Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные подходы к химической идентификации (аналитический обзор литературы) 11
1.1. Термины и понятия 11
1.2. Принципы идентификации 12
1.3. Методы идентификации 14
1.4. Критерии идентификации 15
1.4.1. Аналитические методики 15
1.4.2. Анализ пробы неизвестного состава 20
1.5. Ошибки и надежность идентификации 23
1.6. Нерешенные проблемы масс-спектрометрической и хромато-масс-спектрометрической идентификации 26
Глава 2. Экспериментальные, вычислительные и информационные методы 29
2.1. Реактивы 29
2.2. Приготовление проб и их анализ 29
2.3. Идентификация примесей в образцах н-гексана и нафталина 32
2.3.1. н-Гексан 32
2.3.2. Нафталин 36
2.4. Идентификация ПАУи их производных 36
2.5. Информационный поиск в документальных научных базах данных ...38
2.5.1. Общие характеристики
2.5.2. Примеси в н-гексане и нафталине, смесь ПАУ 41
2.5.3. Примеси в различных органических веществах 45
2.6. Переносимая библиотека масс-спектров МС 48
2.7. Масс-спектры трипептидов 57
2.8. Термодинамические расчеты 63
Глава 3. Концепция идентификации как совокупности операций выдвижения и испытания гипотез 65
3.1. Предпосылки и значение концепции 65
3.2. Идентификационные гипотезы 66
3.3. Экспериментальные гипотезы 67
3.4. Статистические гипотезы 69
3.5. Априорная информация в выдвижении гипотез 74
Глава 4. Статистическая обработка априорной информация 79
4.1. Статистика известных химических соединений 79
4.2. Множества известных и распространенных химических соединений.79
4.3. Статистическая априорная информация в идентификации органических соединений 83
4.3.1. Общие положения 83
4.3.2. Примеси в н-гексане и нафталине 87
4.3.3. Смесь ПАУ и их производных 92
4.3.4. Примеси в органических веществах (систематическая выборка).93
4.3.5. Практическое использование информационно-статистических показателей 101
Глава 5. Надежность идентификации органических соединений методом хромато-масс-спектрометрии 105
5.1. Примеси в н-гексане 105
5.2. Примеси в нафталине 110
5.3. Смесь ПАУ и их производных 114
Глава 6. Справочные библиотеки спектров для тандемной масс-спектрометрии и жидкостной хромато-масс-спектрометрии 119
6.1. Общие положения 119
6.2. Переносимая библиотека, содержащая 3126 тандемных масс-спектров 1743 соединений 125
6.2.1. Общие результаты библиотечных поисков 129
6.2.2. Количество спектров различных соединений 129
6.2.3. Тип тандемных масс-спектрометров 132
6.2.4. Справочные спектры МС1, МС3 и МС4 132
6.3. Надежность идентификации трипептидов при сравнении со справочными и теоретическими спектрами 133
Глава 7. Связь масс-спектров электрораспыления и физико-химических явлений в растворах 149
7.1. Пестициды дикват и паракват 150
7.1.1. Общая характеристика масс-спектров 151
7.1.2. Восстановление и депротонирование катионов солей 160
7.1.3. Дважды заряженные кластерные ионы 161
7.2. Ионные жидкости 163
7.2.1. Масс-спектры индивидуальных соединений 165
7.2.2. Масс-спектры смесей 173
Выводы 178
Список литературы 180
Приложение А 203
- Нерешенные проблемы масс-спектрометрической и хромато-масс-спектрометрической идентификации
- Информационный поиск в документальных научных базах данных
- Практическое использование информационно-статистических показателей
- Надежность идентификации трипептидов при сравнении со справочными и теоретическими спектрами
Введение к работе
Повышение качества химического анализа требует совершенствования как методов количественного определения, так и процедур идентификации определяемых веществ. Эти процедуры являются неотъемлемой частью аналитических методик, но их надежность до последнего времени редко рассматривалась химиками-аналитиками, а также метрологами и специалистами в области стандартизации. В настоящее время известны десятки миллионов химических веществ; сотни тысяч органических соединений широко применяются и часто встречаются в анализируемых образцах различного происхождения (см. [1]). Поэтому особые трудности представляют проблемы, связанные с анализом проб неизвестного состава. В этом случае конечный успех работы решающим образом зависит от надежности идентификации неизвестных компонентов проб аналитическими методами, сочетающими разделение сложных смесей на отдельные компоненты (индивидуальные соединения или их небольшие группы) и их специфическую характеризацию.
К таким методам, наиболее эффективным при установлении идентичности органических соединений, в том числе компонентов сложных смесей, относятся масс-спектрометрия и хромато-масс-спектрометрия, которые бурно развиваются в последнее время (см. статистику научных публикаций и изобретений, табл. 1). Наблюдается прогресс в достаточно традиционной области масс-спектрометрии, связанной с летучими соединениями, электронной ионизацией и газовой хроматографией (соединение с масс-спектрометрией) и, особенно, в масс-спектрометрии малолетучих и нелетучих соединений, к которым относятся подавляющее большинство биологически важных веществ. Многочисленные новые применения масс-спектрометрии обусловлены развитием методов "мягкой" ионизации, прежде всего электрораспыления, тандемной (кратной) масс-спектрометрии и жидкостной хромато-масс-спектрометрии.
Таблица 1. Ежегодное количество новых документов (статьи, патенты, диссертации, книги) в информационной системе Chemical Abstract Service
Методологическое, методическое и информационное обеспечение химического анализа с применением масс-спектрометрии и хромато-масс-спектрометрии, однако, отстает от выпуска новых приборов. Это в полной мере относится к качественному химическому анализу, идентификации органических соединений. Например, масс-спектрометры с электрораспылением жидкости, в том числе тандемные приборы, и их комбинации с жидкостными хроматографами до проведения настоящей работы выпускались без библиотек соответствующих масс-спектров. Более того, такого рода переносимые библиотеки практически не разрабатывались, надежность их применения не изучалась. Во многом неясными остаются подходы к интерпретации масс-спектров новых видов. Действительно, типы регистрируемых ионов (четноэлектронные заряженные частицы, кластерные ионы, отрицательные ионы) во многом отличаются от тех, которые обычны для традиционной масс-спектрометрии (значительна доля катион-радикалов). Необходимо четкое установление пиков, характеризующих молекулярную массу аналитов; информация о молекулярной массе позволяет резко уменьшить число гипотез о природе определяемых веществ.
Повышение надежности процедур качественного определения с применением указанных методов не сводится только к методическим инновациям, относящимся собственно к масс-спектрометрии, а представляет собой многоаспектную проблему. Необходимы критическая оценка общих принципов (теории) химической идентификации, выяснение
6 природы ошибочных результатов, количественная оценка ошибок; поиски и развитие новых идентификационных процедур, новых видов информационного обеспечения.
Так, если состав пробы заранее неизвестен, аналитику требуются различные версии (идентификационные гипотезы), касающиеся этого состава. Поэтому необходимо разрабатывать методы поиска и обработки априорной химической информации. Результатом применения таких информационных методов должно быть резкое сужение числа гипотез о химических веществах, присутствующих в анализируемой пробе, что облегчает проверку гипотез и установление состава пробы.
В поисках методов количественного оценивания идентификационных ошибок целесообразно изучить возможности статистических тестов, которые позволяют установить значимость различий экспериментальных и справочных данных (как показателя надежности идентификации). Следует также учесть, что накоплены относительно большие массивы справочных газохроматографических индексов удерживания и справочных масс-спектров электронной ионизации. Поэтому подходы к количественному (статистическому) оцениванию надежности идентификации целесообразно развивать на примерах сравнения экспериментальных и справочных индексов удерживания и масс-спектров. Это имеет значение и для самой хромато-масс-спектрометрии (с газовой хроматографией) как широко применяемого аналитического метода.
Актуальность научных исследований в рассмотренных областях определяют цели настоящей диссертационной работы: разработка и развитие новых подходов к идентификации органических соединений на основе априорной химической информации и новых библиотек справочных масс-спектров, при усовершенствовании способов сравнения экспериментальных и справочных хромато-масс-спектрометрических данных и способов интерпретации масс-спектров новых видов. Для реализации цели работы выбраны примеры конкретных аналитических задач, наиболее полно отражающих эти цели и имеющих самостоятельную научную и практическую значимость: рассмотрена идентификация
7 примесей в чистых углеводородах, экотоксикантов, пестицидов, лекарственных веществ и примесей в них, ионных жидкостей, аминокислот, пептидов и других групп веществ.
В связи с указанными целями в число решаемых в работе задач входило:
Развитие подходов к химической идентификации как проверке гипотез о природе веществ, присутствующих в анализируемой пробе, и подходов к оценке надежности идентификации.
Разработка идентификационных процедур, в которых для выдвижения гипотез используется априорная информация о распространенности анализируемых веществ.
Сравнение возможностей интервальных и статистических критериев идентификации с целью выбора их оптимального сочетания и алгоритма их использования на примере хромато-масс-спектрометрической идентификации алифатических и ароматических углеводородов в сложных смесях.
Разработка и изучение эффективности применения библиотек тандемных масс-спектров практически значимых классов малолетучих и нелетучих органических соединений.
Практическая реализация подходов к масс-спектрометрической идентификации биологически важных соединений при сравнении экспериментальных масс-спектров (тандемные спектры, спектры электрораспыления) со справочными и теоретическими спектрами на примере идентификации коротких пептидов.
Исследование закономерностей влияния химических и физико-химических свойств (окислительно-восстановительные и кислотно-основные свойства, поверхностная активность) нелетучих органических соединений (соли - пестициды и ионные жидкости) на образование ионов, характеризующих молекулярные массы (массы катионов и анионов) аналитов, при электрораспылении их растворов.
Нерешенные проблемы масс-спектрометрической и хромато-масс-спектрометрической идентификации
Терминология в отношении качественного химического анализа и идентификации не стандартизована. Приведем несколько типичных определений, не полностью согласующихся между собой. "Идентификация (от ср.-век. лат. identifico - отождествляю) химическая - установление вида и состояния молекул, ионов, радикалов, атомов и др. частиц на основе сопоставления экспериментальных данных с соответствующими справочными данными для известных частиц" [2, с. 345]. "Термин "идентификация" используется в двух смыслах: как отождествление молекул по идентичности спектров и как определение состава вещества" [ 3, с. 13]. "Идентификация ... не процесс, а результат проведенного качественного анализа, логический вывод, а именно признание некоторого компонента присутствующим в исследуемой пробе ..." [4, с. 8]. Обобщая указанные выше и другие трактовки понятия "идентификация", можно предложить следующее определение: Химическая идентификация представляет собой отождествление аналита с известным химическим соединением (группой таких соединений) или отнесение аналитического сигнала к известному соединению (группе соединений). Два аспекта этого определения требуют дополнительного комментария. Во-первых, аналитик, как правило, имеет дело не с определяемым веществом (аналитом), которое часто присутствует в пробе в очень небольших количествах и скрыто от глаз аналитика, а с аналитическим сигналом (хроматографическим пиком, молекулярным спектром и т.д.), который и требуется отнести к тем или иным соединениям. Во-вторых, идентификация - это и аналитическая процедура, и результат ее реализации, и, главное, "мостик" между процедурой и результатом, который представляет собой мнение/решение аналитика о тождестве между аналитом и тем или иным известным веществом в соответствии с заранее установленными или ad hoc критериями. Понятия "идентификации" и "качественного анализа" часто считают близкими: "Качественный анализ - идентификация (обнаружение) компонентов анализируемых веществ и приблизительная количественная оценка их содержания в веществах и материалах" [2, с.359]. "Качественный анализ - анализ, в котором вещества идентифицируют или классифицируют на основе их химических или физических свойств, таких как химическая реакционная способность, растворимость, молекулярный вес, температура плавления, испускание или поглощение излучения, масс-спектры, полупериоды полураспада ядер и т.д." [5].
Даже если придерживаться мнения о близком смысле этих терминов, то необходимо отметить, что они применяются часто в различных областях химического анализа: "идентификация" - в органическом анализе, "качественный анализ" - при определении элементов (например, в той или иной ионной форме). В настоящей работе "идентификация" рассматривается как более узкое понятие в сравнении с "качественным анализом". О "ширине" последнего свидетельствует то, что к качественному химическому анализу иногда относят и процедуры "обнаружения", "определения структуры" (термин чаще всего относится к новым соединениям), а также "определения" и "скрининга" (эти термины в ряде случаев употребляют в отношении "не-количественного" анализа).
При идентичности свойств (характеристик) аналита и одного их химических веществ (вещество А) и отличии от свойств (по крайней мере, нескольких свойств) всех остальных веществ аналит считается однозначно идентифицированным как вещество А. Идентичными обычно бывают качественные признаки, связанные с определенными типами реакций: цветными реакциями, образованием осадка, газовыделением. Поэтому идентичность свойств обычно встречается при определении элементов или групповом анализе органических соединений (реакции определенных функциональных групп) [2, с.359].
Идентификацию индивидуальных органических соединений обычно осуществляют по результатам применения аналитических процедур, которые рассматриваются метрологами как измерения - измерения времени (времени удерживания в хроматографии), длины (длины волн, относящиеся к определенным спектральным линиям), массы (массы ионов, соответствующих пикам в масс-спектре) и т.д. Поэтому свойства, на основании которых принимают идентификационные решения, являются, чаще всего, значениями непрерывных физических величин.
Эти значения определяют с определенной погрешностью (неопределенностью); соответствующие средние величины или отдельные значения редко совпадают. Таким образом, для отдельных или средних значений измеряемых величин более корректным является утверждение, что при идентификации имеет значение не идентичность, а сходство свойств.
С другой стороны, округленные числа (результаты измерений) можно рассматривать как дискретные значения, идентичность которых может обеспечить идентификацию. Кроме того, любые непрерывные величины можно разбить на отдельные интервалы, рассматриваемые как различные дискретные признаки. Попадание значения той или иной величины аналита в интервал справочных значений для вещества А означает совпадение признаков аналита и вещества А и возможность идентификации. Интервалы значений различных величин для разных веществ связаны с соответствующими критериями идентификации.
Большинство аналитических методов может быть использовано для идентификации. Масс-спектрометрия и хромато-масс-спектрометрия имеют наибольшие возможности, поскольку характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью и позволяют получать значительное количество разнообразной информации [6-12]. Схема соответствующих приборов приведена на рис .1
Информационный поиск в документальных научных базах данных
В общем виде схема решения задачи с применением хромато-масс-спектрометрии выглядит следующим образом. Пробу (или часть пробы, отделяемую от матрицы, например, с применением процедур экстракции) подвергают хроматографическому разделению на отдельные компоненты в максимально широком диапазоне температур кипения, полярности, молекулярных масс и др. свойств (характеристик) соединений. Для каждого компонента смеси определяют соответствующие индексы удерживания (ИУ) и регистрируют масс-спектры. Компоненты смеси идентифицируют, используя справочные базы данных по ИУ и масс-спектрам. Идентификацию можно подтвердить с использованием стандартных образцов состава (аналитических стандартов, веществ сравнения).
Относительно надежно эта задача решается для летучих и полулетучих соединений с применением хромато-масс-спектрометрии, поскольку в этом случае, во-первых, экспериментальные данные хорошо воспроизводятся и, во-вторых, имеется достаточно хорошее информационное обеспечение.
До 2005 г. существовало несколько разрозненных сводок ИУ (см. напр. [30-35]), охватывающих суммарно, по-видимому, не более - 10 тыс. соединений. В 2005 г. NIST выпустил базу данных, включающую 121 тыс. значений ИУ для 26 тыс. соединений. Критерии идентификации обычно связаны со справочными ИУ и соответствующими интервалами, отвечающими типичному разбросу ИУ.
Существует несколько больших электронных библиотек масс-спектров ЭИ. Библиотека Wiley, 7-ая версия, включает 390 тыс. спектров, относящихся к 317 тыс. соединений [36]. Последняя версия библиотеки NIST (NIST 05) охватывает 191 тыс. спектров 163 тыс. соединений. По данным [36] новая библиотека фирмы Palisade объединяет коллекции Wiley-7 и NIST 02, включает некоторые другие данные, что суммарно составляет 606 тыс. спектров 495 тыс. соединений. Кроме того, существуют специализированные библиотеки масс-спектров ЭИ, например, в области пестицидов, лекарств и их метаболитов [37]. Критерии масс-спектрометрической идентификации связаны с высокими значениями показателей сходства (ПС) спектра аналита и справочного спектра.
Масс-спектры сами по себе обеспечивают гораздо более надежную идентификацию, чем хроматографичесше индексы. Тем не менее, масс-спектры ЭИ изомеров и некоторых других групп веществ во многих случаях весьма сходны, и для дифференциации этих веществ хроматографические данные становятся необходимыми. Определенное преимущество использования газохроматографических ИУ (по сравнению, например, со спектральными данными) заключается в том, что эти величины поддаются относительно надежному оцениванию и предсказанию [38-48].
В последние годы широкое распространение в анализе нелетучих соединений получила техника жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС), причем в этом сочетании часто используется тандемная масс-спектрометрия (МС2) (в общем случае - кратная масс-спектрометрия, МСП) и масс-спектрометрия высокого разрешения. Эффективность применения этих методов для определения неизвестных соединений в настоящее время относительно невелика из-за отсутствия полноценного методического и информационного обеспечения. Действительно, ИУ нечасто используют в ВЭЖХ вследствие их относительно низкой воспроизводимости, хотя они имеют определенное аналитическое значение [43, 49-53]. Недавно изучено применение ИУ в жидкостной хроматографии белков [54-56]. Параметры, аналогичные ИУ, применяли в капиллярном электрофорезе и родственных методах [57-60].
Что касается новых масс-спектрометрических методов, то библиотеки соответствующих масс-спектров (масс-спектры электрораспыления и др.; тандемные масс-спектры) только начинают развиваться (раздел 6). Способы интерпретации спектров также относительно плохо разработаны (в отличие от масс-спектров ЭУ [3, 7, 9-Ю, 12]).
Конкретный результат идентификации объективно может положительным или отрицательным, правильным или ложным (таблица 6); аналитик оценивает экспериментальные и справочные данные и формулирует этот результат. Для выражения степени уверенности аналитика в правильности отдельного результата идентификации или серии таких результатов в научной литературе встречаются различные термины: "вероятность" [61-63], "надежность" [64], "неопределенность" [64], "определенность" [65,66], "степень достоверности" [26] идентификации. В настоящей работе в качестве основного выбран термин "надежность идентификации" как наиболее распространенный в русской и английской (reliability) научной и технической лексике. Действительно, поисковая программа Google показывает следующую частоту встречаемости различных терминов в Интернете (поиск проведен 22.12.2005): "надежность идентификации" -183 раза, "вероятность идентификации" -168, "неопределенность идентификации" - 21 и т.д.; "reliability of identification" - 102000, "identification reliability" - 1120, "probability of identification" - 550, "identification probability" - 519, "identification certainty" -510 и т.д. В итоге определим надежность идентификации как вероятность ее правильного результата.
За исключением отдельных примеров, демонстрирующих оценку вероятности идентификации в рамках того или иного модельного подхода [67,68], очень сложно провести такую оценку в общем случае. Действительно, при определении неизвестных компонентов анализируемых проб необходимо установить специфичность аналитического определения, степень включения в справочные базы данных различных соединений, качество справочных и экспериментальных данных и т.д. и количественно выразить эти факторы, что представляет собой очень сложную проблему.
С другой стороны, надежность идентификации может быть выражена количественно в виде различных показателей надежности, например ширины интервалов значений измеряемых величин или значений различных показателей сходства спектров (match factors) (табл. 7).
Практическое использование информационно-статистических показателей
В исследовании использовали гексан "для хроматографии" фирмы "Экрос" (Санкт-Петербург), воду высокой чистоты ("Burdick and Jackson Labs", США), метанол квалификации "ACS/ HPLC/GC grade" ("Mallinckrodt", США).
Нафталин (два различных образца) был получен из NIST (Gaithersburg, США) и исследован в рамках международных сличительных экспериментов по определению чистоты, проведенных под эгидой Консультативного комитета по количеству вещества при Международном бюро мер и весов [88]. Моногидрат дибромида диквата и дихлорид параквата поставлены фирмой "AccuStandard" (США). Ионные жидкости получены и очищены сотрудником NIST П. Нета по методикам [89-91]. Трипептиды RLK, RIK, KLR, KIR, LRK, IRK, LKR, IKR, KRL, KRI, RKL, RKI (шесть пар различных аминокислотных последовательностей с лейцином и изолейцином в каждой паре), имевшие конфигурацию L,L,L и чистоту более 95 %, синтезированы компанией "New England Peptide" (США). Аминокислоты L-лейцин и L-изолейцин, поставщик "Aldrich Chemical" (США), имели чистоту 99 %. Другие химикаты: муравьиная (50 % воды, "Fluka Chemie", Швейцария) и трифторуксусная ("Sigma Chemical", США) кислоты - квалификация чистоты" puriss. р.а.". Анализ проб методом хромато-масс-спектрометрии (газовая хроматография) проведен на приборе фирмы Fisons, включающем газовый хроматограф GC 8060 и масс-спектрометр MD 800; использованы стандартные условия ЭИ. Гексан и нафталин. Использована хроматографическая колонка Hewlett Packard HP-5MS метилсилоксан + 5 % фенилсилоксана, длина 60 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,1 мкм (колонка І). В экспериментах, в которых определяли индексы Ковача примесей в гексане и нафталине, температура колонки была 30 С (гексан) and 70 С (нафталин). Вводили 1 мкл гексана (5 раз) и 1 мкл раствора нафталина в хлороформе с концентрацией 10 мг/мл (3 раза). ПАУ и их производные. Анализировали отходящие газы Волгоградского алюминиевого завода. Газы, содержащие пыль, пропускали через фильтр АФАС-ПАУ ("Новопор", Новороссийск) в течение 20 мин. Вещества, поглощенные фильтром, извлекали из него экстракцией н-гексаном. Экстракт помещали в колонку, заполненную силикагелем L (частицы 40/100 мкм, 1-2 г, "Экрос", Санкт-Петербург). Аналиты элюировали смесью гексана и хлористого метилена ("Криохром" Санкт-Петербург); элюат анализировали. Вводили 1 мкл раствора не менее двух раз. Использованы aхроматографические колонки I (см. выше) и II: Alltech АТ-50 метилсилоксан + 50 % фенилсилоксана, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм. Разделение, в том числе с добавками стандартных образцов ПАУ ("Экрос", Санкт-Петербург), и определение ИУ проводили в следующих режима: ? колонка I: 2 мин при 40 С, подъем температуры до 300 С со скоростью 4 С/мин, 1 мин при 300 С; ? колонка II: 5 мин при 30 С, подъем температуры до 250 С со скоростью 5 С/мин, 90 мин при 300 С. Исследования с применением ЭР и тандемной масс-спетрометрии проведены на тройном квадрупольном масс-спектрометре Quattro Micro фирмы "Micromass" (Англия). Напряжение на капилляре составляло 3,0 кВ. Давление аргона, используемого при столкновительной активации (в условиях МС2), составляло 3,9-4,1 мбар.
Дикват и паракват. Растворы с концентрацией 0,1 % (масса/объем) в водном метаноле (50:50) вводили в масс-спектрометр с использованием шприцевого насоса (прямой ввод раствора) со скоростью потока 5 мл/мин. Напряжение на противоэлектроде (конус) составляло 15-45 В. Энергию столкновений варьировали в интервале 5-60 эВ. Длительность сканов МС1 и МС2 составляла 10-30 с и 20-120 с соответственно. Регистрировали от 2 до 4 серий всех спектров с интервалом несколько недель между сериями. В каждой серии регистрировали по три скана простых спектров ЭР и тандемных масс-спектров дочерних и родительских ионов для частиц Cat+, [Cat-1]+, Cat2+ и различных кластерных ионов.
Ионные жидкости. Для прямого ввода в масс-спектрометр готовили растворы индивидуальных соединений в водном метаноле (50:50) с концентрацией 200-400 мкмоль/дм3 (0,01 %, масса/объем) и растворы смесей в том же растворителе с концентрацией отдельных солей 1-И000 мкмоль/дм3. Скорость потока - 5 мл/мин. Напряжение на противоэлектроде составляло 5-55 В. Энергию столкновений варьировали в интервале 5-50 эВ. Длительность сканов МС1 и МС2, от m/z 15-80 до 300-1000, составляла 10-60 с. Обычно усредняли три скана длительностью 40 с.
Трипептиды и аминокислоты. Эти соединения растворяли в смеси 1 М муравьиной кислоты (приготовлена из 50 % кислоты) и метанола, взятых в равных объемах; концентрация полученных растворов 0,1 % (масса/объем).
Масс-спектры ЭР и связанные с ними спектры МС2 зарегистрированы на указанном тройном квадрупольном масс-спектрометре Quattro Micro, соединенным с жидкостным хроматографом Waters 2695 ("Waters", США). Растворы пептидов и аминокислот вводили в масс-спектрометр, применяя шприцевой насос, при постоянной скорости потока 5 мкл/мин, или вводили в колонку хроматографа.
При электрораспылении растворов напряжение на противоэлектроде составляло 15-45 В. Температура в источнике ионов и температура "десольватации" - соответственно 80 и 150 С при прямом вводе растворов, 100 и 250 С при хроматографическом вводе. При регистрации спектров МС2 энергию столкновений варьировали в интервале 5-30 эВ. При прямом вводе растворов длительность сканов МС1 и МС2 (от m/z 50-70 до 500) составляла 10-30 с, при хроматографическом вводе 2 с; интервал между сканами 0,1 с в обоих случаях.
При хроматографировании использовали колонку Symmetry С18 ("Waters") размером 2,1x50 мм, зернение 3,5 мкм. Скорость потока составляла 0,1 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали смесь 0,03 % трифторуксусной кислоты (А) и метанола (В) в линейном градиентном режиме элюирования: от 25 до 30 % в течение 2,5 мин с последующим возвращением к 25 % в течение того же периода времени. Объем пробы 10-20 мкл.
Надежность идентификации трипептидов при сравнении со справочными и теоретическими спектрами
Для каждой примеси вычисляли показатели встречаемости и совместной встречаемости с соответствующими основными компонентами в базе данных Chemical Abstracts Plus (см. выше) за период с начала формирования данного массива информации (начало XX века) по 2003 г. включительно.
Пример. Ангидротетрациклин обнаружен как одна из примесей в тетрациклине [116]. Поиск, проведенный в мае 2004 г. с использованием поисковых слов "anhydrotetracycline" и "anhydrotetracycline AND tetracycline" привел к 393 (это частота f) и 346 (это совместный показатель cf) документам соответственно. Т.о., относительный совместный показатель встречаемости гсг"для ангидротетрациклина равен 346/393 = 0,88.
Частоты встречаемости и совместной встречаемости для примесных соединений сравнивали с соответствующими показателями веществ ("не-аналитов"), принадлежащих к трем референтным группам (рис. 3). Одна из этих групп представляет все известные химические соединения; две другие являются различными выборками веществ, совместно встречающихся с 17 основными веществами. Для них также рассчитывали показатели встречаемости и совместной встречаемости с основными соединениями.
Группа I включала 100 химических веществ, случайно выбранных из множества известных химических соединений (см. выше). Учитывали показатели только низкомолекулярных органических веществ (59 соединений), входящих в эту группу.
Референтная группа II включала органические соединения, совместно встречающиеся с 17 основными веществами в публикациях и патентах 1994-2003 гг. Названия этих веществ (за исключением примесей, уже выделенных в отдельную группу) извлекали из заголовков и рефератов 10 документов, найденных для каждого из основных веществ (по одному документу в год, предоставляемому используемой поисковой программой, см. выше). Полная выборка этих рефератов в итоге включала 17x10=170 документов, которые содержали названия 396 различных веществ, совместно встречающихся с 17 основными веществами.
Частоты относительной совместной встречаемости примесей и основных веществ имели различное значение. Из 17 основных веществ выделены три, для которых средние показатели rcf примесей имели сравнительно высокое, промежуточное и низкое значение. Изучена совместная встречаемость других веществ с этими тремя соединениями не только 1994-2003 гг., но и в 1964-1993 гг., что привело еще к одной референтной группе веществ (На, 203 соединения, рис. 3).
Вычислены параметры распределений соединений по показателям встречаемости, указанные в разделе 2.5.2, а также доля совместно встречающихся соединений от общей численности той или иной группы веществ. Различные статистические расчеты также аналогичны описанным в предыдущем разделе.
Возможности использования показателей совместной встречаемости для предсказания химического состава анализируемых проб оценивали следующим образом. Данные для примесей сравнивали с группой II (и На). Показатели rcf соединений, принадлежащих этим группам, объединяли и ранжировали. В итоговом списке, первоначально состоящем из т примесей и определенного числа представителей референтной группы веществ, выделяли т наивысших значений. Это подмножество значений относительной совместной встречаемости состояло ИЗ /77high И (/77 - mhigh) чисел, связанных с примесями и "посторонними" веществами (из референтной группы) соответственно. Предсказательная способность при таком подходе к ее оценке представляет собой процент аналитов (примесей), присутствие которых в пробе основного вещества предсказано правильно, т.е. величину (100 % х тЫдЬ)1т. Вычисления доли правильно предсказанных аналитов могут быть проведены отдельно для примесей в каждом из основных веществ и для всех примесей вместе.
Предсказательная способность, оцениваемая указанным способом, представляет собой минимальное значение этой характеристики. Действительно, примеси оказываются не только в числе первых т позиций ранжированного совместного списка примесей и "посторонних" веществ, но и ниже. Поэтому, если значение /r?high устанавливать, например, при отборе не т, а 2т или Ът наивысших значений rcf, что несложно делать при практической реализации данного подхода к предсказанию состава проб, то mhigh и, следовательно, предсказательная способность окажутся выше, чем при первом способе оценки.
Пример. В невирапине обнаружено 11 примесей [120]. Информационный поиск привел к 34 веществам, которые совместно встречаются с невирапином в 10 документах, относящихся к 1994-2003 гг. (референтная группа II). Подмножество 11 высших значений rcf состояло из 5 и 6 чисел, относящихся соответственно к примесям и "кандидатам в примеси" (вещества из референтной группы). Следовательно, /п=11, mhigh=5, минимальная предсказательная способность - (100 % х 5)/11=45 %. Эта же характеристика, оцененная по 22 (2т) или 33 (3/п) позициям в перечне значений rcf, составляет 55 % и 73 % соответственно.
