Содержание к диссертации
Введение
1. Теория хирального капиллярного электрофореза 9
1.1. Принципы разделения энантиомеров методом капиллярного электрофореза 9
1.1.1. Основные определения 9
1.1.2. Природа энантиоселективности в капиллярном электрофорезе 12
1.1.3. Факторы, влияющие на энантиоселективность 15
1.1.4. Некоторые особенности использования заряженных хиральных селекторов 19
1.2. Хиральные селекторы 22
1.2.1. Циклодекстрины и их производные 22
1.2.1.1. Тип хирального селектора 26
1.2.1.2. Органические модификаторы фонового электролита 31
1.2.1.3. Неводный хиральный капиллярный электрофорез 32
1.2.1.4. Мицеллярная электрокинетическая хроматография 33
1.2.2. Полисахаридные хиральные селекторы 38
1.2.2.1. Нейтральные моно-, олиго- и полисахариды 38
1.2.2.2. Ионные полисахариды 43
2. Исходные вещества, аппаратура, техника эксперимента 51
2.1. Исходные реактивы и растворы 51
2.2. Хиральные селекторы 52
2.3. Аппаратура 54
2.4. Техника эксперимента 56
5.5 Некоторые общие замечания по методологии исследования энантиораспознавательной способности новых хиральных селекторов 57
3. Влияние хитозана на разделение энантиомеров кислот 58
3.1. Изучение энантиораспознавательной способности хитозана 58
3.1.1. Влияние рН фонового электролита на подвижность энантиомеров 60
3.1.2. Влияние концентрации хитозана на разделение исследуемых соединений и их энантиомеров 61
3.1.3. Некоторые возможности применения капилляра, модифицированного хитозаном 64
4. Разделение энантиомеров при использовании анионных полисахаридных хиральных селекторов 70
4.1. Исследование энантиораспознавательной способности нового хирального селектора - ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана 70
4.1.1. Влияние рН и структуры соединений на энантиораспознавательную способность АГ-(3-сульфо-3- карбокси)пропионилхитозана 72
4.1.2. Влияние состава ФЭ на энантиоразделение при использовании Л^-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана 82
4.1.3. Влияние концентрации Л^-(3-сульфо-3- 90 карбокси)пропионилхитозана на времена миграции и энантиоразделение веществ 90
4.1.4. Влияние метанола на энантиоразделение при использовании АГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана 91
4.1.5. Влияние температуры и напряжения на энантиоразделение при использовании высокомолекулярного ЛГ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана 94
4.1.6. Влияние молекулярной массы Л^-(3-сульфо-3- карбокси)пропионилхитозанов на энантиоразделение 105
4.1.7. Определение содержания и энантиомерного состава флуоксетина и пиндолола в фармацевтических препаратах 109
4.2. Использование сульфатов хитозана и декстран сульфата в качестве хиральных селекторов 112
5. Исследование энантиораспознавательной способности гептакис(6- амино-6-дезокси)-Р-циклодекстрина для разделения энантиомеров кислот и производных аминокислот 121
5.1. Разделение энантиомеров кислот при использовании гептакис(6- амино-6-дезокси)-|3-циклодекстрина 126
5.2. Разделение энантиомеров производных аминокислот 137
Выводы 148
- Хиральные селекторы
- Хиральные селекторы
- Использование сульфатов хитозана и декстран сульфата в качестве хиральных селекторов
- Разделение энантиомеров производных аминокислот
Введение к работе
Актуальность темы. Важным направлением аналитической химии являются исследования в области разделения оптических изомеров биологически активных соединений. Определение оптически активных соединений имеет принципиальное значение для органической химии, медицины, фармакологии. Благодаря исключительно высокой разделяющей способности и экспрессности разделения капиллярный электрофорез (КЭ) - один из наиболее подходящих методов для решения этой сложной задачи.
Хиральные селекторы
Циклодекстрины являются наиболее популярными хиральными селекторами в КЭ. В 1989 году Фанали впервые ввел циклодекстрины для разделения энантиомеров [13]. В настоящее время «85% хиральных разделений выполнено при использовании этих хиральных селекторов. Популярность циклодекстринов связана с широким спектром разделяемых энантиомеров, разнообразием производных (больше 50), многие из которых коммерчески доступны, их физико-химическими свойствами (растворимостью, стабильностью растворов, УФ-прозрачностью) [14,15]. Циклодекстрины образуются при разрушении крахмала под действием микроорганизмов Bacillus macerans и являются циклическими олигосахаридами, содержащими 6-12 остатков D-глюкозы, соединенных а(1- 4) гликозидными связями. В аналитической химии используются циклодекстрины, содержащие 6, 7 и 8 гликозидных остатков, называемые, соответственно, а, 3 и у-циклодекстринами. На рис. 1 представлена структура 3-ЦД, некоторые физические и химические свойства а, р и у-циклодекстринов суммированы в табл. 1. Циклодекстрины имеют форму усеченного конуса с относительно гидрофобной полостью и гидрофильным внешним окружением благодаря наличию гидроксильных групп (положения 2, 3 и 6 глюкопиранозного остатка). Относительная гидрофобность внутренней полости циклодекстринов позволяет им образовывать комплексы включения с любым органическим соединением, которое может полностью или частично (гидрофобной частью) входить в полость циклодекстрина. Механизм хирального разделения основан на возможности включения энантиомеров в полость циклодекстринов. Устойчивость комплексов включения в значительной степени определяется гидрофобностью, стерической природой разделяемых энантиомеров и хирального селектора, возможностью образования водородных связей, дипольных и электростатических взаимодействий. Очевидно, что если диаметр молекулы больше, чем полость циклодекстрина, то комплекс включения или не может быть сформирован, или формируется таким образом, что только часть молекулы энантиомера фиксируется в полости циклодекстрина. Если же размер молекулы меньше полости, то вероятность образования комплекса существует, но константа его образования много меньше, чем для молекулы, способной жестко фиксироваться в полости. Таким образом, для хирального разделения огромное значение имеют и размер, и форма молекул как хирального селектора, так и энантиомеров.
Так, например, для полости а-ЦД возможно только частичное включение молекулы бензола (ароматические кольца присутствуют практически во всех хиральных соединениях, представляющих интерес для разделения), а полость (3-ЦД достаточна для того, чтобы зафиксировать бензольное кольцо полностью (рис. 2). Заместители в орто- или .мета-положении могут ограничивать степень включения, но такие стерические ограничения могут как ухудшить, так и улучшить энантиоразделение. В целом можно сказать, что соединения с одним ароматическим кольцом, имеющим один заместитель или не имеющим заместителей, могут быть энантиоразделены при использовании а-ЦД, соединения с одним или двумя ароматическими кольцами - при использовании 3-ЦД, с одним или двумя сильно замещенными кольцами или с тремя, четырьмя кольцами - при использовании у-ЦД- Хотя полость у-ЦД слишком узкая для Для хиральных разделений используются нативные (немодифицированные), модифицированные и полимеризованные циклодекстрины. В ряду а-, р- у-ЦД наиболее подходящим для энантиоразделения является Р-ЦД, однако в целом немодифицированные циклодекстрины обладают невысокой энантиоселективностью. Для улучшения хиральной распознавательной способности гидроксильные группы циклодекстринов модифицируют для получения производных с различной степенью замещения. Модифицированные циклодекстрины заметно отличаются по свойствам от нативных (обладают повышенной растворимостью, способностью к образованию различных вторичных связей, различной гидрофобностью полости), что, как правило, улучшает селективность разделения энантиомеров. Введение нейтральных групп (метальной, гидроксипропильной, гидроксиэтильной и т.д.) «увеличивает» глубину гидрофобной полости цикл оде кстрина. Введение ионогенных групп в структуру циклодекстрина увеличивает растворимость хиральных селекторов в водных буферных растворах. Кроме этого, при использовании заряженных хиральных селекторов можно разделить энантиомеры как заряженных, так и нейтральных соединений. Необходимо отметить, что при введении в структуру циклодекстрина ионогенных групп форма молекулы может искажаться, и такая асимметрия, возможно, влияет на энантиораспознавание. Другими словами, влияние рН ФЭ на энантиоразделение при использовании заряженных циклодекстринов, связано, кроме всех прочих факторов, и с тем, что степень протонирования/депротонирования изменяет форму молекулы хирального селектора вследствие электростатического отталкивания. Успешное разделение энантиомеров при использовании циклодекстринов зависит от большого числа факторов.
На основании большого количества литературных данных можно предположить, какое влияние на энантиоселективность окажут рН, концентрация и заряд хирального селектора, эффективный заряд энантиомера, инструментальные факторы (приложенное напряжение, температура), однако такие факторы, как структура хирального селектора и различные органические модификаторы вызывают заметные, но непредсказуемые изменения. Именно эти факторы необходимо рассмотреть отдельно. 1.2.1.1. Тип хирального селектора Из нейтральных циклодекстринов наибольшее практическое значение имеют ГП-Р-ЦД и триметил-Р-ЦД (ТМ- -ЦД). В обзоре [16] представлены данные по изучению энантиоразделения 86 лекарственных препаратов при использовании ТМ-Р-ЦД, 47 из которых были успешно энантиоразделены. На основании большого количества данных установлено, что так называемая «структура 4Н», показанная на рис. 4а), имеет значительное влияние на энантиоразделение. Энантиомеры веществ, имеющих в своем составе «структуру 4Н», не только имеют большое сродство к ТМ-Р-ЦД (т.е. в присутствии хирального селектора времена миграции этих веществ значительно уменьшаются), но и с высокой вероятностью могут быть разделены при использовании ТМ-р-ЦД. Для ГП-р-ЦД также можно выделить свою «структуру 1» соединений (рис. 46)), энантиомеры которых разделяются при использовании этого хирального селектора [17]. Важно отметить, что ГП-Р-ЦД может разделять также энантиомеры веществ, не обладающих «структурой 1», например, с несколькими конденсированными кольцами (нефопам или миансерин) [17] или энантиомеры молочной кислоты, вообще не имеющей ароматического кольца [18]. В последнем случае энантиоселективность обусловлена образованием водородных связей между энантиомерами и вторичными гидроксильными группами полости ГП-Р-ЦД. Наиболее используемыми анионными хиральными селекторами являются гептакис(6-сульфо)-$-ЦД и сульфобутиловый эфир р-ЦД (СБЭ-р-ЦД). Низкие значения рКа определяют постоянный заряд этих хиральных селекторов и хорошо предсказуемое влияние рН на энантиоразделение. Анионные селекторы применяются для энантиоразделения нейтральных, кислотных и, особенно эффективно, основных веществ. Так, например, для разделения энантиомеров миансерина достаточно 40 мкМ СБЭ-Р-ЦД (это одна из наименьших концентраций хирального селектора на основе циклодекстрина, указанная в литературе, достаточная для разделения энантиомеров с Rs 1.2) [19]. Одновременное использование 5 мМ СБЭ-рМДД и 15-30 мМ ТМ-Р-ЦД позволяет получить чрезвычайно высокие значения Rs при разделении энантиомеров арилпропановых кислот (профенов): для карпрофена Rs 30.6, для фенопрофена и флурбипрофена Rs 16.3 [20]. Высокая эффективность СБЭ-3-ЦД как хирального селектора позволила впервые применить противоточную технику разделения энантиомеров [19].
Хиральные селекторы
В качестве хиральных селекторов использовали: хитозан (7 кДа, степень дезацетилирования 85%), сульфат хитозана 63 (7% S) и 100 кДа (13.5% S), декстран сульфат (ММ«500 кДа), іУ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозан (СКПХ), геятякис(6-амино-6-дезокси)-3-циклодекстрин (пер-6-амино-3-ЦД), 2- гидроксипропил-Р-циклодекстрин (ГП-Р-ЦД). Хитозан, сульфат хитозана, декстран сульфат предоставлены Центром «Биоинженерия» РАН, ГП-3-ЦД получен из Sigma, США. Новые хиральные селекторы для КЭ - СКПХ и пер-6-амино-3-ЦД -синтезированы С.А. Лопатиным (Центр «Биоинженерия» РАН). Синтез ІУ-(3-сульфо-3-карбокси)пропионил хитозана Для синтеза использовали хитозан краба ММ 7, 14, 60 и 200 кДа, степень дезацетилирования 85%. Синтез СКПХ проводили по методике [92] с некоторыми модификациями. К 10 г ацетата хитозана в 700 мл 0.2 М ацетатного буферного раствора, рН 4.8, добавляли при перемешивании 7 г малеинового ангидрида в 40 мл диоксана. Через 10 мин рН раствора доводили до значения 8.0 5 М NaOH, после чего добавляли такое же количество малеинового ангидрида. Реакционную смесь перемешивали 1 час и затем диализовали против дистиллированной воды. Отдиализованный раствор упарили до 700 мл и при перемешивании добавили 35 г дисульфита натрия. Реакцию проводили 4 часа при 45С, поддерживая рН в пределах 4.5-5.0 при использовании 0.2 М H2SO4. Полученный продукт диализовали против дистиллированной воды и лиофильно высушивали. Для определения выхода реакции достаточно определить содержание только одного элемента - серы. Как видно из результатов элементного анализа (табл. 3), содержание серы в образцах синтезированного СКПХ различной ММ хорошо соответствует вычисленному максимально возможному содержанию серы (7%). Это свидетельствует о том, что в молекуле хитозана прореагировали практически все аминогруппы. кварцевые капилляры общей длины 59.8, 51.9, 51.9 см (длина до детектора, соответственно, 51.3, 44.4, 43.4 см) с внутренним диаметром 75 мкм и внешним диаметром 375 мкм (Polymicro Technologies, Phoenix, США). Приложенное напряжение составляло ±12 кВ. Используемые длины волн спектрофотометрического детектора 200-230 нм. 1 mAU детектора соответствует 10 mV на электрофореграммах. Для введения образцов в капилляр использовали гидростатический ввод пробы (5-Ю см, 3-Ю с). Данные были записаны и обработаны при использовании программного обеспечения «Winpeak» (Eppendorf-Biotronic, Германия).
В работе использовали систему КЭ «Капель-105» (НПФ АП «Люмэкс», Санкт-Петербург, Россия) со спектрофотометрическим детектором (195-360 нм). Использовали кварцевые капилляры общей длины 60 см (длина до детектора 52 см) с внутренним диаметром 75 мкм и внешним диаметром 375 мкм, и 60 см (длина до детектора 51 см) с внутренним диаметром 50 мкм и внешним диаметром 375 мкм (Polymicro Technologies, Phoenix, США). Образцы вводили при использовании ввода давлением (30 мбар, 3-5 с). Приложенное напряжение составляло ±(12-25) кВ. Используемая длина волны спектрофотометрического детектора 200 нм. Исследования проводили при термостатировании капилляра при 20С. Данные были записаны и обработаны при использовании программного обеспечения «Мультихром» (ЗАО «Амперсенд», Москва, Россия). рН водных растворов контролировали на иономере ЭВ-74 со стеклянным и хлорид серебряным электродами. Определение динамической вязкости раствора СКПХ (200 кДа) при температурах (С): 25, 31.2, 40, 59, 64 проводили при использовании вискозиметра Уббелоде. Время истечения полимера при указанных выше температурах составляет, соответственно, (с): 128.4, 109.7, 89.0, 63.8, 59.6. Время истечения растворителя (вода) при 25С составляет 33.5 с. 2.4. Техника эксперимента ФЭ были приготовлены из буферных растворов, СКПХ, пер-6-амино-[3-ЦД или хитозан добавляли по точной навеске и затем рН доводили до нужного значения. В нескольких экспериментах точную навеску СКПХ растворяли в воде и доводили рН до 4.8 или 5.3 0.05 М NaOH. Декстран сульфат, сульфаты хитозана и ГП-(3-ЦД добавляли по точной навеске в фосфатный или ацетатный буферные растворы. ФЭ фильтровали через мембранный фильтр, размер пор 0.2 мкм. Процедура подготовки нового капилляра к работе включала в себя последовательное промывание 0.1 М раствором NaOH (20 мин), водой (10 мин) и ФЭ (1 час, для установления равновесия между поверхностью капилляра и ФЭ, содержащим полисахаридные хиральные селекторы или пер-6-амино-(3-ЦД). Перед работой ежедневно капилляр промывали 0.1 М раствором NaOH (2 мин), водой (2 мин) и ФЭ (15-20 мин), капилляр, модифицированный хитозаном, промывали ФЭ (15-20 мин). В процессе работы капилляр промывали ФЭ (2-3 мин). Пропанол-2 или вода были использованы как маркеры ЭОП. Для определения параметров разделения пробу вводили в капилляр и затем регистрировали время миграции. За результат определения времени миграции принимали среднее арифметическое трех параллельных измерений. Для оценки повторяемости и воспроизводимости времен миграции исследуемых веществ рассчитывали относительное стандартное отклонение Sr времени миграции, не превышающее, соответственно, 0.01 и 0.03. По измеренным временам миграции рассчитывали электрофоретическую подвижность {мэф\ коэффициент селективности {а), число теоретических тарелок (N), разрешение пиков (Rs): Выбор ФЭ в КЭ, в частности, в хиральном КЭ, имеет стратегическое значение для достижения успешного разделения веществ.
Главными факторами в хиральном КЭ, влияющими на энантиоселективность, являются природа хирального селектора и рН ФЭ. Эти факторы определяют процесс хирального распознавания, поскольку они влияют как на взаимодействие хирального селектора с энантиомерами, так и на подвижности всех присутствующих в ФЭ веществ. Исследование любого нового хирального селектора предполагает, прежде всего, исследование влияния и правильный выбор рН, т.е. значения рН, при котором для данного хирального селектора и данной пары энантиомеров наблюдается максимальное значение энантиоразрешения. Как правило, на основании литературных данных для исследуемых хирального селектора и энантиомеров выбирается концентрация хирального селектора, и рН ФЭ варьируется в определенном интервале при данной концентрации хирального селектора. Затем при выбранном значении рН необходимо оптимизировать концентрацию хирального селектора. Это является особенно существенным для хиральных селекторов на основе циклодекстринов, поскольку в этом случае селективность разделения проходит через максимум и может очень резко уменьшиться при изменении концентрации хирального селектора. Далее могут быть использованы органические модификаторы, ПАВы, системы из двух хиральных селекторов, что вызывает заметные, но непредсказуемые изменения в разделении энантиомеров. Природа буферного раствора, как правило, не оказывает значительного влияния на энантиоразделение. Существенным для хиральных разделений, как и для других разделений в КЭ, является хорошая буферная емкость в выбранном диапазоне рН, низкое поглощение при длине волны, используемой для детектирования и невысокая подвижность ионов буферного раствора, чтобы свести к минимуму ток, и, следовательно, выделение тепла. При использовании заряженных хиральных селекторов особенно необходимо контролировать температуру и оптимизировать приложенное напряжение, поскольку эти инструментальные факторы влияют на селективность разделения энантиомеров. Глава 3. Влияние хитозана на разделение энантиомеров кислот 3.1. Изучение энантиораспознавательной способности хитозана Хитозан, полимер 2-амино-2-дезокси-0-глюкозы, является катионным полисахаридом, структура и физико-химические превращения которого изучены достаточно хорошо [94]. Структура хитозана представлена на рис. 13.
Использование сульфатов хитозана и декстран сульфата в качестве хиральных селекторов
Для обсуждения особенностей энантиораспознавания при использовании заряженных полисахаридов, представлялось интересным исследовать энантиоселективные свойства еще двух анионных полисахаридов: сульфата хитозана и декстран сульфата. До сих пор применение сульфатов хитозана в качестве хиральных селекторов не описано в литературе. Наличие в хитозане двух типов реакционноспособных групп позволяет получать О-сульфатированные и N-сульфаминированные производные, а при условии предварительного блокирования гидроксильных или аминогрупп - избирательно замещенные производные. Распределение заместителей в цепи полимера наряду с суммарным содержанием этих групп определяет свойства синтезированных препаратов (в частности, крайне актуальную в настоящий момент антикоагулянтную активность синтезированных препаратов). Для изучения хиральных свойств были выбраны два образца СХ разных ММ: 63 и 100 кДа. Первый образец представляет собой замещенный по С-6 сульфат хитозана, второй - О, N-сульфат хитозана (по данным элементного анализа содержание серы в первом образце около 7%, во втором - 13.5%). Электрофоретические результаты, полученные при тестировании СХ, представлены в табл. 19. Выбранные условия для использования СХ ММ 63 кДа (10 мМ фосфатный буферный раствор, 1.4% СХ, рН 6.9) соответствуют условиям, в которых протонированы около 70% аминогрупп хирального селектора. Такие условия, возможно, более благоприятны для проявления энантиораспознавательной способности СХ, содержащего аминогруппы, чем более низкие значения рН, при которых взаимодействие с хиральным селектором слабее вследствие электростатического отталкивания, поскольку и в исследуемых веществах, и в хиральном селекторе присутствуют протонированные атомы азота. Поскольку СХ ММ 100 кДа образует достаточно вязкие растворы, он использован при максимально возможной концентрации 0.5%, рН 5.6. В табл. 19 приведены также времена миграции веществ в ФЭ, не содержащем хирального селектора, и, для сравнения, в ФЭ, содержащем 0.5% СКПХ (200 кДа). Таблица 19. Электрофоретические результаты, полученные при использовании сульфатов хитозана и Л -(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозана в качестве хиральных селекторов. Взаимодействие с хиральным селектором наблюдаются для обоих СХ.
Проявление ионных взаимодействий можно отметить для СХ 100 кДа. Времена миграции исследуемых соединений увеличиваются при использовании 0.5% СХ в ФЭ по сравнению с ФЭ, не содержащем СХ значительно больше, чем времена миграции маркера ЭОП (воды). Это означает, что подвижности веществ уменьшаются. Так, например, подвижность хлорциклизина в ФЭ, не содержащем хирального селектора, составляет 1.4-10"4 см2/В-с, а с СХ ММ 100 кДа - 2.5-10"5 см /В-с. Наиболее сильно с хиральным селектором взаимодействуют пиндолол, дилтиазем и доксиламин. При использовании 0.5% СКПХ взаимодействие всех веществ с хиральным селектором сильнее: все вещества мигрируют после маркера ЭОП, а энантиомеры пиндолола разделяются (Rs 0.3). При использовании СХ 63 кДа также наблюдаются ионные взаимодействия с хиральным селектором и исследуемыми соединениями. Гидроксизин, обладающий в отсутствие СХ наибольшей из исследуемых соединений подвижностью, в присутствие СХ имеет наибольшее время миграции и наименьшую подвижность. Тестирование СХ 63 кДа показывает, что наличие аминогруппы, по-видимому, не благоприятствует хиральному разделению. С другой стороны, N-сульфаминированные производные хитозана, возможно, могли бы быть эффективными хиральными селекторами, но при условии создания достаточной концентрации хирального селектора в ФЭ. Сульфат декстрана (СД) - анионный синтетический полисахарид, обладающий антикоагулянтной активностью, структура СД приведена на рис. 11. В КЭ СД в качестве хирального селектора был исследован в КЭ [81, 88], во всех исследованиях используется низкомолекулярный СД (ММ в интервале 3100-15000). В то же время энантиораспознавательная способность анионных полисахаридов, имеющих очень высокие ММ, не изучена (природные анионные полисахариды, наиболее часто используемые как хиральные селекторы, не обладают высокой ММ). Между тем, в ряде случаев нейтральные полисахариды с большей ММ обладают лучшей энантиоселективностью [75]. В связи с этим представляет интерес исследовать энантиораспознавательную способность заряженного полисахарида, обладающего достаточно большой ММ. В качестве такого полисахарида представляет интерес СД с ММ«500000. Влияние ММ СД на энантиоразделение хлорфенирамина и хлорокина, исследованное в интервале 3100-15000, показывает, что из указанного интервала ММ при концентрации 2.5 мМ только СД с ММ 8000 разделяет энантиомеры хлорфенирамина и хлорокина, а СД с ММ 15000 разделяет энантиомеры только хлорфенирамина при концентрации 1.3 мМ [81]. Эти результаты не дают однозначного ответа на вопрос, является ли ММ 8000 оптимальной для энантиоразделения при использовании СД или нужно выбирать оптимальную концентрацию хирального селектора для каждой ММ. Можно предположить, что исследование высокомолекулярного СД с ММ«500000 может внести ясность в этот вопрос. Как уже упоминалось, СД состоит из сульфатированных остатков D-глюкозы, связанных а(1-»6) связями, и, таким образом, не обладает спиральной структурой. Особенностью СД является отсутствие карбоксильных групп и практически полное отсутствие гидроксильных групп в его молекуле, что, по-видимому, сводит к минимуму вклад водородных связей в хиральное распознавание СД.
Для изучения энантиораспознавательной способности хирального селектора были протестированы основные соединения, принадлежащие к разным классам: флуоксетин, тетрагидрозолин, доксиламин, карбиноксамин, хлорфенирамин, орфенадрин, хлорциклизин, гидроксизин, дилтиазем, тербуталин, атенолол, надолол, пиндолол, толперизон, прометазин. Разделение энантиомеров получено для флуоксетина, тетрагидрозолина, доксиламина, карбиноксамина, орфенадрина и хлорфенирамина. Структуры данных соединений приведены на рис. 19,20, 37. Наиболее критическим параметром для энантиоразделения с полисахаридами является, как уже обсуждалось, рН. СД обладает собственной электрофоретической подвижностью в направлении анода, разделяемые вещества -в направлении катода, на котором, при обычной полярности электродов, находится детектор. Как уже упоминалось, ниже определенного рН (зависящего, конечно, от природы и концентрации полисахарида - обычно 2-3%) разделяемые энантиомеры не могут быть продетектированы, поскольку ЭОП недостаточно велик, и вещества переносятся хиральным селектором к аноду. На основании литературных данных известно, что при рН 5 времена миграции веществ при использовании СД, обладающего наибольшей подвижностью среди анионных полисахаридов, велики. При использовании 2% низкомолекулярного СД, рН 6, времена миграции энантиомеров хлорфенирамина составляют 8.46 и 8.51 мин при 15 кВ [81]. Поскольку вязкость высокомолекулярного СД больше вязкости низкомолекулярного, т.е. времена миграции веществ увеличиваются при прочих равных условиях, первоначальное значение рН для разделения энантиомеров хлорфенирамина (как модельного соединения) при напряжении 20 кВ было выбрано равным 5.7. Однако при этом рН энантиомеры хлорфенирамина не элюировались (табл. 20). В дальнейшем для работы было выбрано значение рН 6.8. В интервале рН«6.2-6.6 времена миграции энантиомеров хлорфенирамина больше и энантиоразделение лучше, однако возникают некоторые проблемы со стабильностью электролита. По-видимому, увеличение концентрации буферного раствора, например, до 50 мМ могло бы сделать электролит стабильным и результаты воспроизводимыми, но и увеличило бы ток (ток в используемом ФЭ около 120 мкА).
Разделение энантиомеров производных аминокислот
Определение энантиомерного состава аминокислот всегда остается актуальным для медицины, фармакологии, биологии, и этому вопросу в КЭ уделяется много внимания [120]. Обычно аминокислоты определяют в форме производных, поскольку это дает возможность увеличить энантиоселективность и чувствительность детектирования. Разделение энантиомеров КБЗ-, бензоил- и БОК-аминокислот не изучено в КЭ при использовании катионных циклодекстринов, и представляется целесообразным исследовать этот вопрос для пер-6-амино-Р-ЦД. В работе использованы КБЗ-, бензоил-, БОК- и дансил-производные аминокислот. Энантиораспознавание дансильных производных аминокислот катионными циклодекстринами уже было исследовано в нескольких работах [23, 27, 28, 112]. В данном случае необходимо отметить энантиоразделение дансил-аспарагиновой и дансил-глутаминовой кислот с ГЭА-Р-ЦД, а именно, оптимальные условия - рН 6.0, 3 мМ [23]. Принимая это во внимание, а также учитывая, что КБЗ-, бензоил-, БОК-производные представляют собой кислоты, в качестве тестового ФЭ был выбран ФЭ, содержащий 3 мМ хирального селектора, рН 5.8. Результаты представлены в табл. 25. Как известно, разделение при использовании циклодекстринов основано на образовании комплексов включения, на хиральную селективность влияют стерические факторы, возможность образования водородных связей и электростатические взаимодействия. Рассмотрим влияние природы аминокислоты и дериватизирующего агента на энантиоразделение. Как видно из табл. 25, энантиомеры всех КБЗ-производных аминокислот могут быть полностью или частично разделены при использовании пер-6-амино-[3-ЦД. Разделение энантиомеров КБЗ-производных алифатических аминокислот (метионина, аспарагина, лейцина, норлейцина, валина и аспарагиновой кислоты) достигается включением карбоксибензильной части производного в полость пер-6-амино-Р-ЦД и стабилизацией комплекса водородными связями и электростатическими взаимодействиями. Это хорошо прослеживается на примере энантиоразделения КБЗ-аспарагиновой кислоты, имеющей две карбоксильных группы, и КБЗ-аспарагина, являющийся моноамидом аспарагиновой кислоты. Можно отметить, что КБЗ-аспарагиновая кислота имеет наибольшие времена миграции среди всех производных аминокислот, что связано, по-видимому, с более сильными электростатическими взаимодействиями. Однако влияние природы аминокислоты на энантиоразделение не всегда очевидно.
Например, энантиоразделение валина и лейцина, алифатических аминокислот, различающихся одной метальной группой в алкильном заместителе хирального атома углерода значительно различается: Rs 3.6 и 0.3, соответственно, что свидетельствует о сложном и непредсказуемом характере энантиоразделения. Сравнивая разделение энантиомеров КБЗ-производных ароматических кислот фенилаланина и тирозина можно отметить, что времена миграции и энантиоразделение тирозина немного больше. Поскольку эти аминокислоты различаются только гидроксильной группой в шра-положении фенильного кольца, можно предположить, что комплекс включения образуется с фенильным кольцом, входящим в состав аминокислоты, а не производного. Энантиомеры КБЗ-триптофана, обладающего ароматической системой, разделяются при использовании пер-6-амино-3-ЦД с достаточно высоким значением Rs 3.6. Для четырех бензоил-производных аминокислот можно отметить общую тенденцию к уменьшению или даже потере энантиоселективности по сравнению с КБЗ-производными. Наиболее значительно это проявилось для Б-валина (Rs 1.0). Можно отметить также меньшее время миграции (9.40) и отсутствие энантиоразделения Б-аланина по сравнению с Б-фенилаланином (11.70/11.78). По-видимому, во втором случае комплекс включения с пер-6-амино-р-ЦД образуется с участием бензильной, а не бензоильной группы. Если сравнить энантиоразделение КБЗ- и Б-фенилаланина, то можно заметить меньшее время миграции и более низкую энантиоселективность разделения второго производного. Наконец, все дансильные производные не разделяются при использовании пер-6-амино-3-ЦД. По-видимому, отталкивание аминогруппы дансильной части аминокислоты и аминогрупп пер-6-амино-(3-ЦД делает невозможным даже частичное включение дансильных производных в полость пер-6-амино-Р-ЦД. Эти данные находятся в соответствии с данными, полученными при использовании моно(6-амино-6-дезокси)-(3-циклодекстрин [27]. Подчеркивая сложность и непредсказуемость хиральных разделений, нужно заметить, что введение гидроксиэтильных групп в аминогруппы (хиральный селектор - ГЭА-Р-ЦД) позволяет достичь хорошего энантиоразделения дансил-аспарагиновой кислоты [23]. Обращаясь к энантиоразделению БОК-аминокислот, необходимо еще раз подчеркнуть важность электростатических взаимодействий в энантиораспознавании при использовании пер-6-амино-Р-ЦД. Энантиоразделение БОК-триптофана и БОК-фенилаланина при использовании ГП-{3-ЦД было исследовано в работе [121]. При использовании 10 мМ ГП-Р-ЦД энантиомеры БОК-триптофана и БОК-фенилаланина могут быть разделены с энантиоразрешением 1.53 и 2.18, соответственно.
При использовании пер-6-амино-р-ЦД более низкая концентрация хирального селектора (3 мМ) позволяет получить значения Rs для энантиоразделения БОК-триптофана и БОК-фенилаланина 5.4 и 1.5 соответственно. В дальнейшем влияние рН и концентрации хирального селектора было изучено для группы отдельных производных аминокислот. В табл. 26 суммированы результаты хиральных разделений в интервале рН 4.8-6.7, при концентрации 3 мМ пер-6-амино-3-ЦД. Как видно из табл. 26, времена миграции всех аминокислот минимальны при рН 5.8 и возрастают при уменьшении и увеличении рН. Такая же зависимость наблюдается и для кислот, изученных ранее, и может быть объяснена действием тех же факторов. Энантиоразделение всех аминокислот выше при уменьшении рН, т.е. максимально при рН 4.8. Сравнивая значения энантиоразрешения, полученные для различных производных фенилаланина и триптофана, можно сказать, что они сопоставимы между собой. Влияние концентрации хирального селектора на энантиоразделение КБЗ-производных аспарагина, фенилаланина, триптофана и тирозина изучено в интервале 2-Ю мМ пер-6-амино-3-ЦД (рис. 42). Энантиомеры КБЗ-триптофана, обладающего ароматической системой, разделяются при использовании пер-6-амино-Р-ЦД с наиболее высоким значением Rs, равным 11.2 (рис. 43). Порядок миграции энантиомеров КБЗ-тирозина, БОК-фенилаланина, БОК-триптофана в изученных условиях не зависит ни от рН, ни от концентрации пер-6-амино-3-ЦД. Одновременное хиральное разделение семи КБЗ-аминокислот также было исследовано при различных концентрациях (2-Ю мМ) хирального селектора. Оптимальное разделение смеси КБЗ-аминокислот получено при 4 мМ пер-6-амино-(3-ЦД (рис. 44). Нужно подчеркнуть, что энантиоразделение отдельных КБЗ-аминокислот описано только при использовании нейтральных и анионных ЦД, но не катионныхТДД. энантиоразрешения без метанола и с метанолом, соответственно). При увеличении содержания метанола до 15% времена миграции продолжают увеличиваться, что связано с увеличением вязкости ФЭ. Энантиоразделение КБЗ-производных норлейцина и тирозина не изменяется по сравнению с ФЭ, содержащим 5% метанола, триптофана немного увеличивается, для других соединений уменьшается. Как уже упоминалось, разделение производных аминокислот уже было исследовано в ВЭЖХ при использовании хиральной неподвижной фазы на основе аминированного Р-ЦД [110]. Интересно отметить некоторые особенности разделения энантиомеров методами ВЭЖХ и КЭ. Сравнение результатов энантиораспознавания производных аминокислот в КЭ с данными, полученными ранее в ВЭЖХ, показывает, что ряд закономерностей сохраняется.
