Фемтосекундные процессы разделения зарядов в реакционных центрах бактериального фотосинтеза Яковлев, Андрей Георгиевич

Введение к работе

Актуальность темы. Фотосинтез - это глобальный биологический процесс преобразования солнечной энергии в энергию химически устойчивых соединений. Фотосинтез растений и водорослей является основным источником кислорода и органических соединений на Земле, которые служат для питания человека и животных в настоящее время, а также запасены в виде ископаемых углеводородов. Солнечная энергия - это практически неисчерпаемый и экологически чистый вид энергии. Важность исследований процессов фотосинтеза является очевидной как с научной стороны, так и с прикладной.

Фотосинтез представляет собой совокупность сложнейших физических и химических превращений, которые начинаются с поглощения квантов света в светособирающих комплексах хлорофилла. Затем энергия возбуждения передается на реакционные центры (РЦ) фотосинтеза, представляющие собой особые пигмент-белковые комплексы в составе клеточной мембраны. Создание лазерных спектрометров сверхвысокого временного разрешения в сочетании с методами направленного мутагенеза и получением рентгеноструктурных данных о трехмерном строении ряда РЦ обусловило быстрый рост объема данных о первичных этапах фотосинтеза. Эти данные имеют фундаментальный характер и формируют современные представления о мире. В результате серии быстрых реакций переноса электрона в РЦ происходит первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов с феноменальной квантовой (~100%) и высокой энергетической эффективностью. Универсальность структуры и функции РЦ всех известных фотосинтезирующих организмов заключается в том, что первичное разделение зарядов в этих РЦ происходит между синглетно- возбужденным первичным донором электрона Р и производными хлорофилла. В РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides, которая является классическим объектом изучения, разделение зарядов происходит вдоль фотоактивной А-цепи пигментов и заключается в переносе электрона от возбужденного димера бактериохлорофилла P* на бактериофеофитин Н_А за ~3 пс и далее с H_a^- на хинон Q_a за ~200 пс [Holten et al., 1980; Paschenko et al., 1985; Kaufmann et al., 1975; Rockey et al., 1975].

Проблема участия молекулы мономерного бактериохлорофилла В_А в качестве промежуточного акцептора в первичном разделении зарядов имеет многолетнюю историю и логично следует из положения В_А между Р и Н_А согласно рентгеноструктурным данным [Deisenhofer et al., 1984; Ermler et al., 1994]. В течение долгого времени в большом количестве лидирующих лабораторий не удавалось получить убедительные доказательства прямого участия В_А в разделении зарядов. Во многом благодаря этому возникло представление о виртуальном участии вакантного электронного уровня В_А, находящегося выше уровня Р*, в переносе электрона от Р на Н_А по механизму суперобмена. Результаты пико- и фемтосекундной спектроскопии постепенно привели к пониманию основной сложности обнаружения состояния РВ_А^-, которая связана с тем, что время образования РВ_А^- в несколько раз превышает время его распада из-за переноса электрона с В_А^- на Н_А [Holzapfel et al., 1989, Arlt et al., 1993]. Это приводит к малой заселенности состояния Р В_А^- в течение всего времени его существования, которое не превышает нескольких пс. Другая сложность связана с тем, что в видимом диапазоне, где проводилось подавляющее большинство измерений, спектр состояния РВ_А^- сильно замаскирован спектрами других состояний. Получить убедительное доказательство существования состояния РВ_А^- удавалось только в химически модифицированных РЦ, в которых блокирование переноса электрона на На приводило к накоплению состояния РВ_А^- в пикосекундном диапазоне [Kennis et al., 1997]. Тем не менее, вопрос об участии молекулы Ва в переносе электрона в нативных РЦ оставался во многом открытым.

Ближайшее окружение молекулы В_А может влиять на первичное разделение зарядов, динамически воздействуя на уровень свободной энергии состояния РВ_А^- или являясь составной частью пути переноса электрона. Интересной и практически неизученной стороной этой проблемы является влияние молекулы воды, обнаруженной недавно в непосредственной близости от В_А [Ermler et al., 1994]. Другим важным аспектом является выявление механизма существенного влияния молекулы тирозина М210, расположенной вблизи В_А, на первичное разделение зарядов [Hamm et al, 1993]. Кроме того, движение ядерной подсистемы, на фоне которого происходит перенос электрона, также влияет на параметры первичной реакции разделения зарядов [Vos et al., 1991, 1993]. Для решения вопроса об участии определенных мод этого движения в разделении зарядов в РЦ необходима прямая регистрация первичного состояния фотопродукта методами фемтосекундной спектроскопии.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование вовлеченности молекулы бактериохлорофилла Ва и ее ближайшего окружения в первичную (физическую) фазу разделения зарядов в РЦ бактериального фотосинтеза. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать участие молекулы бактериохлорофилла в А-цепи В_А в первичном разделении зарядов в РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides R-26 и зеленой бактерии Chloroflexus (Cfx). aurantiacus, для чего: а) Определить взаимное расположение уровней свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами P⁺B_a^- и возбужденного состояния димера бактериохлорофилла Р* в РЦ Rba. sphaeroides R-26;

б) Исследовать динамику формирования и распада ИК полосы поглощения аниона бактериохлорофилла B_a^- в процессе первичного разделения зпрядов в РЦ.

1. Исследовать влияние молекулы кристаллографической воды НОН55, входящей в состав РЦ Rba. sphaeroides R-26, на процессы первичного разделения и переноса зарядов.

2. Исследовать роль тирозина М210 в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов в РЦ Rba. sphaeroides R-26 и в РЦ мутантов по этому сайту.

3. Экспериментально и теоретически исследовать влияние коллективных движений ядерной подсистемы на процессы первичного разделения зарядов в РЦ фотосинтезирующих бактерий, для чего:

а) Исследовать влияние коллективных движений ядер на населенности состояний с первично разделенными зарядами при фемтосекундном световом возбуждении;

б) Провести теоретическое моделирование первичного разделения зарядов с учетом движений ядерного волнового пакета, который формируется при фемтосекундном возбуждении РЦ;

в) Исследовать возможность когерентного переноса электрона в малоактивную В-цепь пигментов РЦ.

Научная новизна работы.

3. 1. В результате исследования фемтосекундной динамики ИК полосы поглощения аниона мономерного бактериохлорофилла в А-цепи В_А^- впервые получено прямое доказательство реального участия В_А в первичном разделении зарядов в нативных РЦ Rba. sphaeroides R- 26 и Cfx. aurantiacus. Аналогичный вывод сделан и в отношении ряда мутантных РЦ Rba. sphaeroides. Таким образом, В_А является первичным акцептором электрона, а состояние PB_a^- - первичным состоянием с разделенными зарядами в этих РЦ.

   2. По результатам исследования температурной зависимости замедленной флуоресценции феофитин-модифицированных РЦ Rba. sphaeroides R-26 найдено, что уровень свободной энергии первичного состояния с разделенными зарядами PB_a^- находится ниже уровня свободной энергии возбужденного состояния димера Р* на ~550 см^-1. Положение уровня свободной энергии PB_a^- ниже аналогичного уровня Р* создает условия для реального участия молекулы В_А в переносе электрона от Р*.

   3. Впервые получены прямые экспериментальные доказательства влияния коллективных движений ядер (в форме волнового пакета) в возбужденном состоянии димера Р* на первичное разделение зарядов в нативных и мутантных РЦ Rba. sphaeroides и в нативных РЦ Cfx. aurantiacus. Показано, что обнаруженные осцилляции населенностей первичных состояний с разделенными зарядами отражают обратимые переходы волнового пакета ядер с поверхности потенциальной энергии Р* на аналогичные поверхности фотопродуктов. Выявлены характерные моды ядерных движений, сопряженные с переносом электрона.

   4. Впервые показано, что молекула кристаллографически определенной воды НОН55, расположенная вблизи бактериохлорофилла В_А в РЦ Rba. sphaeroides, оказывает сильное влияние на перенос электрона от димера бактериохлорофилла Р к Ва. Присутствие воды НОН55 ускоряет первичное разделение зарядов в ~4 раза, а ее вращение, регистрируемое при фемтосекундном возбуждении Р, модулирует населенность состояния P⁺Ba^- с частотой 32 см^-1 и кратными частотами. Анализ влияния воды НОН55 на перенос электрона с помощью мутантов по сайту М203 выявил один из возможных наиболее эффективных путей переноса электрона от Р к Ва с участием НОН55 по цепочке полярных групп атомов N-Mg(Pb) -N-C-N(HisM202)-HOH55-O=(Ba).

   5. Выявлена ключевая роль тирозина М210, находящегося вблизи димера Р и мономерного бактериохлорофилла Ва в РЦ Rba. sphaeroides, в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов. Впервые показано, что замедление первичной реакции переноса электрона в десятки раз в мутантных РЦ, не содержащих тирозин М210, сопровождается отсутствием стабилизации разделенных зарядов в состоянии PB_a^-. Показано, что отсутствие тирозина М210 в мутантных РЦ не компенсируется его введением в положение М197 или значительным увеличением разницы свободной энергии состояний Р* и Р+В_А^-. Выявлено стабилизирующее влияние полярной ОН-группы тирозина М210 на состояние PB_a^- в процессе разделения зарядов в тирозин-содержащих РЦ.

   6. Впервые в мутантных РЦ Rba. sphaeroides и в РЦ Cfx. aurantiacus обнаружен обратимый перенос электрона в малоактивную В-цепь, вызванный когерентным движением ядерного волнового пакета. Этот перенос возникает раньше на 60-80 фс, чем аналогичный когерентный перенос электрона в фотоактивной А-цепи. Возникновение когерентного переноса электрона в В-цепи не зависит от наличия или отсутствия условий для обычного, некогерентного переноса, а определяется в основном динамикой волнового пакета.

   Научная и практическая значимость. Работа имеет выраженную фундаментальную направленность. Получена новая информация о самых ранних стадиях процессов преобразования световой энергии в энергию состояний с разделенными зарядами в реакционных центрах бактериального фотосинтеза. Полученные результаты имеют приоритетный характер и во многом задают направление исследований в данной области. Работы по выявлению участников первичного разделения зарядов в РЦ, исследования по когерентному переносу электрона в обеих цепях РЦ, изучение роли ближайшего окружения первичного донора Р и акцептора В_А в разделении зарядов между ними - все эти направления находятся в русле мировых исследований. Данные по участию мономера бактериохлорофилла Ва в первичном разделении зарядов, по когерентным осцилляциям в первичных состояниях с разделенными зарядами, по влиянию кристаллографической воды НОН55 в переносе электрона, по ключевой роли тирозина М210 в стабилизации первично разделенных зарядов, по обратимому переносу электрона в неактивную В-цепь получены впервые. Полученные результаты могут найти применение при моделировании живых систем и создании преобразователей солнечной энергии. Основные положения, выносимые на защиту.

   3. 6. 1. Мономер бактериохлорофилла В_А является первичным акцептором электрона в РЦ Rba. sphaeroides и Cfx. aurantiacus, участвуя в двухступенчатой схеме переноса электрона от возбужденного димера бактериохлорофилла Р* к В_А и далее от В_А

         к бактериофеофитину Н_А. Этому способствует положение уровня свободной энергии состояния P⁺B_a^- ниже аналогичного уровня Р* на ~550 см^-1.

         3. 6. 2. Коллективные движения ядер влияют на первичное разделение зарядов в РЦ Rba. sphaeroides и Cfx. aurantiacus и визуализируются в виде осцилляций, возникающих в результате фемтосекундного возбуждения РЦ в населенностях первичных состояний с разделенными зарядами и в населенности возбужденного состояния димера Р*. Временные и спектральные особенности данных осцилляций отражают движение ядерного волнового пакета по поверхностям потенциальной энергии указанных состояний. Теоретическое моделирование коллективных ядерных движений с помощью теории Редфилда в приближении двух независимых координат объясняет осциллирующий характер процессов первичного разделения зарядов и формирования соответствующих состояний с разделенными зарядами в РЦ.

               3. Молекула воды НОН55, расположенная в РЦ Rba. sphaeroides между димером бактериохлорофилла Р и мономером бактериохлорофилла В_А, ускоряет перенос электрона от Р* к В_А, который может происходить по цепи полярных групп атомов N-Mg(P_B) -N-C- N(HisM202) -HOH55-O=(B_A). Вращение этой молекулы, выявляемое при фемтосекундном световом возбуждении димера Р, происходит с фундаментальной частотой 32 см^-1 и приводит к появлению моды 32 см^-1 и ее обертонов в осцилляциях кинетики полосы поглощения аниона бактериохлорофилла В_А^- при 1020 нм. 4. Тирозин М210, находящийся вблизи димера бактериохлорофилла Р и мономера бактериохлорофилла В_А в РЦ Rba. sphaeroides, играет ключевую роль в процессе первичного разделения зарядов и стабилизации разделенных зарядов в этих РЦ. Отсутствие тирозина М210 в мутантных РЦ приводит к значительному замедлению первичного разделения зарядов и отсутствию стабилизации разделенных зарядов. Взаимодействие полярной ОН-группы TyrM210 с заряженными молекулами P⁺ и B_a^- ускоряет разделение зарядов между ними и стабилизирует состояние PB_a^- в нативных РЦ Rba. sphaeroides.

               Апробация результатов. Основные результаты диссертации отражены в 37 публикациях и доложены на рабочем совещании « Реакционные центры фотосинтетических бактерий: структура и динамика» (Фелдафинг, Германия, 1995); XI международном конгрессе по фотосинтезу (Будапешт, Венгрия, 1998); на XI международном симпозиуме «Сверхбыстрые явления в спектроскопии» (Тайпей, Тайвань, 1999); на 60-ом ежегодном Тимирязевском чтении (Москва, 1999); на XII международной конференции «Сверхбыстрые процессы в спектроскопии» (Флоренция, Италия, 2001); на III съезде Российского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); на III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); на 13-ом международном конгрессе по фотосинтезу (Монреаль, Канада, 2004); на 14-ой европейской конференции по биоэнергетике (Москва, 2006); на 3- ей Московской международной конференции по компьютерной молекулярной биологии (Москва, 2007); на международной конференции «Преобразование световой энергии при фотосинтезе (Пущино, 2008); на 4-ой Московской международной конференции по компьютерной молекулярной биологии (Москва, 2009); на XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции "Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах" (Пущино, 2009); на 15-ом международном конгрессе по фотосинтезу (Пекин, Китай, 2010); на семинарах НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова и кафедры биофизики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

               Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 работ (25 - в журналах и сборниках, 12 - в трудах конференций и конгрессов), список которых приведен в конце автореферата. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы работы изложены на 263 страницах

               машинописного текста, включая 69 рисунков. Список литературы содержит 368 библиографических ссылок.

               Похожие диссертации на Фемтосекундные процессы разделения зарядов в реакционных центрах бактериального фотосинтеза

               Локальное разделение зарядов в мембране при адсорбции и ионном транспортеСоколов, Валерий Сергеевич

               Эффекты неконтактности переноса электрона в неадиабатических процессах разделения и рекомбинации зарядовФранцузов, Павел Анатольевич

               

               Квантово-механические расчеты колебательных спектров и структуры кофакторов реакционного центра фотосинтеза Зиганшина Ольга Дмитриевна

               Теоретический анализ спектров ЭПР последовательных радикальных пар реакционных центров фотосинтезаКандрашкин, Юрий Евгеньевич

               

               Структура и фотосинтез хвои видов p. Juniperus на Северо-Востоке европейской части РоссииГерлинг Наталья Владимировна

               

               Моделирование процессов разделения компонентов пар взаимодействующих дефектов в ионных кристаллахЯковлев Алексей Николаевич

               Модель процесса разделения деформируемого телаКузнецов Кирилл Александрович

               

               Теоретическое исследование аэродинамики и процессов разделения твердых частиц в дисковых элементах ротационных сепараторов Арбузов Валерий Николаевич

               Теплофизические основы процессов разделения многокомпонентных гетерофазных системКлинов Александр Вячеславович

               

               Моделирование турбулентного закрученного течения и процессов разделения тонкодисперсных порошков в пневматических центробежных аппаратахЧепель Антон Геннадьевич