Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы (Краткий исторический очерк изучения генетико-биохимического полиморфизма у человека) 8
2. Материалы и методы 37
3. Собственные исследования и обсуждение полученных данных 63
3.1. Идентификация биохимических маркеров генов и их-геногеографическая характеристика 63
3.1.1. Генетический полиморфизм белков сыворотки крови и геногеография систем Ир, Tf , Gc 64
3.1.2. Генетический полиморфизм эритроцитарных ферментов и геногеография систем АсР и PGM J 105
3.1.3. Идентификация генных маркеров других биохимических систем 122
3.1.4. Новый алектрофоретическнй полиморфизм у человека (гетерогенность белков ушной серы) 142
3.2. Генетическая структура коренного населения Се
верной Азии и сопредельных территорий в связи с
историей формирования этно-расовых единиц 150
3.2.1. Степень генного разнообразия на различных уровнях иерархической структуры 152
3.2.2. Таксономический анализ групп, взаимоположение их в пространстве факторов АВО.щ , Нр, ACP,PGM.J И выделение генетико-антропологических типов 159
3.2.3. Оценки времени дифференциации генетико-антропологических типов Северной Азии и сопредельных территорий 203
3.3. Эволюционная адаптация человека на биохимическом уровне 232
3.3.1. Природные факторы среды и генетико-биохиш-ческая изменчивость 232
3.3.2. Адаптивная: значимость полиморфизма ферментных и других белков крови (AcP.Gc , Pp,PGM-pTf ) 239
3.4. Редкие варианты ферментных и других белков кро ви в оценке скорости мутационного процесса в популяциях Северной Азии 284
3.4.1. Идентификация эндемичных и редких вариантов биохимических локусов 291
3.4.2. Темпы мутирования у северо-азиатских монголоидов 305
4. Выводы. 311
Список литературы
- Генетический полиморфизм белков сыворотки крови и геногеография систем Ир, Tf , Gc
- Идентификация генных маркеров других биохимических систем
- Таксономический анализ групп, взаимоположение их в пространстве факторов АВО.щ , Нр, ACP,PGM.J И выделение генетико-антропологических типов
- Редкие варианты ферментных и других белков кро ви в оценке скорости мутационного процесса в популяциях Северной Азии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Взаимодействие Человека и Биосферы является всеобъемлющей задачей, стоящей перед современной наукой, для решения которой необходимо проводить исследования в самых различных областях знаний.
Антропология, изучающая изменчивость человека в пространстве и времени, с применением новейших достижений биохимии,иммунологии, генетики может внести свой вклад в разработку частных аспектов этой глобальной проблемы, связанных с адаптацией к разнообразным условиям окружающей среды, вопросами формирования антропологических типов, установления генетических связей между ними и т.д. Так, успехи в области молекулярной биологии создали предпосылки для развития физиолого-биохимическо-го направления в систематике, что позволяет изучать структуру популяций человека по параметрам с известным характером наследования. Применяемые же в классической физической антропологии признаки, имеют полигенную природу наследования, в значительной степени варьируют в онтогенезе и поэтому не всегда пригодны для анализа происхождения антропологических типов и истории формирования различных групп населения.
Исследование, которому посвящена диссертация, входит в общую тему "Проблема генетически обусловленного полиморфизма у человека" (й Госрегистрации 72014344). Актуальность данного направления определяется необходимостью получения новой информации о генетической структуре популяций Советского Союза, а также научно-практической значимостью генегико-биохимического полиморфизма для различных областей биологии и медицины.
В соответствии с постановлением ЦК КПСС и Совета Министров СССР "О мерах по дальнейшему экономическому и социальному разви тию районов проживания народностей Севера" (газета Правда от 26 февраля 1980 г.),такие научные работы являются особенно перспективными в северных и восточных районах страны в связи с проводивший здесь интенсивными социально-экономическими преобразованиями. Происходящая коренная реорганизация исторически сложившейся популяционной структуры Северной Азии требует скорейшего решения вопросов,связанных с этнической историей этого обширного региона,что в свою очередь сопряжено с привлечением материалов популяционной генетики и необходимостью интенсификации скрининга маркерных систем среди коренного населения.
Освоение природных ресурсов Сибири и Дальнего Востока неразрывно связано с проблемой заселения громадных пространств этой части страны.В данном случае необходимо учитывать как индивидуальные биологические свойства,так и особенности генетической структуры отдельных человеческих коллективов.Продолжительность пребывания и жизни мигрантов на Крайнем Севере в определенной степени зависит от специфических особенностей метаболизма у разных людей.Следовательно,популяционно-генетические и биохимические исследования могут внести свой вклад в разработку научно-обоснованного подхода в государственном масштабе к планированию народонаселения и профориентации в экстремальных условиях среды.
К настоящему времени влияние хозяйственной деятельности на биосферу, как и на самого человека становится принципиально новым и столь интенсивным, что возникла необходимость установления адаптивных возможностей его в условиях резко меняющейся среды.В этой связи особое значение приобретает вопрос,в какой мере загрязнение различными химическими и физическими факторами,многие из которых могут быть мутагенными, приводит к изменению одного из важнейших параметров генетической динамики - скорости мутаци онного процесса. Все это делает настоящую работу по изучению ге-нетико-биохишческой гетерогенности у человека весьма своевременной и актуальной.
Цель и задачи исследования. Основная цель исследования заключалась в установлении эффективности применения анализа гене-тико-биохимического полиморфизма для решения целого ряда антропологических проблем.В работе были поставлены следующие задачи:
1) Разработать и применить доступные для массового скрининга эффективные методы исследования генетически обусловленного полиморфизма.
2) Осуществить поиск новых типов электрофоретической изменчивости белков у человека.
3) Определить геногеографаческую картину, характеризующую распределение биохимических маркерных систем в этно-территори-альных группах Советского Союза.
4) Проанализировать полученные данные о генетико-биохими-ческом многообразии в свете решения некоторых вопросов этнической истории и расогенеза.
5) В связи с проблемой биохимической адаптации человека выявить возможную зависимость мирового распределения фенотипи-ческих и генных частот протеиновых локусов от комплекса клима-то-географических показателей.
6) Оценить скорость мутационного процесса среди коренного населения Северной Азии на основании данных о частотах редких и эндемичных вариантов ферментных и других белков крови.
Натчная новизна. Впервые проведены широкомасштабные исследования биохимического полиморфизма по значительному спектру систем ферментных и других белков крови в различных этно-терри-ториальных группах Советского Союза. По результатам их были со ставлены гено-географические карты.
Работа позволила получить новую научную информацию по формированию этно-расовых групп Северной Азии и сопредельных территорий в пространстве и времени.
В связи с разработкой проблемы эволюционной адаптации че-ловека.на основании собственных результатов также с привлечением общемировых данных, рассмотрена адаптивная значимость ге-нетико-биохимической изменчивости. В результате установлены факты, свидетельствующие о существовании зависимости глобального распределения фенотипических и генных частот ряда ферментных и других белков крови от климато-географических параметров.
Впервые по данным анализа встречаемости редких и эндемичных вариантов маркерных систем биохимических локусов определена скорость мутационного процесса в популяциях человека восточных районов нашей страны. Б исследовании представлены также экспериментальные доказательства существования новых полиморфизмов белков ушной серы,кожи и волосяных луковиц у человека.
Практическая ценность. В работе убедительно показана приложимость анализа генетико-биохимического полиморфизма к решению основных проблем этнической антропологии.
Приведенные данные об адаптивной значимости генетико-биохимического полиморфизма позволяют предложить научно-обоснованный подход к решению вопросов планирования народонаселения и профориентации в экстремальных условиях Крайнего Севера.
Установленные оценки скорости мутационного процесса среда коренных групп населения Северной Азии имеют практическое значение для разработки проблемы жизнедеятельности человека в современных условиях загрязнения биосферы, поскольку они дают представление о естественном мутационном фоне как эталоне в рай онах с минимальным влиянием хозяйственной деятельности на природную среду.
Экспериментальная работа по выявлению новых типов полиморфизма не только расширяет знания в области биохимической изменчивости, но и находит выход в практику медицинской генетики,а также судебной медицины для идентификации биологического материала.
Предложены усовершенствованные лабораторные методы, рассчитанные для массового скрининга популяционного материала. Результаты определения изоферментов некоторых маркерных систем в образцах цельной крови, а также в пятнах различных сроков давности позволяют изучать материал, сохранявшийся длительное время в неблагоприятных условиях, что открывает дополнительные возможности для судебно-медицинской практики.
Материалы рассматриваемой работы были представлены на IX Международном конгрессе антропологических и этнографических наук (Чикаго, 1973 г.).
Основные положения диссертации доложены на совместном заседании Ученых советов Института этнографии АН СССР и НИИ антропологии МГУ .посвященном памяти Г.Ф.Дебеца и Б.В.Гинзбурга (Москва, 1979 г.),на Всесоюзной сессии по итогам полевых антропологических и этнографических исследований за 1978-1979 гг.(Уфа, 1980), на 17 Съезде всесоюзного общества генетиков и селекционеров им.Н.И.Вавилова (Кишинев, 1982), Научной сессии Института этнографии АН СССР,посвященной 90-летию со дня рождения В.В.Бу-нака (Москва,1982), заседании Московского общества испытателей природы (Москва, 1982), на Юбилейной конференции НИИ антропологии МГУ (Москва, 1983).
Ащюбяпия состоялась на научно-методическом совещании НИИ и Музея антропологии МГУ 24 октября 1983 г.
Структура и ооъем ди-р,р.рртяттті. диссертация представлена в одном томе и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и примененных методов, изложения собственных исследований 4 главы) и выводов.
Основной текст работы изложен на 224 страницах машинописи и дополнен 52 таблицами и 62 рисунками.
Библиографический указатель включает 279 наименований, из них 86 работ отечественных и 193 - иностранных авторов. Всего в рукописи диссертации 344 страницы.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 42 научные работы.
Генетический полиморфизм белков сыворотки крови и геногеография систем Ир, Tf , Gc
. Для определения антигенных детерминант Gm в образцах сыворотки крови используется техника подавления агглютинации на плоскости (Steinberg, 1962; Lawier, I960). Эритроциты 0, Rh + , сенсибилизированные сывороткой анти-D .содержащей неполные антитела igG о определенными аллотипами Gm , добавляются к смеси исследуемой сыворотки, разбавленной в соотношении 1:4, и соответствующей стандартной сыворотки анти-Gm . В случае выраженной агглютинации, в исследуемом образце не содержится искомый аллотип Gm . Напротив, отсутствие агглютинации свидетельствует о наличии в сыворотке антигена Gm .Все аллотипы данной системы определяются сходным образом.но при этом используются соответствующие антисыворотки для сенсибилизации.В данной работе исследуемые образцы сывороток тестировались на наличие аллотипов Gim (I), Gim(2), Gim (3) и G3m (10).Статистическая оценка частот гаплотипов проводилась при использовании метода максимального правдоподобия.
Математические методы анализа материала представлены в последующих разделах работы.
Прежде чем приступить к анализу причин, приведших к гетеро гённости наблюдаемых распределений стенотипических и генных частот в популяциях различных народов СССР, необходимо определить их генетическую структуру, сформировавшуюся в результате длительного процесса эволюционного развития.
Результаты лабораторных исследований биологического материала приведены в серии последующих таблиц и иллюстрированы ге-ногеографическими картами. Картографирование частот генетических факторов осуществлялось построением изолиний с учетом этнографической подразделенности групп.
Для выявления особенностей географической изменчивости, а также направленности распределения факторов генетических систем, применялись шкалы с неравномерным интервалом частот. Гено-географические карты позволили определить различные массивы концентраций, а также градиенты изменения того или иного фактора. Нринимая во внимание обширную территорию страны, где проводились выборочные исследования, не исключается возможность определенной экстраполяции полученных результатов на омежные области, до сих пор мало изученные популяционно-генетически.
Генетический полимотхЕизм белков сыворотки КРОВИ и геногеограйия систем Hp. f . Go . pp. Eg(C ). Система гаптогло-бина (Нр). Наибольшее число охваченных скринингом этно-террито-риальных групп, равно как и объем выборок были анализированы в отношении распределения типов гаптоглобина, В таблице 6 показаны частоты фенотипов, а также генов, ответственных за продукцию соответствующих белков. Наряду с тремя общими типами HpCl, 2-І, 2), постоянно присутствующими в популяциях, наблюдаются и редкие варианты этого гемоглобин-связываэдего белка, рассмотрение которых будет предпринято в главе 3.4. (Спицын, 1967, 1974; Спипын, Мухина, 1975). Случаи, так называемой агаптоглобинемни отмечались у людей, принадлежащих ко многим этническим группам самых разнообразных географических зон. По-видимому, в репрезентативных выборках из большинства популяций можно обнаружить лиц, относящихся к типу Нр 0. Однако трудность интерпретации полученных результатов заключается в том, что, во-первых, за истинную агаптоглобинемига можно принять тип Нр 2, но с концентрацией столь незначительной, что его нельзя обнаружить обычными методами. Во-вторых, у некоторых лиц отсутствие гаптоглобина - явление временное, вызванное патологией с различной этиологией.
Как видно из данных, полученных при статистическом анализе, наблюдаемые частоты фенотипов Нр почти повсеместно соответствуют теоретически ожидаемым, вычисленным на основании закона Харди-Вайнберга.
Учитывая интерес, проявляемый большим кругом исследователей к изучению генетически обусловленного биохимического полиморфизма, в частности, изменчивости типов гаптоглобина в популяциях северо-востока нашей страны, мы в большей мере акцентируем внимание на распределении вариантов этой системы в Северной Азии (Табл.6; рис.10). Для северо-азиатских популяций, в целом, присуща относительно низкая концентрация фенотипа Нр I, подобно тому, как это имеет место у большинства азиатских монголоидов. Средне сибирская частота гена Нр составляет 0,3;близ-кая к ней концентрация свойственна тунгусоязычному населению. При всей неоднородности распределения факторов гаптоглобина на востоке страны, все же имеется общая тенденция в сторону уменьшения частоты Нр с севера на юг и с запада на восток.
Идентификация генных маркеров других биохимических систем
Анализируя характер распространения редких вариантов фос-фоглюкомутазы локуса PGMj в изученных нами группах, следует заметить, что фактор PGMj обнаружен у саамов Кольского п-ва и то-фаларов с незначительной концентрацией 0,0096 и 0,0069 (соот-ветственно). Достаточно высокая частота гена PGMj, достигающая полиморфной величины (0,0363) наблюдается у ненцев Гыданского п-ва.
Одновременная идентификация изоферментов локуса PGM2 на электрофореграммах при гистохимическом выявлении фосфоглгакому-тазы приводит к предварительному выводу о его мономорфа зме в изучаемых нами популяциях. Во всех случаях наблюдался гомозиготный фенотип PGMoI» контролируемый аллелем PGMo.
Рассмотренные выше генетические системы белков крови изучены достаточно широко, чтобы представить хотя бы в первом при ближений картину геногеографической изменчивости определяющих их маркерных генов на значительной части территории страны преимущественно среди коренного населения Северной Азии.
Несмотря на разнонаправленный характер географической изменчивости факторов нескольких изученных независимых систем, а также на значительную межпопуляционную вариабельность частот фенотипов и генов, достаточно хорошо вырисовывается общая закономерность, которая выражается в существовании определенного генетического сходства двух отдельных периферических относительно друг друга областей Северной Азии - западной и восточной. Между этими выделенными массивами вклинивается совокупность этно-тер-риториальных групп, которой присущи иные генетические характеристики, и которая занимает регион, охватывающий междуречье рек Енисея и Лены, включая бассейн последней. Данная тенденция прослеживается при одновременном рассмотрении пространственного распространения систем Нр, Gc, АсР, Рр ж С ).
Картографирование генетических маркеров позволяет прийти к предварительному выводу о том, что некогда единый древнейший антропологический субстрат, распространенный от Урала до Тихоокеанского побережья, был расчленен позднее пополам восточнее Средней Сибири одной или рядом миграционных волн, следовавших из Центральной Азии и связанных, по-видимому, с перемещением тунгусо-, тюрко- и монголоязычных племен. Подобная картина прошлой генетической истории запечатлена в статической форме в генетической структуре популяций современных северо-азиатских монголоидов.
Анализ распределения других генетических маркеров исследованных нами менее широко по сравнению с системами,рассмотренными выше, цредставлен в последующих таблицах и комментариях к ним.
Приступая к изложению данных о распределении вариантов системы Gm, следует заметить,что иммунные антисыворотки для определения антигенных детерминант Gm, остаются весьма дефицитным продуктом. Поэтому большая часть выборок исследовалась исключительно с помощью анти -Gm (I) сыворотки ( spitayn,I973). Анализируя популяции на территории Европейской части ССОР и Сибири в отношении пропорции встречаемости антигенной детерминанты Gm(I) (табл. 21), легко заметить, что саамы Кольского п-ва и коми Приуральского р-на Ямало-Ненецкого национального округа занимают промежуточное положение между монголоидными и европейскими группами.
Таксономический анализ групп, взаимоположение их в пространстве факторов АВО.щ , Нр, ACP,PGM.J И выделение генетико-антропологических типов
Схема иерархической классификации представлена в табл.35. В составлении ее руководствовались работами Дебеца (1951), Чебоксарова (1951), Бунака (1980). Вне зависимости от уровней иерархической дифференциации населения Северной Азии, мы сочли целесообразным ввести для сравнения локальную группу мексиканских индейцев, поскольку подавляющее большинство индейских популяций Центральной Америки оказывается гомогенным по распределению генетических маркеров крови.Весьма сходными в этом отношении оказываются и атапаски Северо-Западной Америки,для характеристики которых используются усредненные значения генных частот двух популяций,по которым имеются необходимые нам данные.Оправданность включения индейцев Мексики в качестве сравнительной группы на Американском континенте обусловлена тем,что занимаемая ими территория хорошо изучена в палеоант-ропологическом отношении.
Генетические расстояния рассчитывались тремя различными методами: Нея( 1)( 1972) ,Кнуссмана(3)( 1962) и Малютова-Пасекова (4) (1972).
В формуле Нея генетические расстояния (D) для двух популяций X и У вычисляют следующим образом: D=-fc(JXy/\/Jx Jy) (І), ГДЄ Ix, I и I суть нормализированные вероятности ( jx, 3 t jxy ) идентичности двух случайно выбранных генов в популяциях X и У соответственно С J„, j__ MJ - среднеарифметические ;),., л и З У ) Jx=2 i ; ЗуУі: Jxy-Ixtfi (2) где і и у± - частоты аллелей в популяциях X и У. Формула Кнуссмана характеризует генетические расстояния(Х) как стандартное квадратическое отклонение и по возможности описания генетических расстояний приближается к формуле (I): где m - число локусов, tj_ - число аллелей в і -том локусе, : и уі - частоты аллелей в популяциях X и У.
Генетические расстояния, рассчитанные в соответствии с методом Нея, определяют меру генетического сходства относительно степени полиморфизма локуса для двух рассматриваемых популяций, в отличие от других методов, не принимающих в расчет величину полиморфности. Поэтому, несмотря на качественную близость приведенных алгоритмов, результаты расчета дистанций могут быть различными.
По мнению Нея, формула (I) несет выраженный биологический смысл, поскольку с ее помощью измеряются общие кодоновые различия на локус между популяциями. Качественно близкие результаты можно ожидать только для значительно дифференцированных популяций. Следовательно, с увеличением таксономического уровня следует ожидать улучшения совпадения результатов, вычисленных по трем формулам.
Существует множество различных подходов для оценки генетических расстояний, и в большинстве своем предлагаемые формулы позволяют получить результаты, имеющие высокую коррелируемость.
Применяемая нами формула Малютова-Пасекова (4), вытекающая из математической модели процесса случайного генного дрейфа(ос-нованная на процессах диффузии) позволяет вычислить угловые генетические расстояния:
Среднее значение R L С ) пропорционально времени независимой генетической дивергенции популяций t , что весьма важно для биологической интерпретации. Кроме того, распределение R2 имеет статистический смысл и инвариантно относительно начала процесса дивергенции популяций, основным фактором которого при общности происхождения является случайный генный дрейф. Кластеризация. Для разбиения множества популяций, построения кластеров и оценки формы древа на основании рассчитанных генетических расстояний использовалась иерархическая агломеративнш процедура, состоящая в последовательном объединении в класс сначала самых близких по генетическим расстояниям, а затем вое более отдаленных друг от друга элементов, т.е. применялся парно-групповой взвешенный метод (Lance, Williams, 1966; Sneath, Sokal, 1973 ).
Объекты p и q с наименьшим расстоянием Dp объединяются в кластер Р , а расстояние DFS от кластера т до любого другого объекта з определяется по формуле: Dpq =сС D + D (5) РЬ Р ps q qs Был выбран алгоритм кластеризации, где Дяя оценки близости сравниваемых популяций можно применять и другие способы построения кластеров.
Расчет генетических расстояний и кластерный анализ проведены на ЭВМ М - 220 М. Программы составлены на языке АЛГОЛ - 60. Использовалась модифицированная версия транслятора ТА
Редкие варианты ферментных и других белков кро ви в оценке скорости мутационного процесса в популяциях Северной Азии
Результаты анализа свидетельствуют о том, что в процессе всей эволюционной истории человека, его генетическая структура претерпевала изменения под воздействием совокупности факторов среды.
Однако к настоящему времени влияние хозяйственной деятельности на окружающую среду и на самого человека становится принципиально новым и столь интенсивным, что встает неотложная проблема изучения его адаптивных возможностей в условиях резко изменяющейся биосферы. В этой связи приобретает актуальное значение вопрос, в какой мере происходящее загрязнение различными химическими и физическими факторами, многие из которых могут быть мутагенными, влияет на скорость мутационного процесса в популяциях человека. Успехи здравоохранения создали предпосылки к ослаблению интенсивности отбора в них, следовательно, даже при неизменной скорости мутационного давления неизбежен рост отягощенности мутационным грузом. Это может выразиться в повышении частоты наследственных аномалий, предрасположенности к ряду заболеваний, а также отрицательно сказаться на жизнеспособности и воспроизводительной функции индивидов (Дубинин, Алтухов, 1977). При этом сами элементарные популяции неизбежно становятся "индикаторами" изменения состояния окружающей среды. Возможное увеличение скорости мутационного процесса у человека по генам может быть установлено при оценке соответствующего сдвига, улавливаемого относительно некоего "нулевого" уровня отсчета, принимаемого за точку равновесия (Дубинин, Алтухов, 1977). В этом контексте данными исследователями высказано мнение о целесообразности привлечения исходных данных по этническим группам, в значительной мере сохранившим основные черты древней генетической организации. Однако, предварительные расчеты скорости мутационного процесса, основанные на анализе частот электрофорети-ческих вариантов белков, показали, что у южно-американских индейцев эта величина на один-два порядка выше, нежели в европейских популяциях (Heel, 1973, 1974). Возникает вопрос, вызваны ли эти расхождения в скоростях естественными особенностями изучаемого процесса в разных этно-расовых группах, неучтенным фактором внутрицистронннх рекомбинаций, либо объясняются другими причинами. 3 любом случае, для оценки степени генетической изменчивости при воздействии мутагенных факторов (радиоактивное излучение, большой спектр химических реагентов и т.п.) в первую очередь необходимо знать естественный фон и особенности мутационного процесса в "нативных" этнических коллективах, живущих в таких условиях среды, где влияние хозяйственной деятельности на нее пока еще минимально.
Существующие противоречия во взглядах и недостаток данных относительно оценок скорости мутационного процесса в аборигенных популяциях обусловили необходимость его изучения среди коренного населения Северной Азии, тем более что имеющиеся сведения по определению этого фактора относятся к различным этно-ра-совым группам, преимущественно локализованным в сходных средо-вых условиях - тропической и экваториальной зон.
Общие принципы оценок скорости мутационного процесса в популяциях на основании использования данных о частотах тзедких вариантов белков. Скорость мутации генов (уч) является одним из наиболее существенных параметров, попытки определения которого предпринимались еще до наступления эры молекулярной генетики (Морган, 1936). Методы выявления скорости мутационных изменений в то время базировались преимущественно на определении крайних стенотипических проявлений, таких как гибель развивающихся эмбрионов и очевидных отклонений от нормы в формировании организма. Но только благодаря последним достижениям молекулярной биологии, биохимии, а также совершенствованию методов электрофоретического определения нзоаллелъных вариантов белков, был достигнут определенный прогресс в получении косвенных оценок скоростей мутационного процесса.
Метод Кимуоы и Рты. Кимура и Ота предложили для расчета скорости мутационного темпа использовать отношение между ожидаемым числом сегрегирующих КСДОНОБ в равновесной популяции и средним временем элиминации (потери) мутантного аллеля (кодона) (Kimura, Ohta, 1969).
