Введение к работе
Актуальность проблемы. При ряде заболеваний повышенная агрегаци-онная активность тромбоцитов становится причиной тромбозов [Weyrich A., 2007; Troxler M., 2007], последствия которых могут оказаться крайне неблаго-приятными для организма. Не менее опасна и другая крайность в функцио-нальном состоянии тромбоцитов, их пониженная агрегационная активность, которая может привести к внутренним кровотечениям. В связи с этим, следует внимательно относиться к соединениям, обладающим антиагрегационными свойствами. Среди таких соединений можно выделить гипохлорит натрия, при-меняемый в настоящее время внутривенно при некоторых острых интоксика-циях [Sergienko V. I., 1989], и N-хлорамины, предложенные клинике как перс-пективные средства для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбоцита-ми [Мурина М. А., Сергиенко В. И., Рощупкин Д. И., 1993, 2001]. Это естест-венные метаболиты организма, которые образуются в активированных нейтро-филах в результате реакции, катализируемой миелопероксидазой [Thomas E. L., 1995], и могут изменять функциональную активность тромбоцитов в крови. Антиагрегационное действие их на тромбоциты проявляется благодаря «актив-ному» хлору [Мурина М. А., 2000], который способен модифицировать раз-личные химические группы компонентов крови. Однако, механизм этого действия до сих пор остается невыясненным. Его расшифровка должна существенно облегчить решение проблемы о возможности клинического при-менения этих соединений. Здесь, в первую очередь, актуален вопрос о безопас-ности их взаимодействия с плазмой. Угнетение активности тромбоцитов при введении в кровь гипохлорита натрия или N-хлораминов может быть резуль-татом первоначальной модификации ими плазмы с образованием продукта, обладающего антитромбоцитарными свойствами. Очевидно, что в этом случае возникает необходимость изучать воздействие этого продукта и на другие клетки, поскольку при его появлении в крови возможны негативные последст-вия для организма. Иначе говоря, нежелательное влияние гипохлорита натрия и
N-хлораминов на клетки крови и организм в целом может не ограничиваться их прямым действием. Во-вторых, разработка нового антитромбоцитарного ле-карственного препарата на основе N-хлораминов и внутривенное применение гипохлорита натрия в качестве детоксицирующего средства требует теорети-ческого обоснования их фармакологического лечебного (N-хлорамины) и по-бочного (гипохлорит натрия) действия на тромбоциты.
Для понимания механизма антиагрегационного действия исследуемых соеди-нений на тромбоциты и оценки его эффективности необходимо изучать началь-ную агрегацию тромбоцитов (образование мелких агрегатов - Fromjovic M. M., 1983). К сожалению, в большинстве работ по изучению антитромбоцитарного действия потенциально возможных антиагрегантов в качестве критерия агрега-ционной активности тромбоцитов выбирается только конечная агрегация (обра-зование крупных агрегатов - Born, G. V. R., 1962). Используемые в клинике препараты, включая такие известные антиагреганты как производные тиенопи-ридиновые основания (тиклопидин, клопидогрель) и аспирин, не обладают спо-собностью разрушать мелкие тромбоцитарные агрегаты [, 1998; Matsuno H., 1999], наличие которых в кровеносном русле приводит к развитию тромбообразования [Bologna E., 1990]. В настоящей работе исследовалось влияние на начальную агрегацию тромбоцитов гипохлорита натрия и N,N-дихлортаурина. Последний вызывает особый интерес в ряду N-хлораминов из-за его значительной собственной устойчивости. Кроме того, нами изучалось действие на тромбоциты и некоторых других N-хлорпроизводных: N-хлор-аланина, N-фенилхлораланина и N-хлортаурина.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей действия гипохлорита натрия (ГХН) и N,N-дихлортаурина (ДХТ) на начальную агрегацию тромбоцитов и выяснение молекулярного механизма этого действия. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1) Исследовать влияние ГХН и ДХТ на начальную агрегацию тромбоцитов в составе обогащенной тромбоцитами плазме (ОТП) и изолированном виде;
2) Изучить модификацию сульфгидрильных групп тромбоцитов как основ-ного молекулярного механизма их инактивации под действием ГХН или ДХТ;
3) Исследовать влияние ГХН и ДХТ на начальную агрегацию активирован-ных изолированных тромбоцитов.
Научная новизна исследования. Установлено, что гипохлорит натрия и N,N-дихлортаурин, введенные в обогащенную тромбоцитами плазму, в диапа-зоне концентраций 500 – 2500 мкМ угнетают начальную агрегацию в резуль-тате прямого действия на клетки; образующиеся при этом продукты модифи-кации плазмы неактивны, не обладают выраженным антиагрегационным свойством. Показанные на изолированных тромбоцитах эффекты угнетения этими соединениями начальной агрегации проявляются в пределах кон-центрации, в которой они могут локально образовываться в крови в естест-венных условиях (около 100 мкМ).
Первичным механизмом действия гипохлорита натрия и N-хлораминов на тромбоциты является модификация сульфгидрильных групп их поверхности. Инактивация тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином, происходит в результате первоначального повреждения бел-ков (а не липидов) их плазматических мембран вследствие прямого действия на сульфгидрильные группы поверхностных белков клеток с образованием кисло-родсодержащих продуктов необратимого окисления тиолов сульфеновой и сульфоновой кислот. При концентрации 50 мкМ, вызывающей модификацию тиолов поверхности тромбоцитов, гипохлорит натрия и N,N-дихлортаурин не модифицируют кальциевых каналов тромбоцитов.
Обнаружено, что гипохлорит натрия и N-хлорамины угнетают начальную агрегацию при действии на изолированные тромбоциты уже после их акти-вации. N-хлораланин при концентрации 100 мкМ вызывает практически пол-ный распад тромбоцитарных агрегатов.
Практическое значение работы. Во-первых, отсутствие у модифициро-ванной N,N-дихлортаурином плазмы при его введении в ОТП признака био-логической активности (антитромбоцитарного действия) снимает необходи-мость в дальнейшем исследовать ее влияние на другие клетки. То же самое можно сказать и относительно действия в крови гипохлорита натрия, который уже давно применяется при некоторых острых интоксикациях. Разрушение сульфгидрильных групп тромбоцитов как возможный первичный механизм антиагрегационного действия исследуемых соединений говорит в пользу безо-пасности их применения для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбо-цитами: продукты таких реакций безвредны, поскольку образуются в организме и в естественных условиях (при метаболизме цистеина и других SH-содержа-щих соединений). Во-вторых, выявленные у N,N-дихлортаурина и гипохлорита натрия механизмы модифицирующего действия позволяют теоретически обос-новать их лечебный эффект как антитромбоцитарного препарата (ДХТ) и побочное действие на тромбоциты при применении в целях детоксикации (ГХН). В-третьих, важнейшим достоинством N-хлораминов как антитромбоци-тарных средств является их способность угнетать агрегационную активность тромбоцитов в составе уже образованных мелких агрегатов. Обнаруженное дезагрегационное свойство N-хлораланина, проявляющееся в полной мере при концентрации, в которой он может локально вырабатываться при определенных условиях в организме (100 мкМ), характеризует его как перспективное анти-агрегантное средство.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II Меж-дународном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования бел-ков и их комплексов», Воронеж, июль 1998 г., на V Международной конфе-ренции «Биоантиоксидант», Москва, ноябрь, 1998 г., на II Съезде биофизиков России, Москва, август 1999 г., на IV Съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем», Минск, июнь 2000 г., на Российском нацио-нальном конгрессе кардиологов «Кардиология, основанная на доказательст-вах», Москва, октябрь 2000 г., на II Российском конгрессе по патофизиологии «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы», Москва, октябрь 2000 г., на IV Всероссийском конгрессе «Профессия и здо-ровье», Москва, октябрь 2005 г., на II Международной конференции «Молеку-лярная медицина и безопасность», Москва, октябрь 2005 г.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 147 страницах, содержит 28 рисунков и 6 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (225 наименований).
