Введение к работе
Актуальность темы исследования. Одной из фундаментальных задач современной биофизики является регулирование процесса пероксидного окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран для обеспечения правильного функционирования организма человека на клеточном уровне и предотвращения накопления в организме канцерогенных и мутагенных молекулярных продуктов и свободных радикалов. Кроме того, понимание влияния различных факторов на кинетику ПОЛ находит важное прикладное применение в разработке способов ингибирования и предотвращения пероксидного окисления полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) липидов, входящих в состав многих пищевых и косметических продуктов. Биологическая роль ПНЖК омега-3 и омега-6 типов заключается в препятствии развития атеросклероза, улучшении кровообращения, кардиопротекторном и антиаритмическом действии, уменьшении воспалительные процессов в организме и улучшении питания тканей. ПНЖК омега-3 и омега-6 типов являются невосполнимыми, поскольку они не синтезируются de novo в тканях позвоночных животных и человека и могут быть получены только из пищи. Задача о предотвращении пероксидного окисления ПНЖК липидов значительно осложняется тем, что в современных продуктах питания используется большое количество эмульгированных жиров. Входящие в состав жиров ПНЖК намного активнее подвергаются атаке реактивных форм кислорода и других прооксидантов из-за протяженной границы раздела фаз в дисперсной системе. Поэтому, формирование на границе раздела фаз вода-масло защитной оболочки, содержащей вещества, ингибирующие ПОЛ, представляется перспективным способом предотвращения пероксидного окисления ПНЖК липидов, а практическая задача находится на стыке таких наук, как биофизика (выяснение механизмов регуляции процесса ПОЛ) и физическая химия (стабилизация дисперсной фазы эмульсии, процессы адсорбции на границе раздела фаз для получения покрытия из молекулярного комплекса, нерастворимого как в воде, так и в масле).
Многослойные пленки [1] на поверхности частиц микронного размера, образуемые последовательной адсорбцией макромолекул синтетических и природных полимеров, хорошо зарекомендовали себя для получения микроконтейнеров, с помощью которых возможно капсулирование широкого спектра веществ - полимеры, белки, нуклеиновые кислоты и некоторые лекарственные препараты. Благодаря слоистой структуре пленки в нее легко могут быть включены различные функциональные элементы (молекулы, образующие комплексы, чувствительные к рН и/или ионной силе, наночастицы, красители и т.д.), позволяющие контролируемо высвобождать содержимое микроконтейнера и управлять его положением в пространстве [2-5]. Для использования микроконтейнеров в живых системах, особую актуальность имеет разработка биосовместимых и биодеградируемых оболочек [6, 7].
Для защиты ПНЖК от пероксидного окисления, функциональными элементами могут служить молекулы, ингибирующие процесс ПОЛ. В работах Д.Д. Макклементса было показано замедление пероксидного окисления ПНЖК липидов, входящих в состав эмульгированных масел, используя в качестве эмульгатора сывороточные протеины [8]. Однако защита, обеспечиваемая такой оболочкой, оказалась эффективна лишь при низких значениях рН дисперсионной среды. Как альтернативный способ ингибирования пероксидного окисления липидов, было предложено в качестве дисперсионной среды использовать раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты [9] (хелатирующего агента, связывающего катионы переходных металлов, которые являются прооксидантами, так как могут разветвлять цепь реакций пероксидации и тем самым ускорять процесс ПОЛ, а так же вступать в реакции с образованием реактивных форм кислорода [10]). Таким образом, задача ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов в эмульсиях остается во многом нерешенной. В частности, необходима разработка универсальной защитной оболочки, способной эффективно ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов независимо от состава дисперсионной среды. Включение хелатирующего агента непосредственно в оболочку на поверхности дисперсной фазы представляется эффективным решением задачи ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов в эмульсиях, тем более, что было продемонстрировано успешное формирование многослойной пленки, в состав которой входит хелатирующий агент - танниновая кислота, на поверхности плоской подложки и показано, что такая пленка способна ингибировать окисление гемоглобина [11].
Анализируя современное состояние исследований, ориентированных на
разработку лекарственных препаратов, можно убедиться в том, что: 1) часть
лекарственных препаратов в необходимых для лечения дозах токсична для
пациентов; 2) эффективность некоторых препаратов снижается при достижении
очага воздействия из-за нивелирования активности окружающей средой; 3)
адресная доставка некоторых препаратов затруднена. В связи с этим
капсулирование биологически-активных веществ (БАВ) методом
последовательной адсорбции макромолекул [12] может также решить проблемы повышения эффективности доставки, обеспечивая защиту БАВ, и позволяя контролировать локальность и момент их высвобождения, тем самым, приводя к разработке новых эффективных форм лекарственных препаратов. Объектом исследования являются многослойные биосовместимые полимерные и нанокомпозитные покрытия, формируемые на поверхностях с различной геометрией и физико-химическими свойствами (диспергированные в водной фазе микрочастицы масла, неорганические пористые микрочастицы, поверхность свежеотчужденных зубов).
Предметом исследования является получение биосовместимых многослойных покрытий и оболочек микроконтейнеров, включающих функциональные элементы
(вещества, ингибирующие пероксидное окисление ПНЖК липидов; углеродные одностенные трубки и металлические наночастицы) для обеспечения защиты субстрата или содержимого микроконтейнеров от повреждающих факторов внешней среды (УФ- излучение, прооксиданты).
Цель и задачи исследования. Цель исследования состоит в разработке и
получении стабильных, биосовместимых и биодеградируемых
наноструктурированных оболочек, капсулирующих дисперсную фазу эмульсии льняного масла, обеспечивающих эффективную защиту ПНЖК липидов от пероксидного окисления, инициированного прооксидантами и ультрафиолетовым излучением.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
сформировать стабильные оболочки, капсулирующие дисперсную фазу эмульсии льняного масла, включающие вещества, ингибирующие пероксидное окисление ПНЖК липидов;
изучить влияние физико-химических параметров эмульсионной системы, таких как толщина и состав оболочек, капсулирующих дисперсную фазу эмульсии, на скорость процесса пероксидного окисления ПНЖК липидов, используя в качестве дисперсионной среды чистую воду, а также водные растворы, содержащие прооксиданты (ионы железа (II) в физиологической и более высоких концентрациях, пероксид водорода);
сравнить эффективность защиты от пероксидного окисления капсулированных ПНЖК липидов при расположении ингибитора пероксидации в ядрах и в оболочках микроконтейнеров типа «жидкое гидрофобное ядро/многослойная оболочка»;
исследовать эффективность защиты капсулированных ПНЖК липидов оболочками микроконтейнеров, содержащих танниновую кислоту, при инициации пероксидного окисления ультрафиолетовым излучением;
получить многослойные оболочки, капсулирующие дисперсную фазу эмульсии льняного масла, содержащие танниновую кислоту - вещество, способное ингибировать пероксидное окисление ПНЖК липидов, и белок - бычий сывороточный альбумин, и установить возможность ферментативной деградации таких оболочек;
исследовать цитотоксичность полых микроконтейнеров, содержащих танниновую кислоту, для клеточной линии L929 фибробластов мыши;
создать нанокомпозитные покрытия на поверхности неорганических микрочастиц и образцах свежеотчужденных зубов, содержащие одностенные углеродные трубки, наночастицы оксидов железа, золотые наночастицы. Научная новизна исследования.
1. Разработаны многослойные биосовместимые оболочки микроконтейнеров
для ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов льняного масла,
содержащие хелатирующие агенты (танниновая кислота,
диэтилентриаминпентауксусная кислота). Показана высокая агрегативная устойчивость микроконтейнеров льняного масла, содержащих в оболочке танниновую кислоту.
Показана стабильность ПНЖК липидов к пероксидному окислению при температуре +37С в течение по крайней мере 15 дней, при условии что дисперсная фаза эмульсии льняного масла была капсулирована в многослойные оболочки, содержащие один слой танниновой кислоты. Стабильность к пероксидному окислению показана как в чистой воде, взятой в качестве дисперсионной среды, так и в присутствии в дисперсионной среде прооксиданта -ионов железа (II) в физиологической концентрации и в 10 раз превышающей её.
Установлено влияние локализации веществ, ингибирующих пероксидное окисление ПНЖК липидов льняного масла, в эмульсиях на концентрацию продуктов окисления в образцах.
Показана возможность ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов капсулированных в оболочки, содержащих танниновую кислоту при инициировании пероксидации ультрафиолетовым излучением.
Показана возможность ингибирования пероксидного окисления ПНЖК липидов, капсулированных в оболочки, содержащих ферменты каталаза и супероксиддисмутаза.
Получены стабильные к коалесценции многослойные оболочки из белка (бычий сывороточный альбумин) и танниновой кислоты, капсулирующие дисперсную фазу эмульсии льняного масла, деградируемые посредством фермента а-химотрипсин.
Получены и исследованы многослойные нанокомпозитные оболочки микроконтейнеров из полиимидных полимерных щеток и наночастиц оксидов магнетита.
Сформированы нанокомпозитные покрытия, содержащие золотые наночастицы, на поверхности свежеотчужденных зубов.
Практическая значимость работы.
Созданы микроразмерные контейнеры, капсулирующие во внутреннюю полость гидрофобное вещество (льняное масло - источник полиненасыщенных жирных кислот типа Омега-3 и Омега-6), ингибирующие ПОЛ, что позволяет на их основе разрабатывать объекты для капсулирования лекарственных средств и субстанций для фармацевтической промышленности.
Лучший уровень защиты от пероксидного окисления липидов полиненасыщенных жирных кислот (в течение 15 дней не происходит образования продуктов окисления) в чистой воде, в растворе, содержащем ионы железа (II), а также под действием ультрафиолетового излучения, был показан для образцов микроконтейнеров с оболочками, содержащими танниновую кислоту. Биотест, проведенный с фибробластами мышей и полыми микроконтейнерами, включающими танниновую кислоту, показал высокую активность
жизнедеятельности клеток (около 81%). Таким образом, микрообъекты, заключающие во внутреннюю полость окисляющиеся масла, и ингибитор окисления - танниновую кислоту — в оболочках, могут быть основой для создания косметологических продуктов.
Наноструктурированная оболочка микроконтейнеров содержит в качестве эмульгатора белок, ориентация которого подобна ориентации интегральных белков мембраны клетки согласно жидкостно-мозаичной модели. Введение в оболочку ингибирующего окисление вещества, например, танниновой кислоты, предопределяет возможность получения новой модели для изучения протекания пероксидного окисления липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, в мембранах клеток.
Для создания систем адресной доставки лекарственных средств путем микрокапсулирования определяющим также является вопрос локального высвобождения препарата. Приведенный механизм высвобождения биологически активных веществ посредством специфичного фермента является одним из таких селективных методов. Достоверность полученных результатов.
Достоверность полученных результатов подтверждается применением научного оборудования, которое верифицируется в соответствии с международными стандартами обеспечения единства измерений и единообразием средств измерений.
Основные результаты исследований выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие результаты исследований:
устойчивость к окислению в деионизованной воде и в растворе, содержащем физиологическую концентрацию ионов железа (II), а также под воздействием ультрафиолетового излучения (длина волны излучения - 254 нм, плотность мощности излучения - 69 мкВт*см~2, время воздействия - 90 мин) содержимого контейнеров субмикронных и микронных размеров, созданных путем эмульгирования льняного масла, покрытых оболочками с биодеградируемыми компонентами: танниновой кислотой, являющейся ингибитором пероксидного окисления липидов, и гидробромидом поли-Ь-аргинина;
инициирующее действие ионов железа (II) в экспериментах in vitro по изучению защиты от пероксидного окисления заключенных во внутреннюю полость микроконтейнеров липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, хелатирующим агентом - танниновой кислотой, являющейся компонентом оболочек, в водных растворах ионов железа (II) и перекиси водорода;
ферментативная защита от пероксидного окисления заключенных во внутреннюю полость микроконтейнеров липидов, включающих полиненасыщенные жирные кислоты, посредством капсулированных в оболочки микроконтейнеров белков каталаза и супероксиддисмутаза;
возможность разрушения оболочек микроконтейнеров состава {бычий сывороточный альбумин/танниновая кислота/бычий сывороточный альбумин} специфичным ферментом а-химотрипсин, доказанная методом конфокальной сканирующей лазерной микроскопии;
цитотоксичность полых микроконтейнеров (структуры оболочек {натриевая соль декстран сульфата/гидробромид поли-Ь-аргинина/танниновая кислота/ гидробромид поли-Ь-аргинина} и {натриевая соль декстран сульфата/гидробромид поли-Ь-аргинина} 2), которая определенна с помощью биотеста, основанном на спектрофотометрическом определении продуктов метаболизма клеток, показанная на мышиных фибробластах (клеточная линия L 929), дыхательная активность жизнедеятельности составляет 81% от нормальной для образца с танниновой кислотой и 84% от нормальной для образца с натриевой солью декстран сульфата при количестве микроконтейнеров 100 штук на одну клетку.
Апробация работы.
Основные результаты диссертационного исследования были представлена в работе 1-ой Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (1 st International summer school "Nanomaterials and nanotechnologies in living systems") (Москва, 2009, подача тезисов); в работе XIII ежегодной международной Школы для молодых учёных и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике «Saratov Fall Meeting-2009» в конкурсе «У.М.Н.И.К.» («Участник молодёжного научно-инновационного конкурса 2009») (Саратов, 2009, устный доклад); на «18 Международной Конференции по Биоинкапсулированию» (XVIII International Conference on Bioencapsulation) (Португалия, 2010, стендовый доклад); на «Второй Конференции по Молекулярным Материалам» (2nd Molecular Materials Meeting) (Сингапур, 2012, стендовый доклад); на Всероссийском конкурсе бакалавров и магистрантов по направлению «Биомедицинские материалы и покрытия» (Саратов, 2010, устный доклад, доклад отмечен дипломом второй степени); на конкурсе научно-практических работ аспирантов в «Институте изучения материалов и техники» (Сингапур, IMRE A* STAR, 2010-2011, стендовый доклад); на семинарах научной группы под руководством профессора Г.Б. Сухорукова в Университете Лондона, Королевы Марии (Великобритания, Queen Mary University of London, 2009, 2011, устные доклады); на семинарах научной группы под руководством ведущего научного сотрудника М.Н. Антипиной в «Институте изучения материалов и техники» (Сингапур, IMRE A*STAR, 2010-2011, устные доклады); на семинарах научной группы доцента Д.А. Горина в Саратовском государственном университете имени Н.Г. Чернышевского (Саратов, 2010, 2011, устные доклады). Гранты.
Финансовая поддержка проводимой работы осуществлялась при помощи следующих проектов: «Создание нанокомпозитных планарных слоев и оболочек
микрокапсул методом полиионной сборки и исследование их физических свойств» (Мин. образования и науки РФ РИ-19.0/002/227 ГК №02.442.11.7183) (2005 г.); «Формирование нанокомпозитных микро- и наноразмерных структур и исследование их физических свойств» (Мин. Образования и науки РФ РИ-19.0/001/051 ГК №02.442.11.7249) (2006 г.); «Функционализация поверхности дисперсной фазы эмульсионных систем неорганическими наночастицами » (Мин. образования и науки РФ, грант РФФИ № 09-03-00245-а) (2009-2011); стажировка, финансово поддерживаемая согласно заключенному соглашению на проведение совместных исследований между Саратовским государственным университетом и Университетом Лондона, Королевы Марии (Queen Mary University of London) (2009 г.); стажировка «A* STAR Research Attachment Programme (ARAP)» («A* STAR исследовательская программа») г. Сингапур, которая проводилась при поддержке Университета Лондона, Королевы Марии; стажировка в Университет Лондона, Королевы Марии в рамках Программы развития Национального исследовательского Саратовского государственного университета (2010 г). Личный вклад диссертанта.
Получение микроконтейнеров, изучение их физико-химических свойств и устойчивости к пероксидному окислению содержимого, эксперименты по энзиматической деградации оболочек, характеризация микроконтейнеров с помощью растровой электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, методом спектроскопии комбинационного рассеяния света, а так же анализ литературы по соответствующей тематике были проведены автором. Публикации.
За время работы над диссертацией опубликовано 15 работ, из них: 4 статьи в журналах из списка ВАК, 11 работ опубликовано в материалах и сборниках тезисов конференций.
Объем, логика и структура работы обусловлены поставленной целью и
сформулированными задачами исследования, а также требованиями,
предъявляемыми к диссертационным работам. Диссертация состоит из введения,
пяти глав, заключения и библиографии. В тексте работы содержатся таблицы,
схемы, диаграммы и графические иллюстрации. Общий объем диссертации
составляет страниц, включая рисунков и таблиц.
