Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1.1 Детекция молекулярных нарушений для целей диагностики и мониторинга некоторых онкологических патологий 9
1.1.1 Молекулярные маркеры для диагностики и мониторинга рака молочной железы 9
1.1.1.1 Ранняя диагностика рака молочной железы 10
1.1.1.2 Прогнозирование течения рака молочной железы 13
1.1.2 Молекулярные маркеры для диагностики и мониторинга рака легких 17
1.1.2.1 Ранняя диагностика рака легких 17
1.1.2.2 Прогнозирование течения рака легких 20
1.2 Методы лечения онкологических патологий молочной железы и легких. Воздействие на неопухолевые ткани 22
1.2.1 Радиотерапия в лечении рака молочной железы и рака легких 23
1.2.2 Химиотерапия в лечении рака молочной железы и рака легких 31
1.3 Источники внеклеточной ДНК 37
1.3.1 Ядерная ДНК 37
1.3.2 Митохондриальная ДНК 41
1.4 Полиморфизм ДНК человека на разных уровнях организации генома 43
1.4.1 Вариабельность мини - и микросателлитных повторов в некодирующих областях генома человека 45
1.4.2 Вариабельность микросателлитных тринуклеотидных повторов (CTG)n в 3’ - нетранслируемой области гена миотонической протеинкиназы человека 49
1.4.3 Неизвестные мутации митохондриальной ДНК 52
1.4.4 Количественные изменения нуклеиновых кислот, циркулирующих в плазме крови 56
2 Методы и материалы 59
2.1 Исследуемые группы 59
2.2 Выделение ДНК 61
2.3 Анализ вариабельности микросателлитных повторов 62
2.4 Анализ частоты аллелей (CTG)n 67
2.5 Определение доли внеклеточной митохондриальной ДНК с мутациями 68
2.6 Определение копийности ядерного ACTB и митохондриального ND1 генов 70
3 Результаты исследований и обсуждение 72
3.1 Изучение изменчивости микросателлитных повторов ДНК некодирующих областей генома 72
3.1.1 Изучение изменения уровня полиморфизма микросателлитных повторов ДНК из периферической крови в отдаленные сроки после облучения 72
3.1.2 Изучение уровня полиморфизма микросателлитных повторов после воздействия курсов радиационной и химиотерапии 78
3.1.3 Анализ частоты аллелей (CTG)n 85
3.1.4 Определение доли внеклеточной митохондриальной ДНК с мутациями 94
3.1.5 Изменение соотношения числа копий митохондриального и ядерного генов 96
4 Заключение 111
5 Выводы 112
6 Список сокращений 113
7 Список литературы 114
- Молекулярные маркеры для диагностики и мониторинга рака молочной железы
- Неизвестные мутации митохондриальной ДНК
- Анализ вариабельности микросателлитных повторов
- Изучение изменения уровня полиморфизма микросателлитных повторов ДНК из периферической крови в отдаленные сроки после облучения
Молекулярные маркеры для диагностики и мониторинга рака молочной железы
Развитие злокачественной опухоли является сложным многостадийным процессом, в основе которого лежит накопление генетических изменений, вызывающих злокачественные трансформации клеток. Основной причиной возникновения и развития злокачественного новообразования является нарушение в функционировании относительно небольшого числа генов, в частности протоонкогенов и антионкогенов (генов - супрессоров опухолевого роста). Кроме того, существуют гены-модуляторы, которые не вызывают непосредственно злокачественную трансформацию, но способствуют распространению опухоли в организме (Копнин 2000).
Как и многие злокачественные опухоли, рак молочной железы (РМЖ) имеет мультифакторную природу. В патогенезе заболевания важную роль играют онкогены и гены опухолевой супрессии. В основе инактивации генов–супрессоров опухолей и селективного роста злокачественных клеток лежат генетические и эпигенетические повреждения. Механизмом эпигенетических изменений служит обратимое присоединение метильной группы к цитозину в CG – динуклеотидах, расположенных в регуляторных участках генов. Это явление получило название аномального метилирования генов в опухоли. Считается, что эпигенетические нарушения при малигнизации являются наиболее ранними и могут иметь место задолго до клинической манифестации заболевания (Логинов и соавт. 2012).
К настоящему времени установлено, что метилирование генов ассоциировано с агрессивной формой опухоли и прогрессией заболевания. Следовательно, определение степени метилирования генов–супрессоров опухолевого роста может служить ранним маркером агрессивности опухолевого процесса и применяться для прогноза течения заболевании и выработки стратегии при лечении РМЖ (там же).
В настоящее время задачей практических онкологов является определение того набора наиболее значимых, дополняющих друг друга, показателей, который позволил бы при минимально возможной сложности обследования обеспечить максимальную эффективность лечения каждого больного.
Большая часть пациенток со злокачественными новообразованиями обращаются в медицинские учреждения при распространенном процессе. У многих даже при операбельной форме опухолевого процесса диагностируются отдаленные микрометастазы. Это обусловливает необходимость разработки новых и совершенствование существующих методов диагностики и лечения РМЖ.
В работе Логинова и соавт. (2012) был проведен анализ метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RARb2 и SEMA3B. Он показал достоверное увеличение метилирования данных регионов по сравнению с прилежащей гистологически нормальной тканью. Для пациенток с первично - множественными злокачественными новообразованиями гиперметилирование этих опухолевых генов - супрессоров было найдено также в прилежащей гистологически нормальной ткани. В то же время метилирование промоторного района гена RASSF1A в ДНК, полученных от доноров без онкологических заболеваний в анамнезе, выявлено не было. По результатам анализов было показано, что эпигенетические изменения в опухоли возникают раньше, чем структурные изменения ДНК и морфологические изменения в ткани.
Частота метилирования промоторного района гена RARb2 составила 46% при РМЖ и статистически достоверно отличалась от таковой в гистологически нормальной прилежащей ткани. Наличие метилирования промоторной области гена RAR2 в некоторых образцах ДНК гистологически нормальной ткани молочной железы и яичников пациенток, выявляемое с частотой до 2–4%, означает, что эта модификация может происходить в начале онкогенеза, предшествуя структурным изменениям в ДНК тканей. Была выявлена связь частоты изменения метилирования промоторного района гена RAR2 со стадией, степенью анаплазии и размером опухоли при РМЖ (там же).
Было показано, что промоторная область гена SEMA3B достоверно чаще метилирована в ДНК опухоли, чем в ДНК прилежащей гистологически нормальной ткани молочной железы. Также была выявлена достоверная прямая корреляция плотности метилирования со степенью злокачественности и стадией при РМЖ. Высокая частота метилирования в образцах ДНК опухолей и феномен выявления метилирования в нормальной ткани у пациентов с РМЖ (еще до возникновения морфологических изменений) могут указывать на связь метилирования гена SEMA3B с началом онкогенеза, что важно для использования этого теста в качестве маркера при комплексной диагностике рака.
Все это позволяет считать метилирование этих генов ранним событием в патогенезе РМЖ как процессе переключения функционирования тканевой системы от контролируемого метаболического состояния к аномальному метаболизму и неупорядоченному клеточному делению.
Многочисленные исследования выявили ряд антигенов, ассоциированных с РМЖ. СА 15-3 – онкомаркер, обладающий достаточно высокой специфичностью по отношению к РМЖ, наиболее распространен для анализа онкопатологии в Европе. Его аналог – СА 27.29 наиболее представлен в этнической группе Северной Америки и используется с той же целью (Bidard et al. 2012). Этот антиген продуцируется клетками карциномы молочной железы и определяется на поверхности секретирующих его клеток. Используется, как правило, для мониторинга эффективности лекарственного лечения опухоли. Два последовательных повышения уровня маркера указывают на прогрессию заболевания и могут служить основанием прекращения проводимой терапии или ее изменения. При рецидивах или метастазах рост концентрации этого маркера может опережать появление клинических симптомов на 6-9 месяцев.
Для прогрессии опухоли необходима собственная система кровообращения. Без развития новых сосудов невозможен рост опухоли, достигшей размеров 2 мм. В процессе неоангиогенеза ключевая роль отведена фактору роста эндотелия сосудов – VEGF и его рецепторов. При индукции роста клеток эндотелия и формировании новых капилляров происходит частичное поступление этого фактора роста в кровь, что имеет диагностическое значение.
Немаловажное значение имеет определение в крови содержания EGF и его растворимого рецептора р185. EGF – глобулярный белок, действующий как сильный митоген. Он контролирует пролиферацию эпидермальных и эпителиальных клеток. В комбинации с другими цитокинами он является фактором, опосредующим процессы ангиогенеза, играет важную роль в канцерогенезе.
р185 – гликопротеин, продукт гена НЕR2. В норме на эпителиальных клетках большинства органов присутствует в небольших количествах. Гиперэкспрессия этого белка наблюдается на большей части злокачественных новообразований. Высокая гомологичность этого белка с рецептором эпидермального фактора роста предполагает, что белок р185 может быть вовлечен в регуляцию клеточного роста и трансформации. Внеклеточный домен р185 высвобождается с поверхности раковых клеток, в которых происходит его гиперэкспрессия, что дает возможность определить его в сыворотке крови для ранней диагностики и мониторинга распространения опухоли.
Неизвестные мутации митохондриальной ДНК
Определение неидентифицированных изменений структуры геномной ДНК, полиморфизмов, мутаций является одним из самых затратных по времени и усилиям этапов для исследований, связанных с ДНК. Наибольшую популярность эти исследования получили в области медицины, и в частности в диагностике и мониторинге онкологических заболеваний. Во многих исследованиях количественные и качественные изменения циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы (сыворотки) крови рассматриваются как дополнительные маркеры для неинвазивного диагностирования и прогнозирования различных опухолевых патологий (Jakupciak et al. 2008, Kohler et al. 2009). В этих работах также приводятся доказательства того, что использование внеклеточной митохондриальной ДНК в качестве маркера не уступает ядерной ДНК в информативности полученных результатов и клинической значимости. Также митохондриальная ДНК в некоторых случаях может быть более удобным объектом для изучения. В частности известно, что единичная клетка содержит сотни копий митохондриальной ДНК против всего двух копий ядерной ДНК. Это играет важную роль при анализе ограниченного объема материала и повышает точность исследования (Ellinger et al. 2009). Еще одним неоспоримым преимуществом митохондриальной ДНК является возможность ее использования в качестве чувствительного биомаркера различных генотоксических воздействий. Это обусловлено большей ее повреждаемостью ионизирующей радиацией в связи с малой степенью белковой защиты и низкой эффективностью процессов репарации.
Золотым стандартом для обнаружения изменений ДНК, в частности в кодирующих участках интересующих генов, является амплификация каждого гена с помощью полимеразной цепной реакции и выполнение для них прямого сиквенса. Однако этот подход достаточно дорог и длителен по времени, особенно если интересующий ген имеет большое число экзонов или исследователю требуется проанализировать большое число образцов или генов. Таким образом, налаживание простого и эффективного скринингового метода для обнаружения неизвестных изменений ДНК является наиболее привлекающей к себе проблемой геномных исследований на сегодняшний день.
Исторически сложилось, что основанные на полимеразной цепной реакции подходы - одноцепочечный конформационный полиморфизм (SSCP - Single-Strand Conformation Polymorphism) и гетеродуплексный анализ (НА - heteroduplex analysis) - являлись наиболее часто используемыми для скрининга известных и неизвестных мутаций. Позднее эти методы распространились достаточно широко, т.к. они легки в исполнении, не требуют высокоспецифического оборудования или реагентов и характеризуются хорошим соотношением «стоимость – эффект».
Чувствительность SSCP по способности выявлять мутации колеблется от 50 до 100 % (Hayashi, Yandell 1993) в зависимости от подобранных экспериментальных условий. Размер анализируемых ДНК фрагментов довольно серьезно влияет на чувствительность этого метода. Если анализировать фрагменты 100-300 пар нуклеотидов, то чувствительность метода может достигать 97%, при этом падает до 67% при анализе фрагментов 300 - 450 пар нуклеотидов. Поскольку нет единых условий, которые одинаково подходили бы для всех фрагментов в SSCP анализе, то исследователям требуется оптимизировать условия в ходе нескольких подготовительных экспериментов для получения максимальной чувствительности. Чувствительность метода НА составляет около 80%. Длины фрагментов обычно такие же, как и для SSCP или немного больше. Данный метод имеет низкую чувствительность при определении единичных нуклеотидных замен по сравнению с инсерциями и делециями. На сегодняшний день наиболее популярны 2 модификации метода НА. Различия касаются состава геля и температурных условий. Это денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) и временной температурный гель-электрофорез (TTGE). Можно сказать, что эти модификации могут увеличить чувствительность, но это будет сделано в ущерб удобству исходных методик. Таким образом, эти модифицированные методы не стали так популярны, как первичный НА (там же). Еще одним развивающимся направлением в изучении анонимных мутаций является электрофорез на микрочипах, который отличается быстротой анализа. Была показана возможность использования микрочипов для SSCP и НА анализов, но конечные размеры фрагментов ограничивались размером 150 - 260 пар нуклеотидов. Преимуществом электрофореза на микрочипах является быстрота и малое количество образца, которое требуется для анализа. Однако до сих пор существует необходимость в улучшении чувствительности и специфичности метода для скрининга основных мутаций и до сих пор требуется преодолеть ограничение по размерам фрагментов.
В последнее время было разработано несколько новых высокочувствительных методов скрининга мутаций, основанных на полимеразной цепной реакции. По мнению Tsuji, Niida (2008) идеальный метод скрининга мутаций должен соответствовать определенным требованиям: использование традиционных приборов и коммерчески доступных реагентов, общий протокол, который может быть применен для любой ДНК последовательности и типа мутаций, возможность обрабатывать длинные фрагменты. Также метод должен обладать высокой чувствительностью, быстродействием, оптимальными экономическими характеристиками.
Анализ вариабельности микросателлитных повторов
ПЦР проводилась при следующих условиях: 94 C 1 минут; N C 1 минута; 72 C 5 минут. 35 циклов. N - температура отжига праймеров, указанная в таблице 2 (Uitterlinden, Vijg 1994, Santos et al.1995).
В состав смеси для проведения ПЦР объемом 25 мкл входили следующие компоненты: 1хPCR буфер (ЗАО «Лаборатория Изоген»), 200 мкM каждого dNTP, 3 мМ MgCl2, праймеры 10 нМ, 1 U Taq DNA полимераза (ЗАО «Лаборатория Изоген»), ДНК - матрица 20 нг. Сверху наслаивали 1-2 капли минерального масла.
ПЦР проводилась на программируемом термоциклере «Терцик» ЗАО «НПФ ДНК - Технология» (Москва).
Продукты ПЦР - амплификации разделяли электрофорезом в 6-% полиакриламидном геле в 1-кратном ТАЕ-буфере, рН 8.0 (Maniatis 1982).
Разделение продуктов ПЦР в полиакриламидном геле выполнялось с помощью прибора для вертикального электрофореза VE-3M (ООО «Компания Хеликон», Россия). Источником питания служил (PS-500-2, Sigma - Aldrich Techware, USA). Размер стекол прибора 20 х 20 см, толщина спейсеров 0.75 мм. Электрофорез шел при стабилизированном напряжении 200V в течение 5.30 – 6.30 часов при комнатной температуре. В качестве молекулярного маркера использовали FastRuler DNA Ladder (Fermentas).
Окрашивание азотнокислым серебром проводилось по методу (Caetano-Annoles, Gresshoff 1994) с небольшими модификациями по следующему протоколу: Процедура Компоненты гель выдерживали в уксусной кислоте CH3 COOH 7.5%, 25 минут промывание 3 раза по 2 минуты в дистиллированной воде гель выдерживали в растворе азотнокислого серебра AgNO3 1 г/литр, формалин до конечной концентрации 1,5 мл/литр; 25 минут промывание 1 раз 40-60 секунд в дистиллированной воде гель выдерживали в охлажденном растворе углекислого натрия до появления четкой картины полос амплифицированных продуктов на дорожках Na2 CO3 30 г/литр, формалин до конечной концентрации 3 мл/литр, Na2 S2 O5 (тиосульфат натрия) до конечной концентрации 2 мкг/л фиксация охлажденной уксусной кислотой CH3COOH 7,5%,10 минут промывание 2 раза по 5-10 минут в дистиллированной воде гель выдерживали в растворе глицерина C3 H8 O3 6%, 20-30 минут гель заворачивали в целлофан и высушивали на воздухе при комнатной температуре _ Изображение высушенных гелей оцифровывалось применением системы Док - принт Vilber Lourmat (Vilber Lourmat Systems Inc., Франция) и вносилось в компьютер с помощью сканера Epson Perfection 1650 Photo. Далее изображение обрабатывалось с применением специально разработанного программного обеспечения, позволяющего сравнивать различные ДНК – фингерпринты.
Программное обеспечение GelAnalyser, разработанное Скосыревым В.А. (Скосырев В.А, Васильева Г.В 2013), было создано на основе ранее разработанной утилиты в среде Delphi (Object Pascal) под управлением Windows. GelAnalyser позволяет реализовывать следующие задачи:
1. «Оцифровка» графических изображений гелей (поддержка BMP и JPG форматов), полученных с применением сканера, телекамеры или цифрового фотоаппарата.
2. Определение величин электрофоретической подвижности (Rf) продуктов на дорожках геля.
3. Сравнение спектров электрофоретических полос на сходство и различие составляющих их компонентов на основе определения нормированных координат (значений Rf) с представлением количественных оценок.
Производилась пошаговая оцифровка изображений отдельных дорожек электрофоретического разделения фрагментов ДНК. Rf каждой полосы указывает расстояние (в пикселях), на котором находится максимум интенсивности данной полосы от начала анализируемого участка геля. Каждая дорожка электрофореграммы содержит индивидуальный набор полос – продуктов амплификации, которые соответствуют месту посадки праймера на ДНК - матрице. Наряду со стабильно воспроизводимыми с одинаковой величиной Rf, имеются полосы, различающиеся у отдельных образцов. Это указывает на наличие уникальных, характерных для отдельного индивидуума, и полиморфных продуктов ПЦР амплификации.
Таким образом, в исследуемые параметры вошли следующие показатели: 1. Общее количество продуктов. Данный параметр необходим для подсчета процента полиморфизма. Весь набор амплифицированных фрагментов, полученных в ходе ПЦР, рассматривался как 100%. Доля полиморфных продуктов относительно их общего количества выражалась как процент полиморфизма. Однако этот параметр может быть использован и как самостоятельный критерий, позволяющий оценить различия образцов. Тенденции в увеличении или уменьшении количества продуктов, т.е. полос на ДНК - фингерпринте наводит на мысль об происходящих в местах посадки праймера изменениях. Чем большее количество полос доступно для оценки, тем достовернее будет виден полиморфизм.
2. Мономорфные и полиморфные продукты. Мономорфы – это стабильно появляющиеся во всех образцах полосы, обладающие, как правило, видоспецифической воспроизводимостью. Полиморфы – продукты ПЦР, характеризующие участки генома, подверженные изменениям. Это тот параметр, который представлял наибольший интерес в ходе работы. Как уже было сказано, процент полиморфизма рассматривался как доля полиморфных продуктов относительно их общего количества. Программное обеспечение позволяло отнести тот или иной продукт к полиморфным фрагментам на основании величины его Rf по сравнению с величиной Rf этого фрагментов на других дорожках. При программном анализе электрофореграмм задавался уровень отличий между Rf различных фрагментов на соседних дорожках. Если Rf фрагмента отличался не более чем величина заданного уровня отличия, и этот фрагмент присутствовал во всех анализируемых образцах, то он был отнесен к мономорфным продуктам. Если же различия в Rf между различными фрагментами превышали установленный уровень, то эти фрагменты обозначались как полиморфные продукты.
3. При групповом анализе уровня полиморфизма добавлялся еще один параметр, названный наличием уникальных фрагментов. Это фрагмент, полученный в ходе ПЦР – амплификации и представленный на электрофореграмме индивидуально в одном паттерне. При сравнении с другими паттернами данный фрагмент не встречается. При сравнении индивидуальных пар данных у пациентов, страдающих РМЖ, полиморфные продукты были представлены только уникальными фрагментами.
Изучение изменения уровня полиморфизма микросателлитных повторов ДНК из периферической крови в отдаленные сроки после облучения
Изучение результатов длительного медико-биологического обследования работников предприятий ядерной промышленности, подвергшихся в период профессиональной деятельности пролонгированному воздействию ионизирующей радиации, предоставляет уникальную возможность для прояснения феноменологии отдаленных последствий радиационного воздействия на человека. Для оценки вариабельности повторяющихся последовательностей ДНК был применен метод ПЦР-анализа с использованием 4 «мультилокусных» праймеров. Сайты связывания этих праймеров распределены по геному человека случайным образом, а полиморфизм в них выражается как наличие или отсутствие соответствующих продуктов ПЦР в полиакриламидном геле (Williams et al. 1993). Полный спектр таких продуктов с определенным «случайным праймером» для каждого образца ДНК называют «анонимным генетическим маркером» (Welsh et al. 1995). Изменение спектра продуктов может быть следствием перестроек генома типа амплификаций, инсерций, делеций в потенциальных местах отжига праймеров. Оценка полиморфизма размеров продуктов ПЦР с «мультилокусным» праймером на основе анализа изменений в спектрах продуктов ПЦР является основой для вывода о возникновении упомянутых перестроек.
Особенностью пролонгированного радиационного воздействия на профессионалов в условиях производственной деятельности является высокая степень его неравномерности по дозе и по времени. Поэтому в нашей работе при оценке отдаленных последствий воздействия ионизирующей радиации на профессионалов как референсный параметр рассматривается величина суммарной дозовой нагрузки. В зависимости от этой величины, доноры, подвергшиеся облучению, были разделены на пять групп по следующим дозовым диапазонам: 0,01 – 0,5 Гр; 0,51 - 1 Гр; 1,01 – 2 Гр; 2,01 – 3 Гр и 3,01 – 5,5 Гр. Кроме этого, значительно различалась длительность временного интервала между окончанием контакта с источниками ионизирующей радиации и моментом забора крови у донора. Длительность периода времени, прошедшего между окончанием воздействия ионизирующей радиации и моментом взятия крови составила 18 - 27 лет. Представленные в работе результаты касаются именно этой когорты.
В таблице 4 приведены значения доли мономорфных и полиморфных полос в спектрах продуктов ПЦР с «мультилокусным» праймером, полученных при электрофоретическом разделении амплифицированных фрагментов ДНК из клеток периферической крови работников ПО «Маяк», подвергавшихся и не подвергавшихся («контроль») пролонгированному воздействию ионизирующего излучения.
Для проведения данного исследования были подобраны две группы, включающие по 16 обследуемых индивидов. Это соответствовало минимальному количеству препаратов ДНК доноров в группах с установленной суммарной дозовой нагрузкой.
В образцах, полученных при амплификации препаратов ДНК из периферической крови людей, подвергшихся пролонгированному воздействию ионизирующей радиации в дозах от 0,01 до 2 Гр, количество полиморфных полос уменьшается, а мономорфных, соответственно, увеличивается относительно контроля.
Наибольшее число новых мономорфных полос и, соответственно, наименьшее количество полиморфных полос наблюдается в образцах, полученных при амплификации препаратов ДНК из периферической крови людей, подвергшихся пролонгированному воздействию ионизирующей радиации в дозах от 1,01-2 Гр.
Выявлена тенденция к понижению уровня полиморфизма при возрастании дозовой нагрузки до диапазона 1,1-2 Гр с дальнейшим его увеличением для праймера Mor+1. Для праймеров Telo, Atp-1наблюдается понижение уровня исследуемого признака при возрастании дозовой нагрузки до диапазона 1,1-2 Гр с дальнейшим увеличением, а затем снижением показателя.
Еще одним важным результатом наших исследований является отсутствие пропорциональной дозовой зависимости уровня полиморфизма микросателлитных повторов в указанном диапазоне дозовых нагрузок у мужчин - профессионалов ПО «Маяк». Но это можно было ожидать с учетом данных, представленных в работах отечественных и зарубежных коллег (Little 2010, Doss 2013). Действительно, результаты исследования на лимфоцитах периферической крови работников ядерного завода в Селлафилде (Великобритания), перенесших воздействие внешних источников ионизирующей радиации в суммарной дозе до 1873 мЗв, не выявили пропорциональных изменений от накопленной дозы по параметру полиморфизма микросателлитных локусов в четырех генах, вовлеченных в систему репарации ДНК (Wilding et al. 2005). В эпидемиологическом обследовании жителей прибрежных сёл реки Теча не обнаружено прямой зависимости от накопленной дозы уровня полиморфизма минисателлитных локусов ДНК в мужских половых клетках у пострадавших лиц (Аклеев и соавт. 2007).
Можно полагать, что отсутствие линейной зависимости обусловлено выявлением эффектов in vivo, на которые в разной степени накладывают отпечаток такие модифицирующие факторы, как радиочувствительность, репарационные процессы, адаптивный ответ и т.д. С одной стороны, происходит адаптация – отбор и размножение клеток с более резистентным генотипом. Это приводит к снижению радиочувствительности, что может выражаться в снижении уровня полиморфизма в дозовом диапазоне 1,1 - 2 Гр. С другой стороны возникает генетическая нестабильность, приводящая к возрастанию частоты генетических нарушений, что объясняет повышенный уровень полиморфизма во всех дозовых диапазонах по сравнению с контролем.
Полученные результаты позволяют говорить о наблюдаемом повышении степени генетической изменчивости, оцениваемой по уровню полиморфизма микросателлитных повторов. Радиобиологический Репозиторий Тканей Человека Южно-Уральского института биофизики ФМБА (г. Озёрск) не располагает образцами крови или препаратами ДНК, полученными в динамике работы профессионалов в радиационно-опасных условиях. Поэтому мы не имели возможности сравнивать индивидуальные значения уровня полиморфизма у одних и тех же лиц до случая первого воздействия радиации и после завершения трудовой деятельности или случая последнего облучения. Контрольная группа была выбрана из доноров, максимально схожих по возрасту и профилю трудовой деятельности. Значимые в сравнении с контрольной группой изменения уровня полиморфизма микросателлитных повторов ДНК выявлены в группах работников производственного объединения «Маяк» с накопленными за длительный период профессиональной деятельности дозами от 0,5 Гр и выше.
Таким образом, можно сделать вывод о повышении степени генетической изменчивости, оцениваемой по уровню полиморфизма микросателлитных повторов, в изучаемой группе. Важной особенностью этой части исследования была длительность периода времени между окончанием работы с источниками ионизирующей радиации и моментом взятия образцов крови, которая составляла 18 - 27 лет. Эти обстоятельства позволяют предполагать, что в условиях весьма неравномерного длительного радиационного воздействия в кроветворных клетках человека формируется и длительно (вероятно, пожизненно) сохраняется состояние «радиационно-индуцированной нестабильности генома» (Дуброва, 2006, Ломаева и соавт. 2013).
В работе Костюк и соавт. (2008) у 153 сотрудников ГНЦ РФ Физико-энергетического института (г. Обнинск) определяли свойства внеклеточной ДНК плазмы крови (общая концентрация, размеры фрагментов, концентрация и содержание во внеклеточной ДНК повтора сателлита III (1q12), а также частоту лимфоцитов с мутациями по локусу Т-клеточного рецептора. Было обнаружено, что концентрация внеклеточной ДНК варьирует от 15 до 737 нг/мл. Внеклеточная ДНК представлена длинными фрагментами (примерно 20000 пар нуклеотидов). Частота лимфоцитов с мутациями по локусу T-клеточного рецептора у работников превышала средние значения этого параметра у необлученных лиц. Авторы полагают, что эти параметры могут «оказаться полезными при выявлении лиц, у которых в процессе облучения происходит интенсивный апоптоз клеток организма, существует повышенная вероятность канцерогенеза и развития заболеваний иммунной системы».
В работе Асеевой и соавт. (2009) исследования проводились на лимфоцитах периферической крови, полученных от группы профессионалов – атомщиков г. Сарова, подвергавшихся действию внешнего гамма - нейтронного облучения в процессе производственной деятельности, включающей участие в полигонных испытаниях ядерных боеприпасов, работу на исследовательских реакторах. Цитогенетическое обследование проводилось с 1998 по 2000 г. Возраст профессионалов – атомщиков на момент обследования варьировал от 45 до 85 лет.
