и перевиваемых клеточных линий, но анализ поведения стволовых клеток человека мы выделили в отдельный параграф, поскольку именно этот тип клеток является наиболее перспективным для использования в регенеративной медицине, тканевой инженерии и клеточной терапии.
Данные по экспрессии маркеров дифференцировки МСК свидетельствуют, что фенотип МСК не меняется при пролонгированном культивировании на термочувствительных материалах. Кроме того, впервые было показано, что покрытия, полученные методом высушивания, на основе поли-N-ИПААм могут успешно использоваться для культивирования МСК, а также для получения остеобластов, хондроцитов и адипоцитов.
Глава 4 посвящена исследованию управляемой доставки лекарств из термочувствительных покрытий. Для того, чтобы покрытия могли использоваться для доставки лекарств, т.е. быть резервуаром для лекарства, пленки должны обладать достаточной емкостью (объемом). Характерная толщина пленок рассматриваемых в данной главе – 5 мкм. Отметим, что покрытия с толщиной порядка (1-100) мкм активно используются в медицинских изделиях для локальной доставки лекарств, например, в кардиоваскулярных стентах.
Для анализа доставки лекарств из термочувствительных покрытий нами были предложены физическая и математическая модели процессов переноса. В качестве модельного соединения мы выбрали краситель родамин В (Mw= 451 D). В качестве полимера-носителя поли-(N ИПААм-со-ААБФ). Покрытия толщиной 5 мкм формировали методом высушивания из раствора. Метод получения полимерных сеток при помощи фотореакции описан в нашей работе (Yang et al., 2013).
Для описания процессов доставки лекарств из термочувствительных покрытий нами была предложена математическая модель, которая описывает диффузию лекарства из пленок при изменяющихся температурных режимах. Концентрация родамина B в пленке мала, что дает возможность использовать приближение слабых растворов и воспользоваться законом Фика и уравнениями диффузии для переноса вещества.
Экспериментальные данные по циклической элюции родамина В из термочувствитедльных покрытий на основе поли-(N-ИПААм-со-ААБФ) соответствовали данным полученным на базе диффузионной модели .
Традиционно в работах по доставке лекарств из полимеров с НКТР температурный контроль осуществлялся принудительным изменением температуры водного окружения (применялись термостаты, проточные системы, термостолы и т.д.). В настоящее время не существует устройств позволяющих локально понижать температуру собственнно полимерного материала с НКТР или носителя, на котором этот полимер иммобилизован. Нами впервые было предложено использовать механизм локального охлаждения, основанный на применении элемента Пельтье. Опытный образец был собран на базе элемента покрытого водонепроницаемым полимерным покрытием. Циклический режим доставки лекарств удалось продемонстрировать на 3-х циклах изменения тока, подаваемого на элемент Пельтье.
Термочувствительные полимеры на основе поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)
На первом этапе исследовался выход родамина из полимерных покрытий при различных температурах. В этих экспериментах одно временное измерение соответствовало одной лунке плашки. Все измерения проводили трижды. Перед началом измерения поверхность промывали дистилированной водой дважды (40 C), удаляя неспецифически связавшийся с поверхностью краситель. Далее в заданное время из общего объема отбирали 1 мл для анализа на спектрофлюориметре. Такой же объем вновь добавляли в ячейку. Остаток красителя элюировали при 40 С и также оценивали на спектрофлюориметре. В случае циклического изменения температуры 1мл рвствора заменялся на 1 мл «свежего» раствора соответствующей температуры. В экспериментах с элементом Пельтье использовался элемент покрытый водонепроницаемым полимерным покрытием от Radionics ( Peltier device
В настоящей работе мы определяем термочувствительные полимеры как полимеры с нижней критической температурой растворения (НКТР). В водном растворе такие полимеры при повышении температуры выше критической выпадают в осадок. В гелях на основе полимеров с НКТР наблюдается переход из набухшего состояния в коллапсированное. Основы теории перехода клубок-глобула в гомополимерах в растворе были заложены в работах (Flory, 1953; Птицын и Эйзнер, 1965; Lifshitz et al., 1978). Коллапс полимерных сеток был предсказан в работе (Dusek and Patterson, 1968) и впервые охарактеризован в работе (Tanaka 1978).
По-видимому, наиболее подходящим полимером для получения термочувствительных покрытий является поли-N-ИПААм, НКТР которого близка к 32 С, а переход характеризуется малой полушириной и высокой кооперативностью. Важным свойством данного полимера является слабая зависимость температуры перехода от молекулярной веса полимера. N-ИПААм относительно легко сополимеризовать как с более гидрофобными, так и с более гидрофильными мономерами, что позволяет варьировать НКТР в максимально широком диапазоне температур.
Поли-N-ИПААм впервые был описан в следующих патентах: Sprecht et al., 1956a; Sprecht et al., 1956b. Однако до работы (Heskins and Guillet, 1968), в которой было показано наличие НКТР, поли-N-ИПААм не привлекал к себе специального интереса. Фазовый переход в полимерных сетках на основе поли-N-ИПААм впервые был изучен в работе Hirokava, and Tanaka, 1984.
В нашей работе мы рассматриваем несколько сополимеров N-ИПААм, как для бесферментного снятия клеток, так и для доставки лекарств (рис.2.1).
На рис.2.2 представлены структуры сополимеров, их НКТР, а также области их применения в настоящей работе. Нами были исследованы сополимеры на основе N-ИПААм и N-трет-БААм с молярным соотношением N-ИПААм и N-трет-БААм: 100/0, 85/15, 65/35 и 50/50, а также сополимер N-ИПААма и ААБф (поли-(N-ИПААм-со-ААБФ)) с молярным соотношением 99/1. Кроме того, нами впервые были синтезированы сополимеры поли-(N-ИПААм- со-ЕПМ) с молярным отношением N-ИПААма и ЕПМ 90/10, 80/20, 70/30 и 60/40 соответственно.
Структуры сополимеров на основе поли-N-ИПААм, НКТР и области применения. На основании перечисленных термочувствительных полимеров было получено более 20-ти различных термочувствительных покрытий. В работе использовались два метода нанесения покрытий: метод центрифугирования и метод высушивания из растворов. Метод центрифугирования (“spin coating” или “spin cast” в англоязычной литературе) - один из наиболее эффективных способов получения гомогенных и «гладких» полимерных покрытий с толщинами в диапазоне 10 нм - 10 мкм на плоских подложках. Метод высушивания из раствора позволяет получать покрытия как на плоских подложках, так и в чашках Петри и многолуночных плашках для культивирования клеток. Толщина таких покрытий составляла 1-10 мкм. В сводной таб. 2.1 представлены покрытия, которые использовались для бесферментного снятия клеток. Для доставки лекарств нами были использованы покрытия из поли-(Л -ИПААм-со-ААБФ), полученные методом высушивания из раствора. Толщина покрытий составляла 5 мкм.
В настоящее время определены основные физико-химические характеристики поверхностей биоматериалов, определяющие поведение клеток in vitro (Zeiger at al., 2013). Среди них, свободная энергия поверхности , топография поверхности , механические характеристики поверхност - модуль Юнга (Е) и твердость (Н), а также химическая структура поверхности. Именно эти характеристики являются определяющими при разработке материалов для культивирования клеток. Для тонких и ультратонких покрытий толщина (К) также может субстрата и клеточной адгезией было показано, что оптимальное значение краевых углов смачивания в должно находиться в диапазоне 20-65 град, а свободная энергия поверхности должна быть выше 45 мДж/м2. Шероховатость (RMS) стандартных покрытий для культур клеток
Бесферментное открепление клеток от термочувствительных покрытий
Первые работы по использованию термочувствительных полимеров для бесферментного открепления клеток были опубликованы в 1990г. независимо двумя японскими группами (Takezawa et al., 1990; Yamada et al., 1990). Takezawa с соаторами использовали для роста дермальных фибробластов конъюгат поли-N-ИПААм с коллагеном, объясняя выбор материала тем, что покрытие из поли-N-ИПААм не обеспечивало адгезию клеток. В статье не приводились физико-химические характеристики покрытий и не исследовалась динамика роста клеток. Если работа Takezawa носила откровенно предварительный характер, то работа второй группы под руководством Okano заложила стандарты исследования в области бесферментного открепления клеток. В дальнейшем эта группа опубликовала десятки работ по изучению термочувствительных полимеров и именно в этой группе были осуществлены первые пересадки пластов клеток человека, полученных методом бесферментного снятия. Авторы предожили метод получения термочувствительных покрытий, основанный на использовании электронного луча для полимеризации N-ИПААма на поверхности пластиковых чашек Петри, т.е. получения графт-полимеров. В работах оценивали краевые углы нового материала, адгезию клеток и динамику клеточного открепления. В следующей работе (Rollason et al., 1993) использовались сополимеры поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм) с НКТР 8С. Использование покрытий с данной температурой перехода поддерживало гидрофобность покрытия при комнатной температуре и позволяло проводить рутинные операции с культурами клеток (смена среды культивирования, наблюдение под микроскопом и т.д.). Покрытия обладали слабой способностью к адгезии клеток, но обеспечивали бесферментное открепление. Для анализа поверхности авторы использовали метод рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии, позволяющий оценить элементный состав поверхности на глубине 10 нм. Этот метод в дальнейшем нашел широкое применение при анализе термочувствительных покрытий.
Подавляющее большинство работ, посвященных проблеме термочувствительных биоматериалов, проведено на поли-N-ИПААм, однако продолжается поиск и новых материалов для клеточных культур, способных реагировать на небольшие изменения температуры (Von Recum at al., 1998, a,b; McMahon at al., 2011; Hoo at al., 2013).
Слабая адгезия клеток к субстратам-подложкам – одна из типичных проблем, возникающих при культивировании клеток млекопитающих. Одним из способов улучшения адгезии клеток является нанесение факторов адгезии клеток на подложки. В настоящее время известно и детально исследовано немало факторов, способных обеспечивать необходимую клеточную адгезию. Среди них белки и гликопротеины внеклеточного матрикса такие как коллаген (разных типов) (Kleinman et al., 1981), ламинин (Paulsson, 1992), фибронектин и витронектин (Ozturk, 2005). (Последние два фактора в растворимой форме обнаруживаются и в крови). Кроме природных факторов адгезии применяют и синтетические макромолекулы, такие как, например, поли-L-лизин (Mazia et al., 1975). Механизмы действия факторов адгезии основываются на специфическом связывании клеточных рецепторов (обычно интегринов) с соответствующими участками связывания ФА. В случае же поли-L-лизина механизм адгезии связан с электростатическим взаимодействием положительного полимера и отрицательно заряженных клеток. На сегодняшний день нет единого универсального фактора адгезии клеток, который бы гарантированно обеспечивал адгезию клеток к синтетическим субстратам для культвирования клеток. Наиболее распространенным фактором адгезии является фибронектин, рецепторами к которому обладает подавляющее большинство клеток млекопитающих и человека. Основной тип рецепторов на фибронектин - 51, который встречается во многих типах первичных клеток и клеточных линий (Hohenester, 2014). Коллаген также является широко распространенным фактором адгезии. Многие клетки обладают рецепторами на различные типы коллагена, наиболее распространенные среди них - интегрины 11 и 21. Кроме того, фибронектин имея специализированный домен, может связываться с коллагеном (например, типа I). Таким образом, покрытие из коллагена может вызывать дополнительную адсорбцию фибронектина из сыворотки, содержащейся в среде культивирования. Еще одним распространенным фактором адгезии является гликопротеин- ламинин, который представлен в организме прежде всего в базальной мембране, рецептторы к ламинину также присутствуют во многих типах клеток. Заметим, что как и у фибронектина, у ламинина также есть участок связывания с коллагеном. При модификации поверхностей фибронектином и ламинином, необходимо учитывать, что эти гликопротеины могут менять свою конформацию в зависимости от характеристик субстрата. При этом меняется и их способность к взаимодействию с клетками в культуре (Garca et al.,1999). Заметим, что синтетические факторы адгезии на основе полилизина (как L так и D формы) не обладают биологической специфичностью и не располагают специальными сайтами связывания. В нашей работе мы исследовали в качестве потенциальных факторов адгезии коллаген типа I, ламинин типа I, фибронектин и поли-L-лизин, т.е. все наиболее распространенные факторы клеточного прикрепления (Пискарёва и др.1999; Moran et al., 2006; Moran et al, 2007).
Адгезия и пролиферация клеток на термочувствительных покрытиях. Рост клеток на покрытиях микронной толщины Процесс адгезии клеток включает в себя несколько стадий, таких как начальный контакт, прикрепление, распластывание и т.д. Каждый из этих процессов имеет свое характерное время. В нашей работе мы оценивали общее количество прикрепившихся клеток к термочувствительным полимерам через 1- 3 часа. При этом клетки, будучи прикрепленными к субстрату, могут быть не полностью распластаны. В данной части работы были исследованы покрытия, полученные методом высушивания из раствора. Толщина покрытий из (поли-(N-ИПААм-со-N-трет-БААм)) составляла 4-5 мкм. Исследования были проведены на двух линиях фибробластов L929 и BHK-23 и двух линиях эпителиальных клеток Vero и НЕр-2. Для линий фибробластов количество прикрепившихся клеток оценивали через 1 ч, а для линий эпителиальных клеток через 3 ч (рис.3.1.1). Хотя зависимость скорости прикрепления клеток от композиции сополимера различна для всех четырех клеточных линий, общей характеристикой является относительно низкий уровень адгезии клеток на покрытиях из поли-N-ИПААм.
Экспериментальное исследование доставки лекарств из термочувствительных покрытий
Концепция доставки лекарств из термочувствительных полимеров была предложена в работах A. Hoffman (Huffman et al., 1986; Afrassiabi et al., 1987). В дальнейшем было предложено немало полимерных систем и различных типов лекарств, которые обеспечивали циклический выход лекарств хотя бы в течение двух циклов. До сегодняшнего дня не было описано ни одного устройства, основанного на термочувствительных полимерах, которое могло бы обеспечивать доставку лекарств, при изменении температуры. Нами было предложено использовать в качестве преобразователя энергии, необходимой для локального понижения температуры, элемент Пельтье. Общий вид устройства показан на рис.4.2.1. Параметры элемента Пельтье были приведены в главе «Экспериментальные методы». Схема экспериментальной ячейки, в которой помещается элемент Пельтье с термочувствительным покрытием, представлена на рис. 4.2.2. Покрытие с лекарством располагалось на пластинке из материала Thermanox. Пластинка, толщина которой составляла 200 мкм, в свою очередь, прилегала к холодной части элемента Пельтье. Наружная «теплая» сторона элемента была термостатирована на 37 С. Элемент Пельтье был соединен с источником постоянного тока.
Ячейка для измерения выхода родамина В. Покрытие с родамином В находится на холодной стороне элемента Пельтье. Элемент Пельтье покрыт водонепроницаемым покрытием. В качестве подложки используется пластинка Thеrmanox толщиной 200 мкм.
Был проведен ряд калибровочных измерений, в частности, исследовалась зависимость изменения температуры воды в ячейке от силы подаваемого тока (рис.4.2.3) и зависимость изменения температуры воды в ячейке от силы тока и объема воды в ячейке при заданном токе (рис. 4.2.4). Из графиков следует, что при значениях тока 2 А, температура воды в ячейке может быть ниже температуры структурного перехода в покрытии. Т.е. покрытие может переходить в набухшее гидрофильное состояние.
Оценивалась также задержка изменения температуры в ячейке при мгновенной подаче электрического сигнала. Задержка составляла 30-60 сек и зависела от силы тока.
После оценки рабочих параметров ячейки и элемента Пельтье были получены кривые выхода родамина В при различных значения тока (рис 4.2.5). В данной системе мы также регистрировали значительный выход родамина В из коллапсированного состояния сополимера. Силы тока в 1 А было недостаточно для охлаждения покрытия ниже НКТР, поэтому после подачи тока в момент t кинетика выхода родамина не изменилась. При значениях тока 1.5, 1.75 и 2.0 А наблюдалась сходная кинетика выхода родамина В из покрытия. Кинетические кривые характеризовались двумя фазами выхода родамина В: быстрой начальной фазой и последующей относительно медленной фазой. Причем кинетика медленной фазы совпадала с кинетикой выхода родамина из сколлапсированной пленки. Возможно, что наличие медленной фазы связано с отсутствием перемешивания в системе. Для регулируемого выхода лекарств необходимо использовать первую относительно быструю фазу, до наступления насыщения.
«Идеальное» устройство на основе термочувствительных полимеров должно фунционировать по схеме «все» или «ничего», т.е. лекарство должно диффундировать из полимера, находящегося в набухшем состоянии и связывать лекарство при температурах выше НКТР. Реальное же устройство храктеризуется утечкой лекарства и в гидрофобном сотоянии, что, по-видимому, связано с сорбцией воды. Поскольку общая продолжительность закрытых состояний может быть существенно большей, чем продолжительность открытых состояний , то выход лекарства, в основном будет осуществляться из коллапсированного состояния, что противоречит самой идее использования термочувствительных полимеров для доставки лекарств. Одним из способов уменьшения скорости выхода лекарства из покрытий в сколлапсированном состоянии является увеличение гидрофобности покрытия, что достигается сополимеризацией поли- N-ИПААМа с более гидрофобным мономером. В нашем случае этим мономером является N-терт-БААм. Увеличение содержания терт-БААм резко замедляет выход лекарства, что было показано в наших работах (Doorty et al., 2003). На рис. 4.2.6. приведена кинетика выхода колхицина из покрытий на основе поли-(N-ИПААм-со -N-трет-БААм). (Колхицин- антистатик, воздействующий на цитоскелет клетки. ) Из графика следует , что кинетика выхода лекарства сильно зависит от композиции полимера. Так, из наиболее гидрофобного сополимера с соотношением мономеров 50:50 выход практически не наблюдается в течение 50 ч.
