Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование структуры липолитических ферментов, механизмов гидролиза триглицеридов in vivo, систем регуляции скоростей метаболических процессов, сложнейшей координации ферментативных превращений в клетке способствует глубокому познанию процессов жизнедеятельности на молекулярном уровне и обусловливает практическую необходимость создания новых гетерогенных биокатализаторов промышленного назначения и медицинских препаратов пролонгированного действия.
Липазы - сериновые гидролазы, действующие на поверхности раздела фаз и способные катализировать как гидролиз триглицеридов, так и обратные реакции этерификации, трансэтерификации, алкоголиза и ацидолиза, использующиеся в пищевой, фармацевтической, химической, текстильной и кожевенной промышленности, в производстве моющих средств, а также для аналитических целей в медицине. Свойство энантиоселективности липаз широко применяется в органическом синтезе биологически активных веществ и их синтетических аналогов.
Однако широкое использование нативных препаратов липолитических ферментов сдерживается высокой ценой энзимов, сложностями в создании оптимальных условий гидролиза триглицеридов, низкой термостабильностью и невысокими скоростями реакций в физико-химических условиях, отличающихся от оптимальных. Преодолеть эти недостатки удается посредством иммобилизации ферментов на различных природных и синтетических носителях. Лекарственные препараты, обладающие липолитической активностью, широко применяются в клинической практике для лечения недостаточности желудочно-кишечного тракта различной этиологии. В этой связи создание новых фармацевтических веществ на основе иммобилизации определяет более высокую пролонгированность действия и снижение риска побочных эффектов. При этом возникает необходимость изучения применения таких методов иммобилизации, которые не предполагают использования токсичных химических соединений, высокой температуры и других денатурирующих факторов. Подбор носителей при иммобилизации ферментов для клинического применения представляет собой определенную экспериментальную задачу, так как к подобного рода подложкам, кроме основных требований, предъявляются еще и ряд специальных установок, учитываемых фармакологической безопасностью и особенностями доклинических и клинических испытаний.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является исследование надмолекулярной организации липазы Rhizopus niveus, физико-химических и кинетических свойств фермента, иммобилизованного на растворимых и нерастворимых носителях, изучение особенностей гидролиза триглицеридов нативными и иммобилизованными ферментными препаратами.
Реализация поставленной цели предполагает решение следующих задач:
исследовать особенности надмолекулярной организации липазы Rhizopus niveus;
изучить закономерности процесса термической инактивации мономерной и димерной форм липазы Rhizopus niveus;
установить характер влияния ионов Са на структурно-функциональные свойства различных форм липазы Rhizopus niveus;
осуществить иммобилизацию липазы на растворимых и нерастворимых носителях и изучить механизм взаимодействия молекулы фермента с матрицей носителя;
исследовать физико-химические и кинетические свойства липазы в свободном и иммобилизованном состояниях.
Научная новизна: проведен сравнительный анализ содержания различных типов аминокислотных остатков в первичной структуре липаз микробного происхождения; показана тенденция к образованию надмолекулярных структур у липазы Rhizopus niveus; проведены комплексные исследования надмолекулярной организации липазы из Rhizopus niveus; впервые применен метод атомно-силовой микроскопии в сочетании с классическими биофизическими и биохимическими методами анализа для визуализации молекул липазы из Rhizopus niveus; установлены закономерности процесса термической инактивации мономерной и димерной форм липазы; разработан способ иммобилизации липазы на растворимых носителях; исследованы некоторые физико-химические и кинетические свойства гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе липазы.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований надмолекулярной организации, термической инактивации мономерной и димерной форм липазы из Rhizopus niveus, влияния ионов кальция, олеиновой и стеариновой кислот на функциональные свойства фермента позволяют расширить и углубить представления о механизме ферментативного гидролиза триглицеридов.
В ходе исследования разработана методика адсорбционной иммобилизации липазы на поли-]Ч-винилпирролидоне и растворимом хитозане, которую можно рекомендовать для получения лекарственных препаратов для заместительной энзимотерапии.
Полученные данные могут быть использованы при разработке технологии промышленного получения иммобилизованных ферментов медицинского назначения.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследований по теме диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных, всероссийских и региональных конференциях и симпозиумах: Международном симпозиуме «Современные спектральные методы изучения биополимеров в биологии и медицине» (Дубна, 2007); 12-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); VI Сибирском
физиологическом съезде (Барнаул, 2008); Втором Международном форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2008); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008); Научно-практической конференции «Фармация из века в век» (Санкт-Петербург, 2008); Пятом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Воронеж, 2009); 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Нано- и супрамолекулярная химия в сорбционных и ионообменных процессах» (Белгород, 2010); XXII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010).
Публикации. По теме диссертационной работы имеется 21 публикация: 9 статей и 12 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:
Липаза, выделенная из Rhizopus niveus, в водном растворе функционирует в форме димера. Мономерная форма липазы более устойчива к температурным воздействиям в интервале 20-60 С по сравнению с димерной.
Ионы кальция, включенные в Са-связывающий домен молекулы фермента, поддерживают каталитически активную конформацию энзима и определяют оптимальные условия гидролиза триглицеридов.
Олеиновая и стеариновая кислоты являются ингибиторами липазы смешанного типа.
Адсорбционный способ иммобилизации липазы на растворимых и нерастворимых носителях позволяет сохранить до 55% (при связывании с растворимым хитозаном) и 79% (при взаимодействии с поли-N-винилпирролидоном) активности нативного энзима.
Связывание липазы с поли-]Ч-винилпирролидоном дает возможность получить ферментный препарат, стабильный по отношению к значениям рН 4,0-6,0.
Структура и объем работы. Диссертационная работа включает 162 страницы машинописного текста; состоит из Введения, 6 глав, Заключения, Выводов и Приложения. Список литературы содержит 230 источников. Иллюстрационный материал включает 32 рисунка и 15 таблиц в основном тексте и 5 рисунков в «Приложении».
