Содержание к диссертации
Введение
I. Определение биологически активных соединений методом проточно инжекционного анализа 9
I. 1. Характеристика детекторов, применяемых в проточно - инжекционном анализе 9
1.2. Пьезокварцевьте иммуносенсоры для определения биологически активных соединений в жидких средах 24
II. Эксериментальная часть 34
II. 1. Характеристика объектов исследования, химических реагентов, биополимеров и иммунореагентов 34
II. 2. Установка для проточно - инжекционного анализа 39
II. 3. Пробоподготовка образцов пищевых продуктов и объектов окружающей среды 45
III. Исследование закономерностей иммунохимических реакций на поверхности пьезокварцевых иммуносенсоров 47
III. 1. Изучение взаимодействия антител с биорецепторным покрытием на основе иммунореагентов 48
III. 1. 1. Влияние способа иммобилизации на качество биорецепторного покрытия и оперативные характеристики иммуносенсора 49
III. 1.2. Влияние массы биослоя на величину аналитического сигнала 56
III. 2. Кинетические исследования иммунохимических реакций антиген-антитело .58
III. 3. Влияние концентрации иммунореагентов на полноту протекания иммунохимических реакций 64
III. 4. Исследование специфичности иммунореагентов 66
III. 5. Изучение влияния условий проточно-инжекционного анализа на величину аналитического сигнала сенсора 69
III. 5. 1. Влияние скорости, природы и рН буферного раствора носителя на величину аналитического сигнала иммуносенсора 70
III. 5. 2. Влияние природы регенерирующего раствора на воспроизводимость аналитического сигнала 73
IV. Применение пьезокбарцевых иммуносенсоров для определения биологически активных соединений в водных растворах и биологических средах 76
IV. 1. Особенности применения пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах 76
IV. 2. Методика определения сульфаметоксазола в объектах окружающей среды 84
IV. 3. Методика определения сульфаметоксазола в пищевых продуктах 86
IV. 4. Методика определения сульфаметоксазола в фармацевтических формах 89
Выводы 91
Литература 93
Приложение 121
- Пьезокварцевьте иммуносенсоры для определения биологически активных соединений в жидких средах
- Установка для проточно - инжекционного анализа
- Кинетические исследования иммунохимических реакций антиген-антитело
- Влияние скорости, природы и рН буферного раствора носителя на величину аналитического сигнала иммуносенсора
Введение к работе
Актуальность. Последнее десятилетие характеризуется интенсивным развитием сенсорных технологий, ориентированных на создание аналитических устройств, позволяющих получать информацию о свойствах и составе различных сред в форме электрического сигнала, Пьезокварцевые химические сенсоры, широко применяющиеся для диагностики газовых (реже жидких) сред, характеризуются невысокой селективностью, поскольку аналитический сигнал формируется за счет приращения массы покрытия, нанесенного на электродах, вследствие сорбции определяемого компонента.
Применение в качестве рецепторных покрытий высокоспецифичных иммунореаген-тов позволяет проводить прямое, без введения дополнительных меток (ферментативные, флуоресцентные, радиоактивные), определение высоко- и низкомолекулярных соединений в жидких средах. Пьезокварцевые иммуносенсоры положительно зарекомендовали себя при селективном определении следовых концентраций биологически активных соединений в водных растворах, пищевых продуктах и биологических средах, и поэтому исследованию таких сенсоров в настоящее время уделяется повышенное внимание.
Широкое использование противомикробных препаратов (сульфаниламиды, салицила-ты) для лечения и профилактики заболеваний людей и животных стимулирует разработку новых экспрессных, чувствительных методик их определения в различных объектах в присутствии большого количества сопутствующих соединений. Поэтому весьма перспективным является исследование возможностей иммуносенсоров, сочетающих принципы иммуноана-лиза с пьезокварцевым методом преобразования аналитического сигнала, как детекторов в проточно-инжекшюнном анализе жидких сред при определении сульфаниламидов и с&чици-латов.
Цель работы. Разработка высокочувствительных и селективных пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного определения следовых концентраций ряда биологически активных соединений в жидких средах.
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
исследование закономерностей иммунохимической реакции антиген-антитело, протекающей на поверхности сенсоров, предназначенных для определения сульфопрепаратов и са-лицилатов в жидких средах;
исследование способов иммобилизации галтен - белковых коньюгатов;
- кинетическое исследование гетерогенных имммииАимм'щкцх реакций;
СПетер; 09
- оценка специфичности применяемых иммунорі агентовиел ИОТЕКА
- изучение влияния режима проточно-инжекционного анализа на величину аналитического
сигнала сенсора;
- разработка комплекса способов проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов и
салицилатов с применением пьезокварцевых иммуносенсоров.
Научная новизна. Показана возможность конкурентного определения сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах с применением пьезокварцевых иммуносенсоров с био-рецепторными покрытиями на основе гаптен-белковых конъюгатов. Впервые методом пьезо-кварцевого микровзвешивания изучены закономерности гетерогенной иммунохимической реакции между сульфаметоксазол (4-аминосалициловая кислота)-белковым конъюгатом и специфичными антителами. Выявлены условия, способствующие наиболее полному протеканию реакции как в прямом, так и в обратном направлениях. Рассчитаны константы образования (Кс,) гетерогенных иммунокомплексов, полученных при взаимодействии 4-аминосалициловой кислоты и сульфаметоксазола, конъюгированных с белковыми молекулами, с соответствующими поликлональными антителами. Показана взаимосвязь величины Ксв с пределом обнаружения сульфаметоксазола с помощью пьезокварцевого иммуносенсо-ра. Обоснованы требования к биорецепторным покрытиям (масса, толщина слоя, прочность закрепления иммунореагентов на металлической поверхности электродов), обеспечивающим многократное применение иммуносенсоров для определения сульфаметоксазола и салициловой кислоты в широком диапазоне концентраций. Оценена специфичность поликлональных антител по отношению к сульфопрепаратами и салипилатами, рассчитаны коэффициенты перекрестного взаимодействия. Изучено влияние режима проточно-инжекционного анализа на величину аналитического сигнала сенсора и определены оптимальные параметры (скорость потока, природа и рН раствора носителя, природа и концентрация регенерирующего раствора), обеспечивающие высокую чувствительность определения биологически активных веществ.
Практическая значимость. Предложены новые эффективные биорецепторные покрытия пьезокварцевых иммуносенсоров для определения микроколичеств сульфопрепаратов и салицилатов в жидких средах. Предложен алгоритм выполнения проточно-инжекционного анализа жидких сред, включающий регистрацию аналитического сигнала сенсора и регенерацию его биорецепторного покрытия.
Разработаны высокочувствительные и селективные методики проточно-инжекционного определения остаточных количеств сульфаметоксазола, сульфаметазина, сульфаметазина гемисукцината, белого стрептоцида и салициловой кислоты в водных рас-
творах; сульфаметоксазола в объектах окружающей среды (почва, природные воды), пищевых продуктах (мясо, яйца, молоко), фармацевтических препаратах.
Методика определения сульфаметоксазола внедрена в лабораторный практикум спецкурса «Химические и биосенсоры». По материалам разработок подана заявка (№ 2004122302/28(023824)) на предполагаемое изобретение и получено положительное решение на выдачу патента.
На зашиту выносятся:
результаты сравнительного изучения способов иммобилизации гаптен-белковых конъю-гатов на поверхности металлических электродов пьезокварцевых резонаторов с учетом оптимального сочетания массы и толщины покрытия, стабильности сигнала, чувствительности определения биологически активных соединений;
результаты изучения закономерностей иммунохимических реакций сульфопрепаратов или салицилатов со специфичными антителами;
константы скорости образования и разрушения иммунокомплексов, величины констант связывания иммунореагентов;
коэффициенты перекрестного взаимодействия антител к сульфаметоксазолу и 4-аминосалициловой кислоте с собственными иммуногенами и их структурными аналогами;
оптимальные значения скорости потока, рН и природы раствора носителя, концентрации и природы регенерирующего раствора, обеспечивающие максимальную величину аналитического сигнала иммуносенсора;
алгоритм выполнения проточно-инжекционного определения сульфопрепаратов (суль-фаметоксазол, сульфаметазин, сульфаметазин гемисукцинат, белый стрептоцид) и салициловой кислоты в жидких средах с применением пьезокварцевых имму носенсоров;
методики проточно-инжекционного определения следовых концентраций сульфаметоксазола, сульфаметазина, сульфаметазина гемисукцината, белого стрептоцида и салициловой кислоты в водных растворах; сульфаметоксазола в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и фармацевтических препаратах.
АпрЫйщия работы. Основные результаты диссертации доложены на конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Актуальные проблемы современного естествознания» (Иваново, 2003); ХП научно - практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Наша общая окружающая среда» (Липецк, 2003); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды с международным участием «Экоаналитика - 2003»
(Санкт - Петербург, 2003); I Региональной научной конференции «Химико-экологические проблемы Центрального региона России» (Орел, 2003); Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Москва, 2004), XTV Областной научно-технической конференции (Липецк, 2005), П Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005), III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 3 статьях, 10 тезисах докладов.
Структура работы. Диссертационная работа изложена 125 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок и 15 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего 256 ссылок на отечественные и зарубежные работы.
Работа выполнялась при финансовой поддержке программ Минобрнауки РФ: «Развитие научного потенциала высшей школы» (тема № 01970006723 «Пьезокварцевые проточные иммуносенсоры: новые возможности для определения физиологически активных веществ»), темплана (тема «Физико-химические основы формирования и функционирования биосенсорных систем для определения физиологически активных веществ») и гранта для поддержки научно - исследовательской работы аспирантов вузов (тема -935 «Исследование условий формирования аналитического сигнала проточного пьезокварцевого им-муносенсора при определении сульфопрепаратов в жидких средах»).
Пьезокварцевьте иммуносенсоры для определения биологически активных соединений в жидких средах
Одними из наиболее чувствительных и селективных детекторов, применяемых в проточно-инжекционном анализе, являются гравиметрические иммуносенсоры, работающие на принципе пьезокварцевого микровзвешивания. В последнее время с их помощью удается выявить содержание биологически активных соединений в пробе на уровне нанограммов и даже пикограммов. Пьезокварцевые иммуносенсоры состоят из физического преобразователя и биорецепторного покрытия на основе иммунореагентов. В качестве преобразователя наиболее часто используют резонатор АТ-среза с собственной частотой колебаний 8-20 МГц [118], в центре кристаллической пластины которого закреплены металлические электроды [115, 171]. Известно применение резонаторов с более высокими частотными характеристиками - 30, 70 и даже 110 МГц [181-182], однако при этом обычно отмечают более высокий уровень "шума 1, поэтому они применяются редко. Формирование на поверхности электрода преобразователя покрытия, содержащего комплементарные к определяемому антигену биомолекулы (ДНК [171, 183], ферменты [56, 184 - 186], антитела [184, 187- 189], бактерии, вирусы, аналит-белковые конъюгаты [190] и т. д.), способствует увеличению селективности анализа жидких проб. Особый интерес представляют покрытия на основе иммунореагентов, высокая специфичность которых позволяет селективно, без предварительной пробоподготовки, осуществлять прямое определение следовых концентраций биологически активных веществ в сложных по составу смесях.
Аналитический сигнал пьезокварцевого иммуносенсора формируется в результате протекания на поверхности его электрода высокоспецифичной иммуно-химической реакции антиген-антитело, при этом образующийся гетерогенный иммунокомплекс увеличивает массу биорецепторного покрытия и вызывает изменение частоты колебаний сенсора [191].
В основе иммунохимического взаимодействия [192] лежит структурное сходство Fab-фрагментов антител с многочисленными детерминантами специфи ческого антигена, в роли которого выступает макромолекула или низкомолекулярное соединение, конъюгированное с белком. Как правило, в иммунном анализе наиболее предпочтительно применение моноклинальных антител, имеющих один тип распознающих центров, комплементарных детерминантам антигена. Однако они дорогостоящи, поэтому более доступными и распространенными в аналитической практике являются поликлональные антисыворотки [193-195], содержащие смесь антител, характеризующихся сродством к различным типам детерминант антигена. Их применение в иммунохимическом анализе предполагает изучение перекрестных взаимодействий смеси антител со структурными аналогами определяемого соединения, что позволяет создавать аналитические устройства для селективного определения ряда родственных соединений в отсутствие или присутствии собственного иммуногена.
Ранние попытки применения пьезокварцевых сенсоров в проточном анализе были неудачны, так как при погружении в жидкую среду резонатор прекращал осциллировать [173]. Поэтому измерения с помощью пьезокварцевых иммуносен-соров часто проводят на воздухе в режиме «обмакнуть и высушить» («dip and dry»). В этом случае сенсор погружают в анализируемый раствор и оценивают приращение массы сорбированного аналита после высушивания датчика на воздухе [174]. Для снижения влияния неспецифических взаимодействий, вызванных сорбцией матричных компонентов пробы, используют систему из двух пьезокварцевых сенсоров [118, 196]. На поверхности индикаторного сенсора иммобилизуют комплементарные биорецепторы (антигены, антитела, гаптен-белковые конъюгаты), а на поверхности сенсора сравнения - макромолекулы с предварительно заблокированными активными центрами. В этом случае определение биологически активных соединений осуществляется по прямому приращению массы на поверхности электрода сенсора: варьируя время экспонирования иммуносен-сора в анализируемом растворе, можно существенно расширить диапазон определяемых концентраций. Однако этот способ анализа требует многократного промывания сенсора с последующим высушиванием его до постоянной массы после проведения отдельных стадий определения, что предъявляет высокие требования к прочности иммобилизации биорецепторного покрытия [196].
Впоследствии было установлено, что основным условием функционирования пьезокварцевых иммуносенсоров в проточно-инжекционной системе является контакт только одной стороны иммуносенсора с потоком раствора-носителя [197]. Преимуществом такого способа анализа является возможность осуществления в одном измерительном цикле не только регистрации аналитического сигнала сенсора, но и регенерации биорецепторного покрытия, что значительно сокращает время определения и делает его привлекательным для проведения рутинных анализов.Большое значение при использовании проточных пьезокварцевых иммуносенсоров играет форма и конструкция проточной ячейки, поскольку оказываемое на сенсор давление потока жидкости, влияние флуктуации и завихрений или появление пузырьков воздуха на поверхности сенсора искажает аналитический сигнал. Поэтому предложено большое количество проточных ячеек оригинальных конструкций [115, 121, 126, 198-201], объемом 35-100 мкл [189,202,203]. Наиболее часто применяют горизонтальные ячейки, состоящие из двух пластин, между которыми зажимают кварцевую пластину резонатора [27, 121, 198]. При такой конструкции проточной ячейки пузырьки воздуха, попадающие в систему, скапливаются в верхней ее части и не искажают показания иммуносенсора.
В работе [204] была предложена вертикальная конструкция ячейки, сни-лсающая давление потока жидкости на поверхность массочувствительного сенсора и образование на нем пузырьков воздуха. Однако наиболее широкое распространение на практике получили ячейки с горизонтальным расположением сенсора - поступление анализируемого раствора направляется на центральную, наиболее чувствительную часть электрода [173].Подача жидкости в установку для проточно-инжекционного анализа наиболее часто производится поршневым насосом [121, 205, 206], а объем анализируемой пробы отмеряется с помощью петлевых дозаторов. Несмотря на то, что обычно в ПИА проводят нагнетание и продавливание раствора-носителя через ячейку детектирования [115, 121, 126, 199, 200], такой принцип подачи раствора в систему с пьезокварцевым сенсором нерационален вследствие пульсации и увеличения давления жидкости на поверхность пьезокварцевого иммуносенсора. Гораздо чаще насос располагают после ячейки детектирования [6, 121, 172, 197, 201, 202, 207 -209] и пропускание раствора через нее осуществляют путем создания небольшого разрежения в системе, при этом регистрируется более стабильный и высокий аналитический сигнал.
Для стабилизации частоты колебаний сенсора применяют генераторный метод, при этом аналитический сигнал (Af) обычно регистрируют с помощью частотомера или компьютера [13, 56-61, 106-121, 171]. Проведение измерений аналитического сигнала относительно базовой частоты колебаний сенсора позволяет нивелировать влияние фона. Зависимость аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора от изменений массы биорецепторного покрытия (Лт), сформированного на поверхности его электрода, описывается эмпирическим уравнением Зауэрбрея [210]:где к - коэффициент пропорциональности, зависящий от природы резонатора.
Несмотря на то, что это уравнение корректно выполняется только в газовых средах, лнейная зависимость Af от Am при определенных условиях сохраняется и в жидкостях.Оперативные характеристики пьезокварцевых иммуносенсоров во многом определяются прочностью и характером закрепления иммунореагентов на поверхности его электродов. Так как универсальные способы иммобилизации отсутствуют, то выбор методики иммобилизации биомолекул обусловлен свойствами анализируемых соединений, требованиями к метрологическим параметрам анализа и техническими возможностями. Обычно для закрепления биомолекул на поверхности электродов сенсоров используют физическую сорбцию [106, 177, 209, 211], кросс-сшивку или включение в состав полимера [61, 111, 209, 211, 212], ко
Установка для проточно - инжекционного анализа
Исследования проводили на оригинальной лабораторной установке, изготовленной на кафедре химии Липецкого государственного технического университета (рис. 1). Она включала дозатор для ввода анализируемого раствора (1); проточную ячейку детектирования (2), в которой с помощью мягких силиконовых прокладок закрепляли пьезокварцевый иммуносенсор, подключенный к частотному генератору колебаний (IC74LS320) на базе элементов транзисторно-транзисторной логики (3); перистальтический насос (4), обеспечивающий заданную скорость потока раствора носителя (20-120 мкл/мин); цифровой частотомер или персональный компьютер (5), регистрирующий изменение частоты колебаний резонатора во времени при протекании гетерогенной иммунохимической реакции. Все узлы установки соединены силиконовыми шлангами с внутренним диаметром 0,5 мм. Измерения проводили при температуре 25±5 С. Проточная ячейка детектирования (рис. 2) объемом 15-20 мкл представляет собой две пластины из органического стекла толщиной 10-15 мм, соединяющиеся друг с другом при помощи винтов. В одной из пластин под углом ( 60) располагаются два сквозных отверстия, в которых размещены иглы со сточенными концами, обеспечивающие поступление пробы в центр модифицированного электрода иммуносенсора, где массочувствительность максимальна. В специаль ных углублениях на обеих пластинах расположены мягкие силиконовые прокладки для герметичного закрепления иммуносенсора в ячейке. В целом конструкция проточной ячейки обеспечивает выполнение основного условия функционирования пьезокварцевого иммуносенсора в жидких средах, а именно контакт только одной его стороны с анализируемым раствором.
В качестве физического преобразователя использовали устройства объемных акустических волн - пьезокварцевые резонаторы АТ-среза (рис. 3) с собственной частотой колебаний 10 МГц ± 1 Гц с золотыми или серебряными электродами (диаметр 8 мм), полученными магнетронным напылением серебра или золота (ЗАО «ЭТНА», ОАО «Квант», Россия). Рис. 3. Пьезокварцевый резонатор АТ-среза: 1 - шлифованная пластина из а-кварца, срезанная под углом 35 15 [251]; 2 - металлический электрод; 3 - выводящие контакты. На поверхности электрода сенсора формировали биорецепторное покрытие на основе иммунореагентов (рис. 4), при этом массу биослоя контролировали методом микровзвешивания. Иммобилизацию гаптен-белковых конъюгатов осуществляли на очищенной поверхности серебряных и (или) золотых электродов сенсоров в несколько стадий: модификация поверхности, активация ее функциональных групп и закрепление рецепторных белковых молекул. При этом применялись следующие способы: Способ 1. На выдержанную в течение 10 мин в кипящей системе, содержащей равные объемные соотношения растворов 0,02 мМ NH4OH и 0,03 мМ Н202, поверхность золотого электрода резонатора последовательно наносили 10 мкл 0,05%-го раствора конъюгата, 10 мкл ацетатного буферного раствора (рН 5,6) и оставляли во влажной камере на 10 - 12 часов при + 4 С. Способ 2.
Резонатор с золотыми электродами погружали на 10 мин в кипящую смесь, содержащую равные объемы растворов 0,02 мМ NH4OH и 0,03 мМ Н2С 2. На очищенную поверхность электрода последовательно наносили 10 мкл раствора конконавалина с концентрацией 10 мг/мл, 10 мкл ацетатного буферного раствора (рН 5,6) и выдерживали в течение 2 ч при температуре 22-23 С. Затем сенсор промывали в буферном растворе, прибавляли 10 мкл 0,05%-го раствора сульфаметоксазол-белкового конъюгата и помещали во влажную камеру на 10-12 часов при + 4С. Способ 3. На поверхность золотого электрода, обработанного аналогично способу 2, последовательно наносили 10 мкл раствора конконавалина А с концентрацией 10 мг/мл, 10 мкл ацетатного буферного раствора (рН 5,6) и выдерживали в течение 2 ч при температуре 22 - 23 С. Затем резонатор промывали в буферном растворе и прибавляли 15 мкл 2%-го раствора EDAC в ацетонитриле, спустя 15 — 20 миы сенсор осторожно промывали в буферном растворе, и на подложку наносили 10 мкл 0,05%-го раствора сульфаметоксазол - белкового конъюгата. Иммуносенсор помещали во влажную камеру на 10-12 часов при + 4 С. Способ 4. Аналогичен способу 3, вместо EDAC использовали 2,5%-й свежеприготовленный раствор GA, 15 мкл которого помещали на сформированную подложку и выдерживали 15-20 мин при комнатной температуре. Способ 5. Иммобилизацию проводили на обезжиренных ацетоном серебряных и золотых электродах аналогично способу 3. В качестве кросс — реагента применяли 2%-й раствор DCC в абсолютированном этиловом спирте, 15 мкл которого наносили на сформированную подложку и выдерживали 20 -30 мин при комнатной температуре. Способ 6. На поверхность Ag-электрода, обезжиренного ацетоном, наносили 1 мкл 50%-го раствора тетраэтоксисилана, выдерживали в течение 8 ч в биди-стиллированной воде; добавляли 15 мкл 2,5%-го свежеприготовленного раствора глутарового альдегида, спустя 15 - 20 мин сенсор осторожно промывали в буфер
Кинетические исследования иммунохимических реакций антиген-антитело
Для оценки связывания низкомолекулярных соединений, иммобилизованных в виде гаптен-белковых конъюгатов на поверхности электродов сенсора, с соответствующими антителами использовались растворы антисывороток различных концентраций. Иммунохимическая реакция имеет обратимый характер и может быть представлена в виде уравнения: где А - антитело; В - антиген (гаптен); АВ - иммунокомплекс. При этом следует отметить, что угловой коэффициент зависимости а равен к0-с + кр, а константа уравнения b соответствует k0 fm с. Для установления к„ и кр по методу Скетчарда экспериментальные и расчетные величины представляли в виде графиков кинетической зависимости измене ния частоты колебания сенсора и зависимости скорости реакции от частоты коле бания сенсора. Скорость иммунохимического взаимодействия иммобилизованных гаптен белковых конъюгатов со специфичными антителами фиксированной концентра ции в отдельные промежутки времени устанавливали графически по тангенсу уг -+ ла наклона касательной, проведенной к кинетической зависимости в начальный момент времени (рис. 6а, 7а). Полученные значения скорости использовали при построении графика в координатах Скетчарда (-df/dt от f, рис. 66, 76). Зависимость скорости иммунохими-ческой реакции от частоты колебаний сенсора имеет линейный характер. По значениям углового коэффициента а (уравнение 4) и отрезку, отсекаемому на оси ординат Ь, рассчитывали константы скорости ко, кр и КСв значения которых для иммунохимических реакций 4-аминосалициловой кислоты, сульфаметоксазола, сульфаниламида с гомологичными антисыворотками приведены в табл. 8. Рис. 6.
Установление констант связывания для реакций взаимодействия конъюга-та Kill с антителами R1 с концентрацией 1000 нг/мл (1), 400 нг/мл (2), 100 нг/мл (3): а)кинетическая зависимость изменения аналитического сигнал сенсора; 6) зависимость скорости иммунохимической реакции от частоты колебания сенсора. Следует отметить, что в случае детектирования сульфопрепаратов определяющую роль при аффинном взаимодействии играет природа линкера, а при определении салицилатов - белковой составляющей конъюгатов. Рис. 7. Установление констант связывания для реакций взаимодействия конъюга-та KIV с антителами R3 с концентрацией 20 нг/мл (1), 50 нг/мл (2), 100 нг/мл (3): а) кинетическая зависимость изменения аналитического сигнал сенсора; б) зависимость скорости иммунохимической реакции от частоты колебания сенсора. Минимальная частота колебаний пьезокварцевого иммуносенсора (fp), достигаемая при установлении химического равновесия, соответствует: Несмотря на то, что при осуществлении измерений в проточном режиме достичь значения fp не удается, оно может быть полезно при оптимизации условий эксперимента - выборе скорости потока раствора - носителя, температуры, природы, концентрации и рН буферного физиологического раствора. Константа связывания, характеризующая чувствительность сенсорного покрытия, позволяет выбрать оптимальные концентрации иммунореагентов для максимального приближения аналитического сигнала сенсора к fp. Значения fp для систем сульфаметоксазол - антитело и 4 - аминосалициловая кислота - антитело приведены в табл. 9.
Следует отметить, что константа связывания может быть использована для прогнозирования предела обнаружения биологически активных соединений. За висимость предела обнаружения сульфаметоксазола и салициловой кислоты от величины Ксв представлена на рис. 8. Как видно из приведенного графика, для определения сульфопрепаратов с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров на уровне 0,2 нг/мл и ниже используются комплементарные пары с константой связывания выше 108 - 109 М"1, в случае применения Ксв на порядок ниже ПрО составляет 0,3 - 0,5 нг/мл, а если Ксв менее 106 М"1, то ПрО составляет 0,6 - 1 нг/мл и выше. Наименьшее значение ПрО для определения с помощью пьезокварцевого иммуносенсора сульфаметоксазола и салициловой кислоты в жидких средах наблюдается при применении комплементарных пар с величиной константы связывания 148-107 М"1 и 501-107 М"1. Таким образом, значение Ксв характеризует не только прочность образуемого гетерогенного комплекса, но также может быть использована в аналитической практике для снижения предела обнаружения биологически активных соединений с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров. Для получения максимального аналитического сигнала иммуносенсора необходимо предварительно осуществлять выбор концентрации гаптен-белковых конъюгатов, иммобилизуемых на поверхности электрода сенсора, и антител, вводимых в пробу при проведении конкурентного анализа. Поскольку с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров невозможно проводить определение низкомолекулярных соединений по прямому приращению массы биорецепторного покрытия, детектирование таких веществ проводят в конкурентном режиме.
Для этого в анализируемую пробу, содержащую определяемый антиген, вводят фиксированное количество антител. При контакте полученной пробы с биорецепторным слоем непрореагировавшие антитела взаимодействуют с иммобилизованными на поверхности электрода сенсора гаптен-белковыми конъюгатами с образованием иммунокомплекса антитело-антиген, при этом аналитический сигнал обратно пропорционален концентрации анализируемого соединения в пробе. При выборе концентрации гаптен-белковых конъюгатов исходили из возможности получения большого количества активных центров на поверхности электрода иммуносенсора. Изучена зависимость величины Af сенсора от концентрации гаптен-белкового конъюгата (0,25 мкг/мл - 1 мкг/мл) при прямом взаимодействии со специфичными антителами в анализируемой пробе. Наибольший аналитический сигнал получен в случае применения конъюгата с концентрацией 0,5 мкг/мл. В области меньших и больших концентраций конъюгата отмечено снижение сигнала сенсора вследствие недостаточной удельной концентрации активных центров или их стерической недоступности. Для выбора концентрации специфичных антител экспериментально получены графические зависимости величины аналитического сигнала сенсора от концентрации антител (рис. 9).
Влияние скорости, природы и рН буферного раствора носителя на величину аналитического сигнала иммуносенсора
Зависимость аналитического сигнала сенсора от скорости потока носителя (рис. 13) показала, что наибольшее значение Af наблюдается при пропускании через ячейку анализируемой пробы со скоростью 60 мкл/мин. Детектирование биологически активных соединений при более высоких скоростях потока раствора носителя сужает диапазон определяемых концентраций, так как антитела не успевают связаться с рецепторными молекулами, закрепленным на поверхности им-муносенсора.
В случае использования более низких скоростей потока величина аналитического сигнала не снижается, однако увеличивается время анализа. Известно, что наиболее эффективно иммунохимические реакции протекают при рН 6,0-8,5 [256], поэтому нами рассмотрено влияние на величину аналитического сигнала сенсора рН, природы и концентрации буферных растворов. Были исследованы следующие буферные системы: NaH2P04 - Na2HP04 (I), КН2Р04 -Na2HP04 (II), С6Н807 - Na2HP04 (III), NaOH - KH2P04 (IV). Как видно из рис. 14, 15, проведение измерений в слабокислых средах в буферных растворах I и IV приводит к получению максимального значения аналитического отклика. Значение Af сенсора для буферной системы Ш минимально в кислой среде и возрастает с увеличением рН. Варьируя величины рН для буферных систем I и IV установлено (рис. 15), что в буферном растворе NaOH - КН2Р04 Af изменяется незначительно в интервале рН 6,0 — 7,2. Рис. 14. Влияние природы раствора носителя (рН 6,0 -6,1) на величину аналитического сигнала иммуносенсора: I - NaH2P04 - Na2HP04, II - КН2РО4 - Na2HP04, III - CeHgO? - Na2HP04, IV - NaOH - КН2Р04. Концентрация сульфаметоксазола -10 нг/мл. Напротив, в системе I при тех же значениях рН аналитический сигнал снижается практически в четыре раза. Однако буферная система I все же более предпочтительна для анализа, поскольку при пропускании через ячейку детектирования раствора, не содержащего определяемого соединения (при фиксированном значении рН), наблюдается практически постоянное значение базового сигнала сенсора (рис. 16), что существенно повышает воспроизводимость результатов определения и точность измерения аналитического сигнала. Поэтому в качестве носителя применялся буферный раствор на основе NaH2P04 - Na2HP04 с рН 6,0. Рис. 15.
Влияние рН буферных растворов носителей a) NaOH - КН2РО4, б) NaH2P04 - Na2HP04 на величину аналитического сигнала иммуносенсора при определении сульфаметоксазола (с = 10 нг/мл). Рис. 16. Влияние рН и природы буферного раствора носителя на изменение базовой частоты колебаний иммуносенсора: I - NaH2P04 - Na2HP04, II - КН2Р04 -Na2HP04, III - С6Н807 - Na2HP04, IV - NaOH - КН2Р04. Таким образом, проведение иммунохимической реакции антиген-антитело в фосфатном буферном растворе с рН 6,0 (скорость 60 мкл/мин), повышает чувствительность и стабильность работы пьезокварцевого иммуносенсора в проточно-инжекционном режиме, поскольку в этих условиях белковые молекулы имеют наиболее реакционноспособную стерическую структуру и взаимодействие антител с активными центрами на поверхности биорецепторного покрытия протекает максимально полно за короткий промежуток времени. Для обоснования условий разрушения гетерогенного иммунокомплекса антиген-антитело и восстановления активности центров связывания биорецепторного покрытия необходимо изучение условий протекания обратной иммунохимической реакции. Ускорить протекание такой реакции возможно путем введения в реакционную зону веществ, ускоряющих процесс регенерации биослоя. При этом необходимо учитывать, что наряду с диссоциацией иммунокомплекса антиген-антитело может происходить частичная или полная деструкция подложки биорецепторного покрытия, что недопустимо, поскольку аналитического сигнала сенсора определяется массой биослоя. Выбор природы и концентрации регенерирующего раствора выполняли с учетом двух противоположно влияющих факторов продолжительности процесса регенерации и стабильности массы покрытия.
В качестве регенерирующих изучены 4-Ю - 3 М растворы тиоционата калия и 8 М раствор тиомочевины. При применении мочевины для разрушения иммунокомплекса сульфаметоксазол-антитело и 4-аминосалициловая кислота-антитело происходит сначала дополнительное падение частоты сенсора, что искажает точность фиксирования аналитического сигнала и снижает надежность определения сульфаметоксазола. Регенерация биорецепторного покрытия 0,04 - 0,06 10"4 М растворами KCNS (рис. 17) не приводит к дополнительному разрушению подложки, способствует восстановле
