Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Определение молекулярно - импринтированных полимеров, методы синтеза. особенности ковалентного и нековалентного импринтинга .
1.1 Определение молекулярного импринтинга. 10
1.1.1 Аналиты в методе молекулярного импринтинга. 13
1.1.2 Матрицы в молекулярном импринтинге. 15
1.1.3 Физические формы МИП и методы их получения. 18
1.2. Примеры методов молекулярного импринтинга. 19
1.2.1 Нековалентный импринтинг. 21
1.2.2 Ковалентный импринтинг. 29
1.3 Сенсоры с молекулярно импринтированными мембранами. 38
1.3.1 Синтез, нанесение МИП на поверхность преобразователя . 39
1.3.2 Оптические сенсоры на основе МИП. 40
1.3.3. Сенсоры на основе ККР. 41
1.3.4 Электрохимические сенсоры. 42
1.3.4.1 Полевой конденсатор и емкостные сенсоры на основе МИП 44
1.3.4.1.2 Кондуктометртеские сенсоры на основе МИП. 45
1.3.4.1.3 Волыпамперометрические сенсоры на основе МИП 45
Глава II. Исходные вещества, аппаратура, методика эксперимента.
2.1 Исходные реактивы и растворы, используемые для формирования импринтированных неорганических полимерных матриц. 51
2.1.1 Синтез бензилфосфоновых кислот и их идентификация. 52
2.1.2 Характеристики бензилфосфоновых кислот. 53
2.1.3 Синтез чувствительной матрицы на основе бутоксида титана (IV). 54
2.1.4 Измерения с помощью ПТ с импринтированными мембранами на основе бутоксида титана (IV). 55
2.1.5 ИК Фурье спектроскопия на затворах ПТ с импринтированной мембраной на основе бутоксида титана (IV). 55
2.1.6 Определение толщины полимерного покрытия на основе бутоксида титана (IV) затвора ПТ . 56
2.1.7 Радиоизотопный анализ полимерной пленки на основе бутоксида титана (IV). 57
2.2 Исходные реактивы и растворы, используемые для формирования импринтированных органических полимерных матриц.
2.2.1 Синтез чувствительной мембраны на основе сополимера акриламид/ метакриловая кислота на поверхности ПТ. 57
2.2.2 Формирование чувствительного полимерного слоя на основе сополимера акриламид/метакриловая кислота на поверхности ККМ сенсора. 58
2.2.3 Создание чувствительной поверхности на основе криламид/акриламидфенилборная кислота на поверхности ККМ сенсора. 59
2.2.4 Создание чувствительной поверхности на основе акриламид/акриламидфенилборная кислота на поверхности ПТ. 59
2.2.5 Измерения на ККМ электродах с мембраной на основе акриламид/метакриловая кислота и акриламид/акриламидфенилборная кислота. 60
2.2.6 Измерения на ПТ с мембраной на основе акриламид/метакриловая кислота и акриламид/акриламидфенилборная кислота . 61
2.2.7 Эллипсометрическое определение толщины сополимера акриламид/метакриловая кислота.
2.2.8 Мониторинг энзиматических реакций с помощью ПТ с импринтированными мембранами. 62
Глава III. Использование молекулярного импринтинга для создания сенсоров на основе ИСПТ . 63
3.1 Теоретические аспекты работы ПТ с ионоселективными мембранами.
3.2 Сенсоры на основе ПТ с неорганическими полимерными мембранами.
3.2.1 ПТ с неорганическими полимерными мембранами, импринтированными 4- хлорфенокси- и 2,4 - дихлор-феноксиуксусными кислотами. 67
3.2.2 ПТ с неорганическими полимерными мембранами, импринтированными зеркальными изомерами карбоксильных кислот. 75
3.2.3 ПТ с неорганическими полимерными мембранами, импринтированными производными фосфоновой кислоты и тиолами . 84
3.3 Сенсоры с органическими полимерными мембранами. 101
3.3.1 Сенсоры на основе ПТ с органическими полимерными мембранами на основе сополимера акриламид/метакриловая кислота для определения триазинов. 101
3.3.1.1 Сенсоры на основе ПТ. 101
3.3.1.2 Сенсоры на основе кварцево - кристаллических резонаторов. 116
3.3.2 Сенсоры с полимерными мембранами на основе сополимера акриламид/акриламидфенилборная кислота. 124
3.3.2.1 Сенсоры на основе ПТ. 126
3.3.2.2 Сенсоры на основе кварцево - кристаллических резонаторов 139
3.3.2.3 Сенсоры на основе на основе поверхностно - плазменного резонанса. 142
Заключение 151
- Синтез, нанесение МИП на поверхность преобразователя
- Определение толщины полимерного покрытия на основе бутоксида титана (IV) затвора ПТ
- Измерения на ПТ с мембраной на основе акриламид/метакриловая кислота и акриламид/акриламидфенилборная кислота
- ПТ с неорганическими полимерными мембранами, импринтированными производными фосфоновой кислоты и тиолами
Введение к работе
Актуальность темы. Современное состояние развития и технологии в различных отраслях научной и промышленной деятельности характеризуется резким повышением требований к аналитическому контролю за содержанием различных веществ в природных и промышленных объектах. Для повышения конкурентноспособности выпускаемых товаров и услуг первоочередными критериями считаются качество товаров и услуг при минимальных затратах. Использование в современных сенсорах природных и синтетических рецепторов как правило обеспечивает удовлетворительные аналитические характеристики и селективность сенсоров, однако проблемой является их дороговизна, особенно биосенсоров. При использовании биологических объектов в качестве рецепторов актуальной является также проблема повышения времени функционирование сенсоров на их основе. Использование ионоселективных сенсоров с пластифицированными мембранами в ряде случаев показало высокую эффективность с точки зрения их аналитических характеристик, однако, проблема утечки электроноактивных компонентов из мембран сенсоров и, соответсвенно, относительно быстрая деградация их свойств, требует своего решения. С помощью сенсоров с пластифицированными мембранами определяется только ограниченный круг аналитов. В тоже время, использование технологии, известной как молекулярный ипринтинг, способен решить или снизить остроту озвученных выше проблем. Примеры молекулярного распознавания в природе натолкнули ученых на мысль о создании искусственных макромолекулярных рецептров, подобных биологическим системам, способных распознавать вещество (молекулу или ион) с высокой степенью селективности по отношению к структурным аналогам. На сегодняшний день наработан значительный материал по теории функционирования молекулярно импринтированных полимеров и методики их синтеза для широкого круга аналитов. В этот список входят сахара, аминокислоты, пептиды и протеины, лекарственные препараты, стероиды, ионы металлов, ароматические гидрокарбоновые соединения, красители, эфиры фосфонатов и пестициды.
В течение ряда лет молекулярно - импринтированные полимеры (МИП) применяются в качестве твердофазовых сорбентов в ВЭЖХ. Появились новые
-~-
области применения МИП, в том числе аналитические методы и сенсоры, мембраны для очистки отходов и питьевой воды, капиллярный электрофорез. В тоже время разработка сенсоров на основе МИП до сих пор представляет значительную проблему. В мировой литературе известно ограниченное количество работ, посвященных разработке и исследованию сенсоров и сенсорных систем на основе МИП. Разработка новых сенсоров на основе МИП с улучшенными характеристиками представляется актуальной.
В данной работе при создании сенсоров были использованы преобразователи на основе полевых транзисторов (ПТ), микрокристаллических резонаторов и чипы для поверхностного плазменного резонанса (ППР). В качестве распознавательного элемента в чувствительных системах выступают различные молекулярно импринтированные полимерные матрицы. Цель работы заключалась в исследовании методов синтеза, особенностей ковалентного и нековалентного импринтинга, разработке сенсоров на основе молекулярно импринтированных полимерных мембран для определения ряда химических и биологических веществ, представляющих большой практический интерес.
В связи с этим небходимо было решить следующие задачи:
Синтез импринтированных полимеров, способных взаимодействовать с темплатом в требуемых условиях с высокой аффиностью и специфичностью, исследование влияния мембранных компонентов и их оптимизация.
Выбор чувствительного преобразователя, способного откликаться к процессу связывания амалита и матрицы и трансформировать его в обрабатываемый сигнал.
Интеграция МИП с преобразователем.
Исследования аналитических и операционных характеристик разработанных сенсоров.
Научная новизна работы. Все разработанные молекулярно импринтированные неорганические и органические полимеры и сополимеры для анализа исследуемых аналитов ранее не применялись. Исследована возможность использования МИП на основе бутоксида титана (IV), сополимеров акриламид/метакриловая кислота и акриламид/акриламидфенилборная кислота
в качестве чувствительных элементов химических и биохимических сенсоров. Впервые в качестве сенсоров использованы миниатюрные преобразователи на основе ионоселективных полевых транзисторов с использованием в качестве чувствительных и селективных мембран молекулярно - импринтированные полимеры. Исследовано влияние сшивающего агента на аналитические характеристикик и время жизни сенсоров. Разработаны оригинальные методики модификации преобразователей на основе ПТ, кварцево - кристаллического микровзвешивания (ККМ), поверхностно - плазмонного резонанса (ППР), полимерами, импринтированными различными типами аналитов, а именно, полизарядными и нейтральными молекулами на примере кофакторов NAD(P)+/ NADPH, а также структурными и оптическими изомерами. Предложено использование ПТ, с нанесенной на затвор молекулярно - импринтированной полимерной мембраной, для мониторинга энзиматических процессов в режиме реального времени.
Практическая значимость работы. Полученные результаты позволили разработать новые химические и биохимические сенсоры на основе ПТ, кварцевокристаллического микровзвешивания и ППР для определения практически объектов, таких как NAD(P)V NADPH кофакторов, тиофенолов, фосфониевых кислот, различных хлорсодержащих и атразиновых гербицидов, структурных оптических изомеров на основе молекулярно - импринтированных полимерных матриц. Предложена оригинальная методика мониторинга энзиматических процессов в режиме реального времени с помощью ПТ на основе МИП.
Предложенные сенсоры и методики определения отличаются высокой чувствительнстью и хорошей воспроизводимостью результатов анализа. Аналитические характеристики разработанных сенсоров не уступают, а в ряде случаев превышают характеристики определения этих же аналитов с использованием известных сенсоров и методов. На защиту выносятся следующие положения:
1. Методики синтеза импринтированных полимеров на основе бутоксида титана (IV) и сополимеров аркиламид/метакриловая кислота и акриламид/акриламидфенилборная кислота и результаты исследования эффективности молекулярного импринтинга.
-%-
Основные положения подхода к выбору преобразователей для создания химических и биохимических сенсоров для определения различных веществ и их модификаций.
Аналитические и операционные характеристики разработанных сенсоров на основе полевых транзисторов и кварцевокристаллического микровзвешивания с мембранами на основе молекулярно - импринтированных полимеров для определения различных веществ.
Предложена методика мониторинга энзиматических процессов с помощью миниатюрных полевых транзисторов с мембранами на основе МИП.
Выводы о механизмах работы предложенных сенсоров на основе молекулярно - импринтированных полимеров и критериях, лежащих в основе их селективности на примере исследуемых систем.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы доложены на 2— международной конференции по молекулярному импринтингу (Ла Гранде Мотте, Франция), ЭМА - 2004 - VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа (г. Уфа) и на конференции "Аналитика России 20004" (г. Москва).
Основное содержание работы изложено в публикациях в виде статей и тезисов докладов.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав экспериментальной части, выводов и списка литературы (184 наименования). Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 67 рисунков.
Публикации по работе. Основное содержание диссертационной работы изложено в следующих публикациях:
Pogorelova S.P., Bourenko Т., Zayats М., Kharitonov А.В., Willner I. Selective sensing of triazine herbizides in imprinted membranes using ion-sensitive field-effect transistors and microgravimetric quartz crystal microbalance measurements. II Analyst. 2002. V. 127. № 11. p. 184-191.
Pogorelova S.P., Zayats M., Bourenko Т., Kharitonov A.B., Katz E., Lioubashevski 0., Willner I. Analysis of NAD(P)+/NAD(P)H cofactors by
-P-
imprinted polymer membranes associated with ion-sensitive field-effect transistor devices and Au-quartz crystals. //Anal. Chem. 2003. V. 75. № 3. p. 509-517.
Pogorelova S.P., Kharitonov A.B., Willner 1., Sukenik C.N., Pizem H., Bayer T. Development of ion-sensitive field-effect transistor-based sensors for benzylphosphonic acids and thiophenols using molecularly imprinted ТІО2 films.// Anal. Chim. Acta. 2004. V. 504. p. 113 - 122.
Райтман О. А., Арсланов B.B., Погорелова СП., Харитонов А.Б., Полимеры с молекулярными отпечатками для определения кофактора NADH: метод поверхностного плазменного резонанса. // ДАН Серия физико - химическая, 2003.Т.392.№4.С497-499.
Kharitonov А.В., Pogorelova S.P., Bourenko Т., Ratman О.А., Zayats M., Willner I., Use of molecularly imprinted acrilamide/acrilamidophenylboronic acid copolymer in development of sensors for diols. II 2nd International workshop on molecular imprinting, La Grande Motte, France, September 14-16,2002, p. 42.
Pogorelova S.P., Lahav M., Kharitonov А.В., Willner I., Imprinting of stereoselective and chiroselective recognition sites in ТІО2 thin films associated with ISFETs for sensing application. II 2nd International workshop on molecular imprinting, La Grande Motte, France, September 14-16,2002, p. 75.
Погорелова СП., Харитонов А.Б., Шипуло Е.В., Петрухин О.М., Виллнер И. Электрохимические сенсоры для определения никотинамидадениндинуклеотида (NAD-1) на основе молекулярно импринтированных мембран. // "ЭМА-2004 VI Всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа с международным участием", Тезисы докладов. Уфа, 23-27 мая, 2004, с. 57-58.
Погорелова СП., Харитонов А.Б., Петрухин О.М. Новые направления в использовании ионоселективных полевых транзисторов. // "Аналитика России 2004". Москва, 28-30 сентября, 2004, с.
Петрухин О.М., Погорелова СП., Харитонов А.Б., Шипуло Е.В,. Молекулярно - импринтированные полевые транзисторы для определения окисленных и восстановленных форм никатинамидадениндинуклеотида (NAD+ и NADH) и его фосфата. II Журн. аналит. хим., 2007., Т. 62., № 9.
Синтез, нанесение МИП на поверхность преобразователя
В настоящее время большинство работ по МИП посвящено органическим полимерам, синтезированным радикальной полимеризацией функциональных и сшивающих мономеров, имеющих виниловые или акриловые группы, с использованием различных нековалентных взаимодействий. Это объясняется, во-первых, относительно легким синтезом матрицы и, во-вторых, широким выбором доступных мономеров. Мономеры могут иметь основные (винилпиридин) или кислотные свойства (метакриловая кислота), образовывать водородные связи (акриламид), быть заряженными (N, N, N-триметиламиноэтилметакрилат), гидрофобными (стирол) и т. д. Данные мономеры обычно имеют низкие значения констант связывания при образовании комплекса с импринтируемым веществом. Поэтому для сдвига равновесия в сторону образования комплекса необходим их избыток. В последнее время стали появляться более сложные мономеры, образующие устойчивые комплексы с импринтируемой молекулой, которые могут быть использованы в стехиометрическом соотношении (16-20). Некоторые примеры мономеров, имеющих функциональные амино- и карбоксильные группы, приведены на рисунке 1.4. Другая возможность получения более устойчивого комплекса аналит/мономер, состоит в использовании полярных растворителей, таких как вода, а также координационных связей при использовании клешневидных мономеров металлов (12,21,22).
Для оптимизации полимеров по отношению к конкретному аналиту необходим комбинаторный подход к синтезу МИП (24-26) с использованием ряда ингредиентов, необходимых для процедуры импринтинга, в частности, функциональных мономеров и их молярного соотношения с темплатом. Данный подход был использован в работе (24). Например, МИП, селективные по отношению к триазиновому гербициду, тербутилазину, были оптимизированы с использованием комбинаторного подхода. Для этого были синтезированы различные МИП (25). Было проанализировано шесть функциональных мономеров (метакриловая кислота, метилметакрилат, гидроксиэтилметакрилат, трифторметилакриловая кислота, 4- винилпиридин, N-винил-а-пироллидон). Из шести мономеров метилметакрилат, 4-винилпиридин и N-винил-а-пироллидон позволяют получить полимеры, из которых импринтируемая молекула экстрагируется быстро и полностью, тогда как метакриловая и трифтороакриловая кислоты позволяют получить полимеры, которые удерживают импринтированную молекулу наиболее сильно. Также эти два мономера были проверены на селективность по отношению к тербутилазину. Для этого были синтезированы контрольные неимпринтированные полимеры, и проверена способность МИП и контрольных полимеров связывать аналит в стационарном режиме. Обнаружено, что лучшей селективностью по отношению к определяемому веществу обладает МИП на основе метакриловой кислоты.
Другие исследователи используют компьютерный молекулярный скрининг для выбора функциональных мономеров обладающих наиболее высокой аффинностью и селективностью по отношению к определяемому веществу (Пилецкий и др., доклад на конференции МІР 2000, Кардифф, Великобритания, июль, 2000 г.). Хотя полученные результаты были предварительными, метод представляется очень многообещающим, поскольку позволяет значительно сократить время, необходимое для оптимизации импринтированных полимеров.
В последнее время стали появляться сообщения о других полимерах, таких как полифенолы (27), полиаминофеиилбораты (28), полифенилеидиамины (29), сополимер полифенилендиамин/анилин (30), полиуретаны (31), сверхокисленные полипирролы (32) и другие. По сравнению с полимерами акрилового и винилового ряда, использование этих полимеров ограничено выбором функциональных мономеров.
Проведен импринтинг неорганических ионов (10) и органических молекул (33-39) с использованием в качестве полимерной матрицы оксида кремния. С использованием золь - гель полимеризации могут быть импринтированы даже объемные материалы. Данный метод позволяет сформировать микропористые материалы со специфически организованными функциональными группами (10, 34, 38, 39) или импринтированный слой полисилоксана на кремниевой оксидной поверхности (33, 37,40-42).
Традиционно, МИП готовят в виде объемных полимерных монолитов с их последующим механическим дроблением для получения микрочастиц. Несмотря на то, что полученный данным методом материал имеет широкое применение, требуется разработка новых методов синтеза МИП. До последнего времени существовало три формы синтеза МИП: синтез сферических частиц субмикрометрового размера, синтез тонких пленок и импринтинг на поверхности. Такие методы как полимеризация методом осаждения и эмульсионная полимеризация позволяют синтезировать МИП в виде наносфер. Первая может быть выполнена из полимеризационной смеси как и для объемных полимеров, за исключением более высокого содержания растворителя, присутствующего в полимеризационной смеси. В момент начала полимеризации импринтированные нано- или микросферы высаживаются из смеси, а не полимеризуются друг с другом и не формируют полимерный монолит. Этот метод имеет один недостаток - фактор разбавления и необходимость использования большого количества импринтируемых молекул, хотя это и компенсируется более высоким выходом продукта. Данный метод был успешно использован Ие и др. (43, 44) для приготовления импринтированных частиц и показал, что в ряде случаев эти частицы более предпочтительны, чем частицы, полученные дроблением (45). Уайткомб с сотрудниками разработал метод синтеза импринтированных полимеров, основанный на эмульсионной полимеризации, т. е. формировании маленьких шариков в двухфазной системе органическая фаза/вода и стабилизации их с помощью ПАВ. Особенность этого метода состоит в том, что импринтируемая молекула (в данном случае холестерин) является составной частью ПАВ (пиридин-12-(холестеролоксикарбонилоксидодекан сульфат) (46). Все импринтированные функциональные группы располагаются на поверхности частицы, рис. 1.5 А, что было доказано флоккуляцией с использованием PEG-бис-холестерина. Другой метод для создания импринтированных полостей на поверхности был разработан группой Хаупта (47). Импринтируемые молекулы перед полимеризацией были связаны с твердой подложкой в виде пористых шариков на кремниевой основе. Дальнейшая полимеризация в порах и удаление оксида кремния растворением приводит к формированию пористой полимерной структуры, функциональные группы которой оказываются расположенными на поверхности полимера и ориентируются в одном направлении (рис. 1.5 В).
Синтез МИП в виде тонких импринтированных полимерных пленок, также представляет особый интерес для дальнейшего использования. Они могут быть непосредственно синтезированы на поверхности электрода электрополимеризацией (27, 29, 30, 32) или на непроводящей поверхности путем химической прививки (28, 48). Применение техники мягкой литографии позволило получить тонкие слои МИП и матрицы на металлической поверхности (49). Примеры использования этой технологии в комбинации с молекулярным импринтингом для получения микроструктур на основе МИП приведены в работе (50). Однако существующие процедуры молекулярного импринтинга не всегда совместимы с полидиметилсилоксановыми подложками, используемыми в мягкой литографии.
Определение толщины полимерного покрытия на основе бутоксида титана (IV) затвора ПТ
Удаление темплата, ФФК, было достигнуто отмывкой импринтированного геля в водном растворе кислоты при комнатной температуре следующим образом. Импринтированный материал (200 мг) был перемешан в 1 М водном растворе НС1 (30 мл) при постоянном встряхивании в течение 1 часа. Гель был собран на воронке Бюхнера и отмыт 1 М водным раствором НС1 (30 мл) и затем отмыт 30 мл воды. Процедура была повторена несколько раз до полного удаления ФФК. Далее материал снова был высушен при 60 С под вакуумом в течение ночи для определения полноты отмывки и связывания ФФК с помощью ЯМР.
Связывание проводилось в водном растворе NaOH с доведением рН до 7.0. Концентрация ФФК была в 10 раз выше, чем используемая при приготовлении импринтированного полимера. Раствор был перемешан в течение ночи при комнатной температуре и затем собран на воронке Бюхнера, высушен под вакуумом при 60 С в течение ночи.
На рисунке 1.13 показаны спектры твердофазного 3Р ЯМР кристаллического ФФК (спектр а) и кремниевых гелей, функционализированных 1 и темплатом ФФК в молярном соотношении 2:1 (спектр Ь) и 1:1 (спектр Ь). Кристаллический ФФК имел один резонансный пик при 21.0 ppm, идентичный тому, что приведен в литературе (52). Для импринтированных гелей, ФФК имеет два пика химического сдвига при 15.5 и 6.5 ppm. При соотношении 1 к ФФК 2:1, интеграция этих пиков показывает относительную площадь пиков около 70 % для пиков при 6.5 ppm и 30 % для пиков при 15.5 ppm (Таблица 1.4). При соотношении 1:1 пик при 15.5 ppm становится доминирующим и составляет 69 % площади и 31 % для адсорбции при 6.5 ppm.
Исследование сродства к ФФК было выполнено на импринтированных гелях с соотношением 1 к ФФК 2:1. Гели были охарактеризованы твердофазным 31Р ЯМР до и после удаления темплата, а также после повторного связывания темплата. Удаление ФФК было достигнуто инкубированием импринтированного геля в 1 М водном растворе НС1 при комнатной температуре в течение часа. Приблизительно 93 % темплата было экстрагировано и подтверждено анализом фосфатов методом Барлетта, УФ спектрометрией и твердофазным 31Р ЯМР. Спектры адсорбции экстрагированного вещества дали хорошо разрешенные пики с химическим сдвигом, аналогичным рисунку 1.13,15.5 и 6.5 ррт (таблица 1.5).
Для сравнения были приготовлены импринтированные гели с использованием только триметиламмониевого мономера для определения поведения ФФК при комплексообразовании с полимерной матрицей, которое происходит посредством только ионного взаимодействия. Для аммониевых импринтированных гелей, ФФК имеет два пика химического сдвига при 15.9 и 7.8 ррт при соотношении 2 к ФФК 2:1 (таблица 1.5). Соотношение площадей пиков составило (74 : 26). Химические сдвиги этих пиков аналогичны тем, что наблюдались для гелей, функционализированных гуанидином, хотя для последних гелей в распределении площадей пиков значительную часть составляют пики высокого поля. Интересно, что отмывка кислотой геля, модифицированного аммониевыми мономерами, дала одинаковые результаты, как и для гелей, функционализированных гуанидином. Для поля высокого резонанса при 7.8 ррт значительную часть составляет комплекс ФФК с импринтированным гелем. Повторная отмывка гелей, функционализированных гуанидином и аммониевыми мономерами, кислотой ведет к полному удалению темплата.
Для определения связывания ФФК с функциональными группами геля темплат был подвергнут повторному связыванию с импринтированным гелем, функционализированным гуанидином. Гели были выдержаны в течение ночи в водном растворе ФФК при рН = 7.0 в 10 кратном избытке относительно номинального числа функциональных групп в геле. Концентрации растворов ФФК, которые были использованы для определения степени связывания темплата и матрицы твердофазовым 31Р ЯМР, представлены в таблице 1.6. Для контрольных полимеров соблюдали те же условия эксперимента. Контрольные полимеры не показали какую - либо адсорбцию ФФК на поверхности геля, что было определено твердофазовым Р ЯМР для гелей и УФ анализом для жидкой фазы.
ЯМР спектры импринтированных гелей после повторного связывания представлены на рисунке 1.14. Полученные пики были значительно шире, чем пики, полученные для исходного геля и после отмывки кислотой. Апроксимация кривых показала, что спектры на рисунке 1.14 могут соответствовать двойной абсорбции с химическим сдвигом 12 и 5 ppm. Значительное изменение химического сдвига связанного ФФК относится к исходному гелю. В частности, область низких значений и расширение пиков говорят о некотором изменении кремниевой матрицы и рецепторных функциональных групп.
Чтобы понять, что происходит со структурой полимерной матрицы после удаления ФФК при отмывке кислотой и после связывания, для каждой стадии были проведены твердофазовые 29Si ЯМР анализы. Полученные спектры представлены на рисунке 1.15. Распределение Q„ [Q„=Si(Osi)n(OR)4-n, где R = Н, алкиловая или ариловая группа] силиконовых участков матрицы идентично для исходного геля и для геля после отмывки кислотой {Q4 54 %, Qj 37 %, Q: б %, Т (спин релаксация) из мономера 1 3-4 %). После связывания произошли изменения значений распределения Q4 59 %, Qj 38 %, Qi 0 %, T 3-4%, что свидетельствует об изменении структуры геля, вызванного вымачиванием геля в растворе буфера при рН = 7.0. Изменения вызваны, вероятно, конденсацией кремниевой матрицы, которое наблюдается для золь - гель материалов при нейтральных рН щелочных растворов (53). Также, ТЭОС гели в водных растворах могут усиливать рецепторные функциональные группы для связывания ФФК вследствие усиления их гидрофильности, водородных связей и полярности поверхности. Значения, полученные из Si ЯМР спектральных анализов, подтверждают данное предположение.
Измерения на ПТ с мембраной на основе акриламид/метакриловая кислота и акриламид/акриламидфенилборная кислота
Связывание МИП с поверхностью преобразователя является важным аспектом дизайна электрохимических сенсоров на основе МИП. Существует несколько методов нанесения МИП на поверхность преобразователя: Полимеризация in - situ является одним из лучших методов связывания и состоит в in - situ нанесении МИП на поверхность преобразователя электрополимеризацией. Первое сообщение об этой технике нанесения было посвящено электрополимеризации полимера поли(о-фенилдиамина) (ПФД), молекулярно импринтированного нейтральным темплатом (глюкозой). ПФД служил распознавательным элементом сенсора на основе кварцево -кристаллического резонатора (ККР) для определения глюкозы. МИП был сформирован in - situ на поверхности платинового электрода пьезоэлектрического кварцевого кристалла, используемого а качестве рабочего электрода во время электрополимеризации (29). In - situ полимеризация имеет потенциальное преимущество для автоматического мониторинга связывания аналита и полимера. Поверхностное нанесение на поверхность преобразователя. Данный метод обычно используется для оптических преобразователей (56), также возможно применение данного метода для электрохимических преобразователей. Использование техники поверхностного нанесения (распыление или нанесение вращением) позволяет получить тонкую полимерную пленку МИП (предварительно растворенную в соответствующем растворителе). Введение частиц МИП внутрь геля (57) или мембраны (58) часто используется для мембран, непосредственно нанесенных на поверхность электрохимического преобразователя. Примером этого служат инертные растворимые полимеры, такие как ПВХ (поливинилхлориды), с введенными МИП частицами. Также эта техника применяется для нанесения мембран на поверхность аккустических преобразователей (59). Создание композитов на основе МИП. Эта техника состоит в объединении МИП с компонентом преобразователя, такого как графит, в угольном электроде (60). В этом случае связывание активных центров и проводящих частиц происходит в близком контакте. Простая механическая полировка может обновлять поверхность сенсора, открывая тем самым другие возможости для производства сенсоров на основе МИП.
Если аналит обладает неким специфическим свойством, таким как флуоресценция (31, 61, 62), то это свойство может быть использовано для создания оптических сенсоров, основанных на МИП. Например, хроматографическая проточная система с определением флуоресценции была использована для создания чувствительного устройства на флуоресцирующий аналит флавонол. Темплат реагировал с мембраной, импринтированной флавонолом, содержащейся в ячейке оптического детектора, что делало возможным его определение на наномолярном уровне (62). Другая система включала флуоресцирующий металлопорфирин, полимеризуемая производная которого использовалась как один из функциональных мономеров. Он (63) использовался в данной системе в качестве сигнальной группы. Связывание темплата, 9 - этиладенина, с полимерной матрицей приводило к прекращению флуоресценции полимера.
Очень чувствительный сенсор на продукты гидролиза замана, основанного на использовании оптических волокон, покрытых полимером, и люминесцентного комплекса европия, был описан в работе (64). Комплекс европия, связанный с дивинил - метилбензоатом (сшивающим мономером) и аналитом, пилакоилметилфосфонатом, был сополимеризован со стиролом. После этого аналит вымывался. Вторичное связывание аналита количественно определялось из спектров люминесценции. Метод привлекателен из-за очень низкого предела обнаружения темплата, в данном случае 7 ppt (64).
Мембранные преобразователи на основе флуоресцирующих полимеров интересны тем, что сигнал вырабатывается самим полимером. Примером этого является оптическая система, в которой флуоресцентные группы введены в МИП, свойства которого изменяются при связывании аналита (65, 66). Например, функциональный флуоресцентный мономер хлорид транс- 4 - [р -N,N - диметиламиностирол] - N - винилбензилпиридина был использован вместе со стандартным функциональным мономером для приготовления полимера, импринтированного циклическим аденозинмонофосфатом (65). То есть, сам полимер обладал флуоресцентными свойствами. При связывании с импринтированным полимером аденозинмононфосфат взаимодействал с его флуоресцентными группами, прекращая их флуоресценцию, что позволило количественно определить аналит.
Сигналы, вырабатываемые большинством описанных выше типов преобразователей, являются двухмерными и не дают полной информации о строении образца, хотя это компенсируется высокой селективностью МИП. Другой стратегией является использование "интеллигентных" преобразователей, которые вырабатывают сигналы с более высоким содержанием информации. Комбинация МИП с инфракрасной спектрометрией могла бы помочь решить проблему определения аналита в образцах со сложными матрицами, или для веществ очень близких по структуре. Примером этого является разработка химического сенсора, основанного на МИП и затухающей инфракрасной волновой спектроскопии (67). Полимер, импринтированный 2,4 - дихлорэтаном, был нанесен тонким слоем на ослабляющую отражение подложку на основе ZnSe, вмонтированную в проточную ячейку. Накопление 2,4 - дихлорэтана в слое МИП было отслежено спектрофотометрическим методом в режиме реального времени. Степень связывания аналита зависела от его концентрации и количественно определялась по сигнальным группам МИП.
ПТ с неорганическими полимерными мембранами, импринтированными производными фосфоновой кислоты и тиолами
Соответствующие субстраты бензилфосфоновых и карбоксильных кислот и тиофенола (во всех случаях 25 мМ) были растворены в 10 мл смеси обезвоженного толуола и этанола (1:1) при постоянном перемешивании до полного растворения субстратов. Затем по каплям и при постоянном перемешивании было введено 0.34 мл бутоксида титана Ті(0-лВи)4. Перемешивание продолжалось 12 ч до полного растворения компонентов. Процесс полимеризации бутоксида титана Ti(0-«Bu)4 инициирован добавлением 0.49 мкл воды при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 4 часов.
Для модификации затвора ПТ 0.4 мкл смеси, содержащей комплексы бутоксида Ti(IV) с фосфоновыми, карбоксильными кислотами или тиофенолами, было нанесено на предварительно очищенную этанолом и толуолом поверхность затвора транзистора. Затем поверхность затвора была высушена при 40 С в печи (Eurotherm) в течение ночи. ПТ отмывали сначала толуолом, а затем раствором фосфатного буфера (0,1 М, рН 7.2 ). Золь-гель полимеризация смеси на затворе из оксида алюминия формирует импринтированную мембрану для соответствующего субстрата. Введение фосфоната было исследовано с помощью ИК Фурье спектроскопии, которая подтвердила возникновение связи Ti/бензилфосфонатный комплекс при 1490 см 1. Обработка полимерной пленки раствором аммония (1% об.) приводит к разрыву связей между полимерной матрицей и функциональными группами темплатов, что приводит к удалению темплата из мембраны и формированию молекулярно импринтированного контура внутри полимера для соответствующих кислот. Для бензилфосфоновых кислот это было подтверждено методом ИК Фурье спектроскопии по исчезновению связи Ті/фосфонат при 1490 см"1 при обработке полимерной пленки раствором аммония (1% об) в течение 6 часов. Удаление импринтированного тиофенола происходило при обработке 5%-ным раствором изопропанола в течение 20 минут. ПТ с нанесенной импринтированной мембраной на основе ТіСЬ был помещен в рабочую ячейку, содержащую 0,8 мл раствора фосфатного буфера (0,1 М, рН 7.2) и соответствующие субстраты карбоксильных кислот с различными концентрациями. Измерения фосфоновых кислот проведены с использованием смеси фосфатного буфера (0,01 М, рН 7.2) и этанола [10:1 об.]. Для приведения фосфоновых кислот в ионизированную форму рН исходного 1x10"2 М раствора доводили до 5.0 с помощью 0.1 М соляной кислоты. Другие концентрации готовились последовательным разбавлением исходной концентрации в растворе смеси фосфатного буфера (0,01 М, рН 7.2) и этанола [10:1 об.]. Каждое измерение проводилось в течение 15 минут с регистрацией показаний прибора через каждые 2 минуты. Ток стока и напряжение между истоком и стоком транзистора поддерживали постоянными (1с = 100 мкА и Еси = 1.5 В). Все измерения проводились при Т = 25 ± 2 С без перемешивания. Воспроизводимость измерений составляля ±2 мВ при числе измерений n = 5. Между измерениями электроды хранили в герметично закрытых контейнерах при 5 "С.
ИК Фурье спектроскопические (ИКФС) измерения проводились на инфракрасном микроскопе (IRSCOPE II), соединенным с вектором 22 Bruker спектрометра. Стандартный инфракрасный объектив с увеличением х15 был присоединен к прибору с 2.5 вектором (равнодействующей) {d= 166 мкм). Для получения сигнала с разрешением 4 см " обычно проводилось 100 циклов сканирования. Для получения полезного сигнала по отношению к шуму использован детектор МСТ (MgCdTe). Фоновый спектр был получен из спектра изучаемого образца с коррекцией базовой линии для каждого спектра. Толщина полимерного слоя на основе бутоксида титана на затворе ПТ была определена импедансометрически с использованием электрической цепи, приведенной в работе (95) (Supporting inform.) Ранее данный метод был успешно использован для характеризации различных модифицированных полимерных пленок на затворе ПТ (93, 94). Модифицированный затвор АЬОз ПТ и Pt проволока (d = 0.8 мм) в качестве электрода сравнения, установленная на расстоянии 2 мм от поверхности затвора, были помещены в ячейку, заполненную 0,8 мл анализируемого раствора. Характеристические кривые ПТ (зависимость Еы от /с при соответствующем .,и) были записаны с помощью анализатора полупроводниковых параметров (HP 4155В). Последовательные измерения проводились с помощью программируемого электрометра (Keithley 617), запирающего усилителя (Stanford Research System, Model SR 830 DSP) и двухканального цифрового осциллоскопа (Tektronix TDS 220). Для спектроскопических импедансометрических измерений в электрическую цепь включался ПТ. Значение ЕС]Л = 1.5 В поддерживалось с помощью мультиметра SKL MAS930L, используемого в качестве потенциометра. Затем с помощью электрометра (Keithley 617) значение Ек регулировалось изменением потенциала постоянного тока до 0.75 В. Величина k поддерживалась постоянной (1с = 100 мкА) с помощью мультиметра. Эти условия позволили усилить выходной сигнал, регистрируемый на осциллоскопе, в результате приложения на RMS АС напряжения равного 0.3 В от внутреннего синуса волны сравнения запирающего усилителя. Транспроводимость определялась как отношение выходного сигнала, Еьш, измеренного в диапазоне частот от 1 Гц до 100 кГц, к мнимому импендансу Zmm. Значения потенциалов, соответствующих ZMHHM, были нормализованы к 1 Гц для получения соответствующих значений функции переноса.
