Содержание к диссертации
Введение
2. Способы идентификации органических соединений хроматографическими методами 11
2.1. Хроматографические параметры удерживания 16
2.1.1. Абсолютные параметры удерживания 16
2.1.2. Относительные параметры удерживания 16
2.1.3. Индексы удерживания 18
2.2. Зависимости параметров удерживания от физико-химических констант анализируемых соединений и возможности их использования для идентификации органических соединений 27
2.3. Дополнительные критерии идентификации, используемые в газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии 33
2.4. Некоторые способы идентификации различных природных соединений в обращенно-фазовой ВЭЖХ 35
3. Экспериментальная часть 46
3.1. Характеристика аналитического оборудования и условия элюирования 46
3.2. Газохроматографический анализ модельных смесей 47
3.3. Анализ различных природных соединений методом ОФ ВЭЖХ 48
3.3.1. Анализ сухого экстракта Босвелии Boswellia serrata 48
3.3.2. Анализ масляного экстракта плодов лимонника Schisandra chinensis 52
3.3.3. Анализ продуктов окисления кверцетина 53
3.3.4. Анализ токотриенолов и токоферолов в природных маслах 59
3.4. Анализ модельных смесей фенола, м-крезола, рутина и кверцетина 62
3.4.1. Условия анализа модельных смесей в режимах изократического элюирования 62
3.4.2. Условия анализа четырехкомпонентной модельной смеси в режимах градиентного элюирования 62
3.5. Анализ экстрактивных веществ листьев березы 63
3.6. Анализ модельной смеси флавоноидов 64
3.7. Разделение диастереомеров и энантиомеров дигидрокверцетина икатехина 65
3.8. Методы обработки данных 74
4. Результаты и их обсуждение 76
4.1. Разработка нового способа хроматографической идентификации органических соединений в многокомпонентных смесях сложного состава 76
4.2. Теоретическое обоснование нового способа идентификации 77
4.3. Проверка нового способа идентификации в газохроматографическом анализа на примере модельных смесей...81
4.4. Проверка нового способа идентификации на примере сравнения справочных значений параметров удерживания 85
4.5. Проверка нового способа на примере реальных природных объектов в методе ОФ ВЭЖХ 87
4.5.1. Идентификация четырех босвеллиевых кислот в сухом экстракте Boswellia serrata 87
4.5.2. Идентификация соединений схизандринового ряда в масляном экстракте Schisandra chinensis 92
4.5.3. Идентификация продуктов окисления кверцетина 96
4.5.4. Идентификация токоферолов и токотриенолов в природных маслах 101
4.6. Ограничения нового способа идентификации 110
4.7. Разделение энантиомеров природных соединений на примере дигидрокверцетина и катехинов методом ОФ ВЭЖХ в условиях хиральной модификации подвижной фазы 129
4.7.1. Оптимизация условий разделения энантиомеров дигидрокверцетина и катехина в условиях динамической хиральной модификации с использованием (З-циклодекстрина 129
4.7.2. Зависимость селективности разделения энантиомеров дигидрокверцетина от температуры колонки 136
4.8. Проблема нестабильности природных соединений на примере окисления кверцетина, токотриенолов и токоферолов кислородом воздуха 141
4.9. Некоторые приемы количественного определения различных органических соединений в методах ГХ и ВЭЖХ в отсутствие образцов сравнения 144
Выводы 149
Список литературы 151
Приложение 165
- Абсолютные параметры удерживания
- Некоторые способы идентификации различных природных соединений в обращенно-фазовой ВЭЖХ
- Газохроматографический анализ модельных смесей
- Теоретическое обоснование нового способа идентификации
Введение к работе
Методы органической аналитической химии находят достаточно широкое применение в медицине, фармацевтике, пищевой промышленности и т.д. Актуальными в настоящее время являются экологический контроль (определение вредных примесей в воздухе, питьевой воде, сточных' и природных водах); контроль качества продуктов питания, алкогольных напитков, лекарственных препаратов, судебно-медицинская практика с использованием методов газовой (ГХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), капиллярного электрофореза и различных спектральных методов. В современной практике также используют гибридные методы, такие как ГХ-масс-спектрометрия, ВЭЖХ-масс-спектрометрия, ГХ-ИК-Фурье-спектроскопия, ВЭЖХ-ИК-Фурье-спектроскопия, ВЭЖХ-ПМР и диодно-матричное детектирование. Важно отметить необходимость использования надежных аналитических методов в разработке новых технологий производства продуктов питания, алкогольной промышленности, лекарственных препаратов и биологических добавок к пище.
В зависимости от конкретной проблемы, аналитические задачи можно классифицировать на подтверждающие (определение одного или нескольких соединений в смесях известного состава) и разведочные, ориентированные на исследование новых объектов. К этим задачам, в частности, можно отнести изучение выделенных из растений различных классов природных соединений с целью создания лекарственных препаратов. Действующие вещества в составе препаратов растительного происхождения представлены компонентами, как правило, нескольких классов природных
соединений, например, таких как терпеноиды, стероиды, алкалоиды, белки, аминокислоты, полисахариды, витамины (каротиноиды, соединения группы витамина Е, аскорбиновая кислота и т.д.) и так называемый Р-витаминный комплекс (флавоноиды). Для определения соединений этих классов преимущественно используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Помимо выбора оптимальных условий разделения различных соединений, одной из самых важных и трудоемких задач аналитика является идентификация соединений в многокомпонентных смесях. Для иллюстрации ее важности достаточно заметить, что неправильная интерпретация результатов влечет за собой неизбежные ошибки в количественном анализе.
В настоящее время используют большое число приемов идентификации аналитов, из которых наиболее часто применяемым и относительно доступным является способ идентификации с использованием образцов сравнения. Однако, этот метод как в рутинном анализе, так и в групповой идентификации не всегда дает однозначные ответы и требует привлечения дополнительных аналитических параметров. Наиболее сложной и актуальной проблемой является идентификация в отсутствие образцов сравнения (стандартных образцов), особенно «экзотических» природных соединений в связи с их труднодоступностью или высокой стоимостью. Решение этой задачи представляется возможным с использованием хроматографических параметров удерживания, из которых наиболее применяемыми являются относительные времена (объемы) удерживания и индексы удерживания, в совокупности с другими критериями, характеризующими свойства определяемых соединений.
Такой способ интерпретации данных включает в себя сравнение полученных параметров (в частности индексов удерживания, как наиболее воспроизводимых параметров) с табличными данными (с базами данных). В качестве дополнительных критериев можно отметить УФ-спектры (существуют атласы УФ-спектров для большого числа органических соединений), относительные оптические плотности при фиксированных длинах волн, логарифмы коэффициентов гидрофобности (log Р), коэффициенты распределения анализируемых соединений в гетерофазных системах и другие. В главе 2 (обзор литературы) рассматриваются различные способы идентификации органических соединений по литературным данным.
В ряде случаев всех известных приемов бывает недостаточно для однозначной идентификации аналитов. Таким образом, существует необходимость поиска новых способов и критериев идентификации соединений различных классов в многокомпонентных смесях методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Именно этой проблеме посвящена данная работа.
В данной работе впервые рассматривается общий алгоритм идентификации органических соединений различных классов в отсутствие образцов сравнения, который основан на сравнении экспериментальных параметров удерживания, полученных в разных условиях анализа или с литературными данными. Суть приема заключается в том, что, если число анализируемых компонентов в пробе больше или равно трем, то критериями одновременной идентификации всех компонентов могут служить высокие значения коэффициентов корреляции (г > 0,99) сравниваемых наборов данных. Этот способ может быть применен как в обращенно-фазовой ВЭЖХ,
так и в газовой хроматографии. В некоторых случаях в процессе работы становились доступными образцы сравнения и, таким образом, удалось подтвердить правильность идентификации.
Обсуждаются ограничения применения нового алгоритма идентификации, связанные с использованием разных режимов анализа и с изменением порядка элюирования соединений различных классов при изменении содержания органического компонента в подвижной фазе.
Известно, что многие органические соединения являются оптически активными. Достаточно часто биологическую активность (как в растениях, так и в организмах человека и животных) проявляет только один энантиомер. Разделение рацематов методами ГХ, ВЭЖХ и капиллярного электрофореза является одной из важных проблем в химии, имеющей непосредственное отношение к медицине. В ВЭЖХ для этих целей преимущественно используют хроматографические колонки с хиральными (оптически активными) сорбентами. Другой вариант с использованием хиральной модификации подвижной фазы (различные добавки в элюент) является более доступным, но и более сложным, чем применение хиральных колонок. С ПОМОЩЬЮ (3-циклодекстрина в качестве добавки в элюент в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ впервые были разделены энантиомеры таких природных соединений как катехин и дигидрокверцетин, которые являются основными компонентами некоторых лекарственных препаратов растительного происхождения и биологически активных добавок к пище. Была установлена температурная зависимость степени (селективности) разделения энантиомеров дигидрокверцетина. Важным
этапом этой части работы является отнесение конфигураций энантиомеров дигидрокверцетина и катехина.
Природные масла являются источниками жирорастворимых витаминов (каротиноиды - соединения группы витамина А, токотриенолы и токоферолы - витамин Е). Для определения соединений группы витамина Е в отсутствие образцов сравнения были предложены расчетные способы параметров удерживания по логарифмам коэффициентов гидрофобности (log Р). Применение нового способа идентификации (сравнение параметров удерживания токоферолов и токотриенолов, полученных в разных условиях анализа) позволило провести одновременную идентификацию шести соединений группы витамина Е. В качестве дополнительной информации для идентификации токотриенолов и токоферолов в природных маслах можно рекомендовать относительные оптические плотности при фиксированных длинах волн. Обсуждается проблема определения этих соединений в маслах, связанная с их окислением кислородом воздуха и на свету.
Проблема стабильности многих природных соединений является актуальной и связана со способами хранения природного сырья, а также технологии приготовления лекарственных форм. В данной работе на примере кверцетина было установлено, что флавоноиды, в умеренно-щелочных средах (рН~8-10) в водно-спиртовых растворах в присутствии кислорода воздуха полностью окисляются в течение 3,5 часов. Структуры продуктов окисления кверцетина были установлены с помощью методов ГХ-МС и ВЭЖХ. Идентификацию некоторых из этих соединений проводили с применением нового алгоритма
сравнения экспериментальных и литературных данных по параметрам удерживания.
Таким образом, с появлением новых более сложных аналитических задач, таких как исследование компонентного состава различных природных объектов, становится необходимым разрабатывать новые способы идентификации. Несмотря на многообразие коммерческих препаратов (образцов сравнения), они труднодоступны для многих лабораторий в связи с их высокой стоимостью или долгими сроками поставки, что ограничивает быстроту и качество работы аналитика, а также приводит к большим межлабораторным погрешностям и порой к невоспроизводимым результатам.
Разработки новых универсальных способов идентификации в отсутствие образцов сравнения позволят увеличить вероятность правильности интерпретации полученных данных.
2. СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
В данной главе рассмотрены различные способы идентификации органических соединений, применяемые в методах газовой (ГХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Поскольку газовая хроматография получила свое развитие значительно раньше, чем высокоэффективная жидкостная хроматография, то, следовательно, многие приемы идентификации органических соединений, разработанные в газовой хроматографии, впоследствии получили применение в ВЭЖХ. В общем виде хроматографическую идентификацию органических соединений проводят по параметрам удерживания (индексы удерживания, относительные времена удерживания, зависимости параметров удерживания от физико-химических констант и т.д.) в совокупности с дополнительными аналитическими параметрами [1]. Известны дополнительные способы идентификации, которые применимы только в газовой хроматографии, например по сочетаниям индексов удерживания, измеренных на фазах разной полярности. В ВЭЖХ с УФ-детектированием в качестве дополнительного критерия можно использовать относительные оптические плотности (Аотн) при разных фиксированных длинах волн. Дополнительный критерий, который успешно применим как в газовой, так и в жидкостной хроматографии - коэффициенты распределения аналитов в гетерофазных системах. Некоторые органические соединения можно идентифицировать двумя методами - ГХ и ВЭЖХ (в газохроматографическом анализе проводят предварительную дериватизацию анализируемых соединений, например, получение
силильных или метилированных производных для увеличения летучести «тяжелых» молекул).
Одной из наиболее сложных проблем любого хроматогра-фического анализа следует считать правильную структурную интерпретацию полученных результатов. Идентификация - (от лат. Identifico - отождествляю) установление тождества неизвестного химического соединения с известным путем сравнения их физических и химических свойств [2].
Хроматографическую идентификацию проводят по параметрам удерживания с использованием образцов сравнения (стандартных соединений) или табличных значений параметров удерживания (баз данных). Идентификацию можно проводить по абсолютным параметрам удерживания, которые могут являться основными и наиболее точными критериями идентификации в анализа проб с известным компонентным составом. При анализе многокомпонентных смесей с a priori неизвестным составом совпадения экспериментальных параметров удерживания с параметрами удерживания образцов сравнения недостаточно.
Принято разделять индивидуальную и групповую идентификацию. Индивидуальная идентификация представляет собой установление структуры одного или нескольких соединений в пробе. В групповой идентификации анализируемые вещества относят к определенным классам. Решение обоих задач несколько упрощается, если аналитик располагает образцами сравнения (коммерческие стандартные вещества или индивидуальные соединения, доступные для многих лабораторий). Любая информация в дополнение к хроматографическим параметрам удерживания увеличивает
надежность и однозначность результатов. В качестве дополнительной
информации могут служить совокупности данных, включающих
физико-химические константы органических соединений (температуры
кипения и плавления, молекулярные массы, плотности, растворимости,
показатели преломления, специфические реакции на функциональные
группы, коэффициенты распределения в гетерофазных системах
растворителей, УФ-характеристики и т.д.) [3-5], а также сопоставление
сигналов хроматографических детекторов различного принципа
действия (электрохимический, рефрактометрический,
флуориметрический, ультрафиолетовый) в ВЭЖХ и в газовой хроматографии (электронозахватный, термоионный и пламенно-фотометрический). Например, в работе [6] предложен способ идентификации компонентов сложных смесей углеводородов при использовании газохроматографических параметров удерживания и отношений сигналов фотоионизационного и пламенно-ионизационного детекторов. Для определения соединений группы витамина Е (токоферолов и токотриенолов) был предложен способ идентификации с использованием двойного детектирования (УФ- и флуориметрический детекторы) в качестве дополнительного критерия [7].
Широкое применение в сочетании с хроматографическими
данными имеют такие аналитические методы как УФ-
спектрофотометрия, масс-спектрометрия, ядерный магнитный
резонанс, РЖ-Фурье-спектроскопия, атомно-эмиссионная
спектроскопия, рентгеноструктурный, элементный анализ и многие другие. Указанные методы имеют ограничение - они могут быть использованы для идентификации только индивидуальных веществ, и неинформативны при анализе многокомпонентных проб. В настоящее
время актуальными являются так называемые гибридные методы, которые позволяют проводить прямую регистрацию спектров элюируемых из колонки соединений [8]. Например, сочетание газовой хроматографии и ВЭЖХ с масс-спектрометрией, дает возможность одновременной регистрации параметров удерживания и масс-спектров анализируемых соединений [9-11]. Возможности современного оборудования допускают применение двойных гибридов, например, хроматографа с ИК-Фурье-масс-спектрометрией [12]. В ВЭЖХ анализе в качестве УФ-детектора в настоящее время находит широкое применение диодная матрица [13]. С помощью диодно-матричного детектирования можно не только отнести принадлежность определенного соединения к данному пику, а также одновременно получить спектр и установить индивидуальность («чистоту») каждого пика на хроматограмме. На рис. 2.1 представлена хроматограмма (А) природного соединения кверцетина, относящегося к классу флавоноидов. Для соединений данного класса характерно два максимума поглощения в молекулярном спектре - 254 и 370 нм (Б).
:254raa,4nm(1.00)
ОН О л
25,68;
HHSt
0.0
і і і і iii її і її і її і i"i і
5.0 10.0 15.0 20.0
25.0
I ' ' min
І234ПШ 239т
500-244ПШ
-243nm
254nm
400-259.1П!
300J274nm
1 I ' 25.0
25.5
26.0
26.5
27.0
Б В
Рис. 2.1. Хроматограмма стандартного образца кверцетина (данные автора): (А) - хроматограмма кверцетина; (Б) - УФ-спектр кверцетина; (В) - индивидуальность пика (peak purity).
Таким образом, с помощью диодно-матричного детектирования можно получить информацию по параметрам удерживания (А), спектр каждого компонента на хроматограмме (Б) и определить индивидуальность каждого пика (В).
В работе [14] предложен способ идентификации различных классов органических соединений, используя совокупность данных гибридных методов ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-ПМР, ВЭЖХ-ЯМР ,3С, а также ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием. Необходимо отметить, что идентификацию органических соединений с помощью гибридных методов достаточно часто проводят по параметрам удерживания и аналитическим сигналам с использованием образцов сравнения или баз данных.
Однако, при всем многообразии методов, на сегодняшний день, не существует универсального способа идентификации органических соединений в хроматографическом анализе.
Абсолютные параметры удерживания
Время удерживания компонента tR - время от момента ввода пробы до регистрации максимума хроматографического сигнала. Объем удерживания VR - объем подвижной фазы, прошедший через хроматографическую колонку от момента ввода пробы до выхода максимальной концентрации анализируемого вещества, который зависит от скорости потока элюента: VR = tR f, где f- скорость потока подвижной фазы.
Расстояние удерживания IR - отрезок хроматограммы, соответствующий времени удерживания аналита. Численные значения относительных параметров удерживания зависят от следующих условий хроматографического анализа: состава, свойств, содержания неподвижной фазы, природы твердого носителя в газовой хроматографии; природы и состава подвижной фазы, ионной силы, рН элюента, присутствия различных добавок в элюенте в ВЭЖХ; температуры колонки и скорости подвижной фазы; методов дозирования и количества вводимой пробы, а также конструктивных особенностей аналитического оборудования как в ВЭЖХ, так и в газовой хроматографии. Идентификация по абсолютным параметрам удерживания возможна при условии проведения анализа в одинаковых режимах. Поэтому в хроматографической практике наибольшее распространение получили относительные параметры удерживания.
Величиной г характеризуется удерживание соединения (і) относительно какого-либо стандартного вещества (st), исправленный объем, время и расстояние удерживания которого может быть как больше, так и меньше параметров удерживания выбранного стандарта. В современной практике находят широкое применение относительные времена удерживания [15,16]. Удобство способа заключается в том, что в качестве стандартного соединения можно выбрать любой компонент, регистрируемый на хроматограмме. Фактор разделения или селективность используют для характеристики относительного удерживания двух соединений (1 и 2).
Более удобно и целесообразно определять параметры удерживания относительно двух стандартов, один из которых имеет меньшее, а другой большее время удерживания, чем характеризуемое соединение. Это позволяет использовать так называемые интерполяционные параметры удерживания, из которых получили наибольшее распространение индексы удерживания. Индексы удерживания Индексы удерживания, применяемые в газовой хроматографии Индексы удерживания были впервые введены в практику газохроматографического анализа Ковачем в 1958 г. Индекс Ковача характеризует удерживание вещества неподвижной фазой в изотермических условиях относительно двух реперов с числом атомов углерода z и (z + n) (n = 1,2,3,...); его рассчитывают путем линейной интерполяции логарифмов исправленных параметров удерживания, чаще всего времен удерживания.
В качестве реперов (стандартных веществ) в газовой хроматографии используют н-алканы. С целью повышения точности определения индексов удерживания в качестве реперных н-алканов следует использовать ближайшие гомологи, один из которых имеет время удерживания меньшее, чем определяемого компонента, другой -большее, т.е. при соблюдении условия: При использовании селективных детекторов вместо н-алканов можно применять другие вещества, близкие по природе к анализируемым соединениям.
Некоторые способы идентификации различных природных соединений в обращенно-фазовой ВЭЖХ
Метод ОФ ВЭЖХ является на сегодняшний день незаменимым для определения различных органических соединений природного происхождения в реальных образцах (экстрактах трав, маслах и т.д.). Некоторые классы природных соединений являются биологически активными и входят в состав разных лекарственных препаратов.
Природные соединения, структурные формулы которых приведены в таблице 2.1, анализируют преимущественно методом ОФ ВЭЖХ. Например, для разделения флавоноидов (катехины, лейкоантоцианидины, флаваноны, флаванонолы, флавоны, флавонолы, пренилированные флавоноиды) используют ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием (252-254, 368-370 нм, для пренилированных - 272-280, 340-350 нм), с применением в качестве элюента смеси метанола или ацетонитрила с водным буфером, например, фосфатным (рН 3-3,2) [52,54]. Антоцианы анализируют в ОФ ВЭЖХ с детектированием в видимой области (520 нм), в качестве подвижной фазы преимущественно используют смеси ацетонитрила с водным раствором кислоты (трифторуксусная или муравьиная), рН 1,5-2 [53].
Разделение каротиноидов можно проводить как в условиях нормально-фазовой (НФ) ВЭЖХ, так и ОФ ВЭЖХ. В условиях ОФ ВЭЖХ в качестве элюента используют смеси ацетонитрила или метанола с хлористым метиленом или этилацетатом с детектированием в видимой области (450,470 нм) [55]. Для разделения соединений группы витамина Е (токотриенолов и токоферолов) можно использовать режим НФ ВЭЖХ и ОФ ВЭЖХ. В ОФ ВЭЖХ в качестве подвижной фазы преимущественно используют метанол или ацетонитрил с добавкой хлористого метилена с УФ-детектированием (292-296 нм) [56].
Фитостерины анализируют методом ОФ ВЭЖХ с использованием УФ-детектирования (206, 210, 254 нм) и в качестве элюента - ацетонитрил [57]. По литературным данным идентификацию природных соединений преимущественно проводят по параметрам удерживания с применением образцов сравнения, а в качестве дополнительной информации можно использовать аналитические сигналы разных детекторов [52,55]. Одновременное определение каротиноидов и соединений группы витамина Е (токоферолов и токотриенолов) в плазме крови [58] проводили с использованием стандартных образцов с применением двух детекторов (УФ-диодная матрица и флуориметрический). Известно, что каротиноиды (соединения группы провитамина А) и ретинолы (соединения группы витамина А) поглощают при длинах волн детектирования 335-340, 450-475 нм, а токоферолы и токотриенолы - 292-296 нм. Применение флуориметрического детектора позволило также установить структуры соединений группы витамина Е (длина волны поглощения токотриенолов и токоферолов 296 нм и испускания - 325 нм).
Выбор длин волн может быть определен в максимумах поглощения аналитов [59], а может - по фиксированным стандартным длинам волн для различных соединений. С учетом большой ширины полос в УФ-спектрах небольшие разницы длин волн являются неинформативными. В работе [60] рекомендуют выбирать длину волны 254 нм (международный стандарт УФ-детектирования) и длину волны в области неселективного поглощения, например, 220 нм. Экспериментально установлено, что при выборе длин волн необходимо, чтобы разность соответствовала интервалу 30 ДА, 40 нм[60,61].
В практике ОФ ВЭЖХ анализа для установления структуры заместителей в молекуле используют специфические реакции по определению функциональных групп (дериватизация) с последующим хроматографированием полученных производных. С помощью аддитивных схем расчета индексов удерживания (продуктов реакции и исходных соединений) устанавливается количество предполагаемых функциональных групп.
Для определения флавоноидов используют сравнение хроматографических данных со спектрофотометрическими. Флавоноиды вступают в реакцию с хлоридом алюминия (3) с образованием комплексов, которые имеют максимум поглощения при длине волны детектирования 410 нм (водно-спиртовые растворы флавоноидов имеют два максимума при длинах волн детектирования 252-254 и 365-370 нм) [64]. Алюминиевые хелаты флавоноидов проявляют флуоресцентные свойства. Совокупность флуоресцентных, спектрофотометричеких характеристик комплексов и параметров удерживания исходных продуктов является информативной для идентификации соединений данного класса [65].
Сравнение хроматографических параметров двумя методами ОФ ВЭЖХ и ГХ позволяет для некоторых соединений проводить групповую идентификацию. Например, в работе [66] определение фитостеринов проводили двумя методами ОФ ВЭЖХ и ГХ (в ГХ предварительно были получены триметилсилильные производные анализируемых соединений) с использованием образцов сравнения.
Для идентификации различных фитостеринов в растительных маслах методом ОФ ВЭЖХ из-за ограниченного набора стандартных образцов был разработан способ с использованием значений логарифмов коэффициентов гидрофобности (коэффициенты распределения рассматриваемых соединений в системе октанол/вода log Р) [57]. Данный прием может быть использован для идентификации одной и той же группы соединений (структурных аналогов, изомеров).
В дальнейшем этот прием был применен для идентификации соединений группы витамина Е токоферолов и токотриенолов в природных маслах [56]. В данной работе с использованием параметров удерживания стандартных образцов токоферолов и значений логарифмов коэффициентов гидрофобности токоферолов и токотриенолов были рассчитаны абсолютные времена удерживания токотриенолов. Правильность идентификации впоследствии была установлена с появлением образца сравнения, с содержанием трех токотриенолов.
В работе [67] линейные зависимости факторов удерживания от логарифмов коэффициентов гидрофобности использовали для идентификации флавоноидов.
Для анализа растительных экстрактов с целью установления компонентного состава в отсутствие образцов сравнения широко применяют метод препаративной ВЭЖХ. Выделенные в процессе разделения индивидуальные соединения, можно анализировать с помощью метода ЯМР С. [68]. В работе [69] авторы предлагают проводить идентификацию гликозидов флавоноидов и антоцианов по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ с фотодиодной матрицей, ВЭЖХ МС и препаративного разделения с последующей регистрацией спектров ПМР 13С.
Таким образом, использование индексов удерживания, как наиболее воспроизводимых хроматографических параметров в сочетании с различными дополнительными критериями повышает достоверность как групповой, так и индивидуальной идентификации анализируемых соединений. Применение гибридных методов позволяет соотносить аналитические сигналы разных детекторов.
Постоянная проблема ограниченного набора или отсутствия образцов сравнения приводит к невозможности проведения одновременной идентификации нескольких соединений в сложных многокомпонентных смесях. Но также необходимо отметить, что даже наличие образцов сравнения часто не позволяет получить однозначные результаты интерпретации данных. Всех перечисленных способов на сегодняшний день недостаточно для проведения как групповой, так и индивидуальной идентификации нескольких и более соединений в многокомпонентных смесях реальных объектах. В связи с этим необходимость создания новых алгоритмов хроматографической идентификации остается актуальной.
Газохроматографический анализ модельных смесей
Анализ модельных смесей методом ГХ проводили с целью рассмотрения применения нового способа идентификации в газохроматографическом анализе. Газохроматографический анализ модельных смесей нескольких соединений различной химической природы (глава 4) проводили на хроматографе Биохром-1 с пламенно-ионизационным детектором и стеклянной капиллярной колонкой 52 м х 0.25 мм со стандартной неполярной полидиметилсилоксановой фазой OV-101 в нескольких изотермических режимах (режим I: Т = 100 С и режим И: Т = 120 С) и режимах программирования температуры (режим I: То = 40 С, со скоростью подъема температуры 4 град/мин, при Ро = 1.0 атм; режим II: То = 60 С, со скоростью подъема температуры 2 град/мин, при Р0 = 0.5 атм). Газ-носитель гелий, входное давление 1.0 атм, деление потока при вводе проб 1 : 30. Эти данные представляют собой фрагмент массива параметров удерживания, предоставленный для обсуждения научным руководителем.
Анализ различных природных соединений методом ВЭЖХ проводили для рассмотрения применения нового способа идентификации в отсутствие образцов сравнения. Анализ экстракта Босвеллии проводили с целью определения четырех босвеллиевых кислот: Р-босвеллиевой, ацетил-(3-босвеллиевой (регистрацию пиков проводили при длине волны детектирования 210 нм - в максимуме поглощения), 11-кето-Р-босвеллиевой и ацетил-11-кето-3-босвеллиевой (регистрацию пиков проводили при длинах волн детектирования 210 и 254 нм; 254 нм - максимум поглощения кислот). На первом этапе работы из-за отсутствия образцов сравнения идентификацию проводили с рассмотрением корреляции экспериментальных параметров удерживания с литературными данными. Спустя некоторое время появилась возможность провести идентификацию четырех босвеллиевых кислот с использованием их стандартных образцов, в результате которой была доказана правильность идентификации с применением нового алгоритма. Условия анализа
Точную навеску 0,1 г экстракта смешивали с 5 мл этанола, встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость анализировали на хроматографе «Beckman» в режиме градиентного элюирования смесью ацетонитрил / 0,03 % водный раствор ТФУ с линейным изменением концентрации ацетонитрила от 75 до 100% в течение 20 мин, при длинах волн детектирования 210 и 254 нм. Время анализа около 25 мин. Условия анализа были подобраны сотрудниками аналитической лаборатории «МЦ Адаптоген».
Идентификацию проводили по относительным временам удерживания и с использованием стандартных образцов четырех босвеллиевых кислот: Р-босвеллиевой (PhytoPIan, 99% CAS [631-69-6]), ацетил-р-босвеллиевой (PhytoPIan, 99% CAS [5968-70-7]), 11-кето-р-босвеллиевой (PhytoPIan, 99% С AS [17019-92-0]), ацетил-11-кето-р-босвеллиевой (PhytoPIan, 99% С AS [67416-61-9]).
Типичные хроматограммы сухого экстракта Босвелии при длинах волн детектирования 210 (А) и 254 нм (Б). Пики 1 и 2 - 11-кето-Р-босвеллиевая и ацетил-11-кето-р-босвеллиевая кислоты соответственно; пики 3 и 4 - (3-босвеллиевая и ацетил-Р-босвеллиевая кислоты, соответственно.
Хроматограммы образцов сравнения четырех босвеллиевых кислот при длинах волн детектирования 210 (А) и 254 нм (Б). Пики 1 и 2 - 11-кето-Р-босвеллиевая и ацетил-11-кето-Р-босвеллиевая кислоты соответственно; пики 3 и 4 - Р-босвеллиевая и ацетил-Р-босвеллиевая кислоты, соответственно.
Количественный анализ проводили методом внешнего стандарта с использованием стандартных образцов четырех босвеллиевых кислот. Анализ проводили с целью обнаружения и идентификации соединений схизандринового ряда. Из-за отсутствия образцов сравнения идентификацию проводили с применением нового способа сравнением экспериментальных и литературных параметров удерживания. Определение содержания соединений схизандринового ряда не проводили из-за отсутствия образцов сравнения или структурных аналогов этих соединений.
Теоретическое обоснование нового способа идентификации
Известно, что влияние температуры колонки (Т) на исправленные газохроматографические времена удерживания (tR ) может быть описано уравнением Антуана: \gt R,x=a /T+b (4.1) В изотермических режимах анализа температура является постоянной величиной, а логарифмы абсолютных времен удерживания линейно зависят от переменной ак: R,,=ax-- + b«axk + k (4.2)
Таким образом, функция, описывающая зависимость логарифмов относительных времен удерживания различных соединений в разных режимах анализа, линейна относительно значений (ах), т.е. аналогична зависимости логарифмов абсолютных времен удерживания. Следова тельно, для корреляции значений tR в неодинаковых изотермических условиях можно использовать простейшие линейные регрессионные уравнения одного и того же вида: tR (II) a tR (I) + Ь (4.5)
Поскольку соотношения (4.2-4.4) справедливы не только для изотермических условий газохроматографического разделения, но и изократических режимов элюирования в обращенно-фазовой ВЭЖХ, вывод о применимости уравнения (4.5) сохраняет свое значение и в этом случае: lg =axC+6, (4.6) где С - концентрация органического компонента подвижной фазы (в режимах изократического элюирования является постоянной величиной).
В разных режимах линейного программирования температуры в газовой хроматографии и градиентного элюирования в обращенно-фазовой ВЭЖХ связь абсолютных и относительных времен удерживания различных соединений характеризуется приближенными соотношениями вида (4.7), в которых вместо значения Т = const фигурируют переменные значения эквивалентных температур удерживания Те = Т0 + rtR/2, представляющие собой средние арифметические значения начальных температур (Т0) и температур удерживания (TR = Т0 + rtR), где г - скорость нагрева хроматографической колонки [24]: lgtR,x ax/(T0 + rtR/2) + 6 (4.7) В ВЭЖХ вместо понятия температур удерживания используют понятие средняя концентрация удерживания Суд. = Со + FtR/2, где F скорость увеличения концентрации органического компонента элюента в единицу времени: lg чи «х х (Со + FtR/2) + b (4.8) Группировка всех слагаемых содержащих времена удерживания в одной из частей уравнения приводит к линейно-логарифмическим соотношениям, послужившим основанием системы линейно-логарифмических индексов удерживания [24,26]. Таким образом, в режимах линейного программирования температуры и градиентного элюирования регрессионные уравнения, связывающие значения tR или tR,o в разных режимах, теоретически должны иметь не линейную, а линейно-логарифмическую форму: tR (II) atR (I) + MgtR (I) + c (4.9) Однако экспериментальная проверка показывает, что за относительно редкими исключениями логарифмические вклады (61g tR ) в таких условиях настолько меньше линейных (atR ), что ими можно пренебречь. Таким образом, теоретически установлена линейная корреляция времен удерживания одних и тех же соединений в разных режимах хроматографического анализа. Единственным ограничением рассматриваемого подхода представляется невозможность сопоставления данных, полученных в изотермических режимах, с данными для различных условий программирования температуры, равно как и корреляция параметров удерживания в изократических/градиентных режимах в обращенно-фазовой ВЭЖХ, поскольку в таких случаях различия между уравнениями (4.5) и (4.9) становятся более значимыми. С другой стороны, алгоритм допускает непосредственное сравнение относительных времен удерживания, рассчитанных с использованием разных реперных компонентов.
Выявленная корреляция может быть интерпретирована и другим образом. Если наборы значений tR или от„ для нескольких соединений в разных условиях хроматографического разделения характеризуются коэффициентами корреляции порядка 0.990 (для насадочных газохроматографических колонок и в обращенно-фазовой ВЭЖХ эти значения могут быть несколько ниже из-за меньшей эффективности разделения), то при наличии минимальной дополнительной информации о природе компонентов образцов соответствующие им пики можно считать относящимися к одним и тем же соединениям [70]. Это означает возможность подтверждения идентичности нескольких компонентов одновременно (не менее трех) в составе образцов сложного состава, практически не рассматривавшуюся ранее в качестве самостоятельной аналитической задачи. Ее решение представляется важным для совершенствования методов идентификации компонентов смесей в условиях не только недоступности препаратов сравнения, но и отсутствия удовлетворительного информационного обеспечения (справочных значений аналитических параметров). Если газо-хроматографические индексы удерживания на стандартных неполярных фазах систематизированы и доступны для приблизительно 26 тыс. органических соединений [71], то применение этой формы представления данных в ВЭЖХ, несмотря на отдельные успешные примеры [30], не получило должного распространения. 4.3. Проверка нового способа идентификации в газохроматографическом анализе на примере модельных смесей Использование рассматриваемого подхода к идентификации различных органических соединений может быть проиллюстрировано различными примерами. Первый из них - сопоставление абсолютных и относительных времен удерживания восьми модельных соединений в двух изотермических режимах газохроматографического анализа с использованием капиллярной колонки со стандартной неполярной фазой OV-101.
