Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, онкологические заболевания по частоте заболеваемости занимают второе, а в некоторых промышленно развитых странах – первое место; от них ежегодно умирает около 7 млн человек (Попович А.М., 2002). В структуре онкологической заболеваемости женщин почти во всех развитых странах первое место занимает рак молочной железы (Greenlee R. et al., 2000; Jemal A. et al., 2004 – 2010). По сравнению с другими злокачественными новообразованиями рак молочной железы является одной из наиболее частых причин смерти женщин (Аксель Е.М., 2005).
Основными методами лечения в онкологии являются: хирургический, цитотоксическая химиотерапия и лучевая терапия. В настоящее время применение интенсивной или высокодозной химиотерапии при лечении пациентов с солидными опухолями не всегда позволяет добиться эффективных результатов (Davidson A. et al., 1997). С целью преодоления химиорезистентности и повышения эффективности терапии этой категории больных продолжается интенсивный поиск новых лечебных подходов. Одним из возможных направлений в этом плане является общая гипертермия (ОГ) (Жаврид Э.А. и др., 1997; Исмаил-Заде Р.С., 2004; Van der Zee J., 2002; Oldahm R.K., 2003), применение которой основано на том, что опухолевые клетки избирательно термочувствительны (при повышении температуры тела до 42 – 45С).
В современных клинических и экспериментальных исследованиях при оценке эффективности противоопухолевой терапии и разработке новых методов терапии злокачественных новообразований основное внимание уделяется влиянию химических агентов и физических факторов на стимуляцию гибели опухолевых клеток, подавление их пролиферации, метастатической активности и неоангиогенеза (Летягин В.П., 2004; Кушлинский Н.Е. и др., 2005). Такие подходы обусловлены тем, что одним из механизмов развития опухолевого роста является нарушение равновесия между процессами пролиферации и гибели клеток (Белушкина Н.Н., 2008). Разные химические и физические воздействия вызывают разную интенсивность изменений перечисленных выше биологических свойств опухолей. Поэтому для выбора наиболее эффективного режима противоопухолевой терапии часто используют комбинированные воздействия, проводится поиск новых вариантов сочетания известных и неизвестных агентов с антибластомной активностью.
Сочетание гипертермии с лучевой терапией оказывается эффективней, чем каждый из этих видов физического воздействия отдельно. При тепловом воздействии опухолевая ткань перенасыщается собственными продуктами обмена, кислотами, и в ней нарушаются важные системы регуляции. Вследствие этого опухолевая клетка становится более чувствительной к лучевой или химиотерапии, так что их дозировки могут быть значительно снижены. Возможность уменьшения дозы вводимых цитостатиков до 50% с одновременным усилением противоопухолевого эффекта позволяет в ряде случаев избегать выраженного нефротоксического, кардиотоксического, гепатотоксического действия химиопрепаратов. Влияние гипертермии на трансмембранный перенос и метаболизм может привести к преодолению лекарственной устойчивости и повышению иммуногенности опухоли (Курнешов О.К. и др., 2003). Не являясь канцерогенным и мутагенным агентом, гипертермия может индуцировать в опухоли как апоптоз, так и некроз клеток (Yonezawa M. et al., 1996).
В последние десятилетия значительным достижением в области поиска новых эффективных методов терапии злокачественных новообразований стало создание концепции противоопухолевой терапии, основанной на подавлении ангиогенеза (Rafii S., 2000). Известно, что в опухоли образуется сосудистая сеть, которая значительно отличается от сосудов здоровой ткани (Dvorak H.F. et al., 1995; Bergers G. еt al., 2003). Сосудистое русло опухоли, с морфологической точки зрения, является атипичным и составляет значительную часть опухолевой стромы. Показано, что если опухоль имеет периферическую сосудистую сеть, то в центре опухоли имеются участки некроза. Если опухоль имеет центральную сосудистую сеть, то некроз располагается по периферии. Микроскопически сосуды выглядят расширенными, извитыми, со множеством слепых петель. Все эти структурные различия влияют на внутриопухолевый кровоток, кровь проходит через опухоль непредсказуемым образом, а это оказывает отрицательное влияние на доставку лекарственных препаратов.
Для разработки новых схем противоопухолевой терапии и создания новых лекарственных препаратов на первом этапе всегда используются модельные опухолевые системы in vitro (линии опухолевых клеток) и in vivo (перевиваемые и спонтанные опухоли разной локализации). Одной из модельных опухолей, используемых на крысах, является перевиваемая опухоль Walker 256, идентифицированная впервые профессором G.Walker в 1928 году как спонтанно возникшая в молочной железе беременной крысы альбиноса (Rattus norvegicus) (Simpkins H. et al., 1991). После нескольких пересадок на протяжении многих лет были выделены несколько ее субштаммов, которые характеризуются морфологическими различиями и классифицируются как карцинома, саркома и смешанная карциносаркома (Simpkins H. et al., 1991). Возможно, карциносаркома Walker 256 возникла как смешанная опухоль и состояла из стволовых клеток, которые дают начало разным типам клеток. Использование этой опухоли в доклинических исследованиях новых методов противоопухолевой терапии позволяет оценить действие как отдельных химических и физических факторов, так и их сочетаний на разные биологические характеристики опухолевого роста.
В этой связи представляется актуальным изучение интенсивности пролиферации и гибели опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 при действии общей гипертермии в сочетании с цитостатическими препаратами (циклофосфаном и мелатонином), обладающими разными механизмами действия на клеточные популяции.
Цель исследования – изучить патоморфогенез и основные параметры опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при ее трансплантации в мышцу бедра крыс Вистар и при проведении противоопухолевой терапии с использованием общей гипертермии, циклофосфана, мелатонина и их сочетаний.
Задачи исследования:
-
Изучить морфогенез и основные параметры опухолевого роста (митотический индекс, выраженность некротической и апоптотической гибели, частоту метастазирования, степень дифференцировки) карциносаркомы Walker 256 после трансплантации опухолевых клеток в мышцу бедра крыс Вистар.
-
Изучить особенности гистоархитектоники опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста при модифицирующем воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.
-
Изучить ультраструктурные особенности основных типов опухолевых клеток и эндотелиоцитов карциносаркомы Walker 256 при ее спонтанном развитии и при модифицирующем воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина, применяемых изолированно или в сочетаниях друг с другом.
-
Провести иммуногистохимическое изучение уровней экспрессии антиапоптотического и проапоптотических белков семейства Bcl-2 в карциносаркоме Walker 256 крыс в процессе спонтанного развития и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.
-
Изучить динамику изменений содержания токоферола и ретинола в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.
-
Изучить уровень антиоксидантной и проаксидантной активности сыворотки крови у крыс с трансплантированной карциносаркомой Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.
-
Изучить динамику изменения уровня малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в сыворотке крови крыс после трансплантации карциносаркомы Walker 256 и после воздействия общей гипертермии, мелатонина, циклофосфана и их сочетаний.
Научная новизна. Впервые проведен комплексный патоморфологический анализ опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при спонтанном развитии после трансплантации в мышцу бедра крыс и после модифицирующих воздействий общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Показано, что морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплениями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиогенеза. Впервые на основании электронно-микроскопического исследования установлено, что в карциносаркоме Walker 256 в ходе ее прогрессивного развития присутствуют опухолевые клетки 2 типов. Популяция опухолевых клеток каждого типа представлена пятью клеточными формами, отражающими последовательные стадии клеточной дифференцировки, представлены их ультраструктурные характеристики.
Впервые выявлены патоморфологические особенности модифицирующего влияния общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина на гистоархитектонику карциносаркомы Walker 256 и основные параметры опухолевого роста. Установлено, что данные виды воздействий, примененные изолированно или в сочетании друг с другом, оказывают разные по выраженности эффекты на процессы пролиферации, гибели и дифференцировки опухолевых клеток, а также их метастатическую активность. Впервые показано, что применение циклофосфана в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией и мелатонином вызывает значительную транзиторную редукцию эпителиоидных клеток и изменение архитектоники опухолевого узла через 7 сут после воздействий с реверсией опухолевого фенотипа в последующем, но при значительном уменьшении объема опухолевого узла. При включении циклофосфана в схемы противоопухолевой терапии происходит значительное снижение частоты метастазов в регионарные лимфатические узлы; сочетанное использование циклофосфана с мелатонином и общей гипертермией полностью подавляет метастазирование.
Впервые установлено, что применение мелатонина в качестве моноагента или в сочетании с общей гипертермией усиливает структурированность опухолевого узла карциносаркомы Walker 256 с формированием обособленных псевдофолликулярных структур, разделенных соединительнотканными септами. В опухолевом узле преобладают клетки 2-го типа на 4-й и 5-й стадиях дифференцировки. Включение мелатонина в схемы противоопухолевой терапии приводит к снижению митотического индекса и усилению апоптоза опухолевых клеток, наиболее значительно в сочетании с циклофосфаном. Мелатонин в меньшей степени, чем циклофосфан, снижает метастатический потенциал карциносаркомы Walker 256.
Впервые показано, что общая гипертермия вызывает ускоренное развитие карциносаркомы Walker 256, проявляющееся в усилении инвазии в пограничные скелетные мышцы и увеличении объема опухолевого узла в 9,8 раза через 5 сут после трансплантации опухолевых клеток, обусловливает максимальную частоту (100%) метастазов в регионарные лимфатические узлы. Гистоархитектоника опухолевого узла после общей гипертермии существенно не изменяется, но происходит его разрыхление из-за выраженного отека и некротического распада. Сочетанное применение общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина вызывает значительное уменьшение объема опухолевого узла (в 18 раз), но способствует его фрагментации с образованием нескольких центров опухолевого роста.
Впервые определена экспрессия проапоптогенных и антиапоптогенного белка семейства Bcl-2 в динамике развития карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Показано, что изолированное или сочетанное применение данных воздействий приводит к снижению экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и усилению экспрессии проапоптотических белков Bax и Bad. Установлена отрицательная корреляционная связь между отношениями Bcl-2/Bax и Bcl-2/Bad, с одной стороны, и апоптотическим индексом, с другой, что позволяет считать изменение соотношений этих белков в клетках карциносаркомы Walker 256 одним из механизмов индукции апоптоза.
Впервые изучены показатели реакции перекисного окисления липидов, прооксидантной (ПОА) и антиоксидантной (АОА) активности сыворотки крови при спонтанном развитии карциносаркомы Walker 256 и при воздействии общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина. Установлено, что спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о смещении баланса в системе «про-/антиоксиданты» в сторону прооксидантов и развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Walker 256 как в сторону их понижения, так и повышения.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые знания о патоморфогенезе и основных параметрах опухолевого роста перевиваемой карциносаркомы Walker 256 при ее спонтанном росте и после изолированного и сочетанного воздействия общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина как физических и химических агентов с разными механизмами противоопухолевого действия. Выявленные особенности противоопухолевого эффекта общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина и их сочетаний имеют большое значение для разработки более эффективных схем терапии онкологических заболеваний.
Проведенное исследование показывает важность комплексного морфологического анализа спонтанного и модифицированного опухолевого роста в динамике для установления возможных мишеней противоопухолевой терапии и оценки ее эффективности.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Морфогенетический потенциал опухолевых клеток карциносаркомы Walker 256 проявляется в формировании псевдофолликулярных структур или пластов из эпителиоидных клеток с тяжами или скоплениями саркоматозных клеток между ними и в индукции неоангиогенеза. Опухолевые клетки характеризуются высоким митотическим индексом, низким апоптотическим индексом, высокой частотой метастазирования по гематогенному и лимфогенному типам в регионарные лимфатические узлы, способностью индуцировать неопластическую кахексию.
-
Общая гипертермия, циклофосфан и мелатонин, применяемые изолированно, вызывают разные по направленности изменения гистоархитектоники трансплантированной карциносаркомы Walker 256. При сочетанном применении каждого цитостатика с общей гипертермией характер изменений гистоархитектоники определяется цитотоксическими свойствами каждого из них. При сочетанном применении общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина изменения архитектоники опухолевого узла определяются цитотоксическими свойствами циклофосфана, а выраженность изменений – количеством сочетаний противоопухолевых воздействий.
-
Спонтанное развитие карциносаркомы Walker 256 сопровождается достоверным увеличением отношения ПОА/АОА сыворотки крови крыс, свидетельствующим о развитии окислительного стресса в организме животных. Общая гипертермия, а также ее сочетания с циклофосфаном и мелатонином приводят к разнонаправленным изменениям содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови как в сторону их понижения, так и повышения.
-
Анализ основных параметров опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 (митотического индекса, интенсивности некроза и апоптоза, степени дифференцировки, метастатического потенциала) и системных проявлений неопластического процесса (неопластической кахексии, выраженности оксидативного стресса) после изолированного и сочетанного применения общей гипертермии, циклофосфана и мелатонина свидетельствует о том, что наибольшая эффективность терапии достигается при сочетанном применении физических и химических агентов с разными механизмами действия.
Апробация результатов исследования. Основные положения работы доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008); I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2009); XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2010); X Конгрессе Международной ассоциации морфологов «Функциональная морфология человека и животных» (Ярославль, 2010); IX Российско-Германской научно-практической конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Новые горизонты: инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» (Новосибирск, 2010), межлабораторной конференции в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 работ, из них 15 – в ведущих рецензируемых научных журналах, включенных в Перечень ВАК РФ для публикации результатов докторских диссертаций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 295 страницах текста, иллюстрирована 76 таблицами и 180 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, включающих материал и методы, результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (445 источников, из которых 165 отечественных и 280 иностранных авторов).
Весь материал диссертации получен, собран, обработан и проанализирован лично автором.
