Введение к работе
Актуальность темы. Разработка чувствительных и селективных способов шределения постоянно расширяющегося круга физиологически активных сое-;инений - одна из актуальных задач современной аналитической химии. Эта за-.ача приобретает особое значение в настоящее время в связи с проблемами эко-:огии. Один из путей решения этой сложной и многогранной проблемы - разра-іотка новых электрохимических биохимических сенсоров, в частности, амперо-іетрических. Амперометрические биохимические сенсоры на основе иммобили-ованных ферментов, как современные средства измерения, позволяют получать .налитический отклик на многие экотоксиканты, которые часто выполняют роль юдуляторов ферментов. Высокая каталитическая активность биочувствительной :асти таких сенсоров - одно из главных условий их успешной работы. Поэтому ібоснование и разработка способов, позволяющих увеличить каталитическую ак-ивность иммобилизованных ферментов - один из подходов к расширению ана-[итических возможностей такого рода устройств. В роли активаторов фермента-ивных процессов весьма перспективно использование ионов металлов.
Процессы активации ферментов изучены гораздо в меньшей степени, чем шгибирование. Знание же различных аспектов этого явления может оказаться іесьма полезным для подбора рабочих условий и получения максимального ана-іитического сигнала при работе с биохимическими сенсорами.
Биохимичекие сенсоры позволяют определять многие физиологически ак-ивные соединения, в частности, пестициды, по их ингибирующему действию. Зднако, имея высокую чувствительность, широкий концентрационный диапазон, шзкий предел обнаружения, обладая экспрессностью определений, амперомет-шческие биосенсоры, в частности, на основе иммобилизованной холинэстеразы ИХЭ), не обладают достаточной селективностью, дают отклик на все присут-твующие в системе ингибиторы фермента. Обеспечение селективности опреде-іения соединений, близких по своей структуре, и особенно различных производ-fbix одного соединения, является сложной задачей для аналитика. Одним из со-іременньїх подходов к решению этой проблемы является использование высоко-:пецифичных иммунохимических реакций. Возможность сделать низкомолеку-1ярные соединения, являющиеся экотоксикантами, иммуногенными, открывает ювые перспективы селективного их определения с помощью электрохимических іиохимических сенсоров.
Работа по теме диссертации выполнялась в соответствии с мординационным планом РАН по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 1.20.4.7) и грантом Российского фонда фундаментальных исследований "Реакции іиоспецифического взаимодействия в вольтамперометрическом анализе" (номер іроекта 94-03-09265).
Цель исследования заключалась в изучении действия некоторых іодуляторов на каталитическую активность ИХЭ: активаторов - для получения
максимального аналитического сигнала, ингибиторов - для разработки селекти ных способов их определения на основе сочетания иммунохимических реакций вольтамперометрической индикацией результатов биоспецифического взаим действия.
Научная новизна и практическая значимость работы. Выяснено влияй различных факторов на процесс активации ИХЭ ионами щелочноземельных м таллов. Установлены условия получения максимального аналитического сигаа. при работе с амперометрическим холинэстеразным биосенсором. Определен количественные характеристики ферментативных реакций с участием ИХЭ присутствии ионов-активаторов.
Предложен и обоснован новый подход к селективному определению пе тицидов, основанный на сочетании реакции образования иммунного комплекі антитело-пестицид с детектированием этого взаимодействия с помощь биохимического сенсора на основе ИХЭ. Разработаны различные вариант иммунохимических определений хлорпроизводных феноксиуксусной кислот {2,4-дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д) и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислі (2,4,5-Т) с помощью амперометрического холинэстеразного биосенсора и использованием раствора антител (Ат) или иммобилизованных Ат против даннь пестицидов. Предложен способ получения иммобилизованных Ат, позволяющи сохранить их способность к биоспецифическому взаимодействию в течеш длительного времени. Найдены рабочие условия проведения определенн изучаемых пестицидов. Показана возможность использования разработаннь способов иммунохимических определений для контроля содержания 2,4-Д пищевых продуктах.
Определены константы активирования ИХЭ ионами щелочноземельна металлов и константы связывания иммунного комплекса Ат-пестицид по данны вольтамперометрических измерений.
На зашиту выносятся:
результаты изучения активирующего действия ионов щелочноземельнь: металлов (Са, Sr, Ва) на каталитическую активность ИХЭ;
совокупность факторов, определяющих величину максимального аналк тического сигнала при работе с амперометрическим холинэстеразным биосенсс ром;
кинетические параметры реакции гидролиза субстрата холинэстеразы присутствии ионов-активаторов; константы активирования ИХЭ ионами щелоч ноземельных металлов;
действие платины (II) и родия (III) на каталитическую активность бис чувствительной части сенсора;
новые варианты иммунохимических определений хлорпроизводных фе-юксиуксусной кислоты, основанные на сочетании реакции биоспецифического заимодействия и амперометрического холинэстеразного биосенсора;
способ иммобилизации Ат;
определение констант активирования ИХЭ ионами щелочноземельных іеталлов и констант связывания иммунокомплекса Ат-пестицид;
методики определения 2,4-Д в объектах эколого-аналитического конт-
іОЛЯ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладываясь и обсуждались іа Итоговой научной конференции Казанского государственного университета 1994 г), VIII Международной конференции "Евроанализ" (Эдинбург, 1993 г), :онференции "Химические сенсоры-93" (Санкт-Петербург, 1993 г), XV Черняев-ком совещании по химии, анализу и технологии платиновых металлов (Москва, 993 г), конференции "Электрохимические методы анализа" (Москва, 1994 г), конференции "Экоаналитика-94" (Краснодар, 1994 г), 5Ш Международном сим-юзиуме по кинетике в аналитической химии (Москва, 1995 г), Международном ;импозиуме по экологической химии (Кишенев, 1995 г).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ. Из них 2 татьи и 11 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях, статья принята к печати.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 124 страницах ма-цинописного текста, содержит 19 таблиц, 6 рисунков (из них 1 в приложении), 'абота состоит из введения, пяти глав, выводов, списка использованной [итсратуры, включающей 106 ссылок, и приложения.
