Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7
ВВЕДЕНИЕ 8
1. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 14
ПЕСТИЦИДОВ
1.1. Методы определения триазиновых и хлорорганических 14
пестицидов
1.1.1 Хроматографические методы определения 14
Варианты определений с использованием твердофазной 15 экстракции
Иммунохимический анализ и его место среди современных 24 методов анализа
Сущность и некоторые особенности иммунохимических 24 методов анализа
Иммунохимическое определение пестицидов 27
1.1.4. Другие методы определения триазиновых и 31
хлорорганических пестицидов
Полимеры с молекулярными отпечатками для 31 селективного определения отдельных пестицидов
Биосенсоры как устройства для определения некоторых 36 пестицидов
2. АНТИДЕПРЕССАНТЫ КАК КЛАСС ЛЕКАРСТВЕННЫХ 41
СОЕДИНЕНИЙ И МЕТОДЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
2.1. Моноаминоксидаза и ее свойства 41
Моноаминоксидаза 41
Биогенные амины как субстраты моноаминоксидазы 42
Антидепрессанты как эффекторы моноаминоксидазы 44
2.2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ 46
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
2.2.1 Биосенсоры в определении лекарственных препаратов 46
2.2.2. Биосенсоры, предназначенные для определения 51
моноаминов и эффекторов моноаминоксидазы
3 Другие методы определения антидепрессантов 53
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ, АППАРАТУРА, ОБЪЕКТЫ 5 8
ИССЛЕДОВАНИЯ И УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Постановка задачи 58
Объекты исследования 61
Аппаратура и техника измерений 63
Устройство амперометрических биосенсоров 65
Изготовление холинэстеразного биосенсора на основе 65 планарных платиновых электродов
Получения биочувствительной части 66 моноаминоксидазного сенсора
Получение иммобилизованных антител 66
Условия получения аналитического сигнала 66
амперометрического холинэстеразного биосенсора на основе планарных платиновых электродов
Обработка экспериментальных данных 67
ВОЗМОЖНОСТИ ГРУППОВОГО И ИНДИВИДУАЛЬНОГО 72
ИММУНОЭКСТРАКЦИОННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ТРИАЗИНОВЫХ ГЕРБИЦИДОВ С АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ
ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
Холинэстрезные биосесоры в определении триазиновых 72
гербицидов
Атразин и симазин как представители гербицидов 72 триазинового ряда
Групповой анализ триазиновых гербицидов 73 Характеристики процесса иммуноэкстракции и 75 концентрирования
Факторы, влияющие на процесс экстракции триазиновых 75 гербицидов
Аналитические возможности концентрирования 78 триазиновых гербицидов
4
Иммуноэкстракционое проведение группового и 80
индивидуального анализа
Анализ пищевых продуктов на содержание триазиновых 82 гербицидов
Определение триазиновых гербицидов в молоке и 83 молочных продуктах
Определение триазиновых гербицидов в виноградном соке 86 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ 89 ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В НИТРАТ ЦЕЛЛЮЛОЗНУЮ МАТРИЦУ ПОЛИМЕРОВ С МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ОТПЕЧАТКАМИ 2,4 - ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ
2,4 -Д - неспецифический ингибитор холинэстразы 89
Характеристики процесса сорбции-десорбции и 90
концентрирования с помощью иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками
Получение иммобилизованных полимеров с 91 молекулярными отпечатками
Факторы, влияющие на процесс экстракции 2,4-Д 92
Выбор рабочих условий проведения сорбции и десорбции 93
Оценка селективности действия иммобилизованных 95 полимеров с молекулярными отпечатками
Оценка сорбционной способности 2,4-Д 96 иммобилизованными полимерами сравнения
Аналитические возможности концентрирования 2,4-Д с 97 помощью иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками
Определение 2.4 -Д в молоке 97
МОНОАМИНОКСИДАЗНЫЕ БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ 100
ПОЛИСПЕЦИФИЧНОГО И ИНДИВИДУАЛЬНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИДЕПРЕССАНТОВ
5
Разработка амперометрических моноаминоксидазных 100
биосенсоров
Условия формирования аналитического отклика 100 биосенсоров на основе иммобилизованной моноаминоксидазы
Разработка моноаминоксидазного биосенсора на основе 104 печатного платинового электрода
Кинетические параметры реакции окислительного 107
дезаминирования дофамина в присутствии дезипрамина
Оценка каталитической активности иммобилизованной 109
моноаминоксидазы
Аналитические возможности моноаминоксидазного 109
биосенсора в определении антидепрессантов
Определение эффекторов иммобилизованной 109 моноаминоксидазы
Определение содержания антидепрессантов в 111 фармпрепаратах
Рекомендации по применению моноаминоксидазных 112 биосенсоров разного типа
Получение и характеристики иммобилизованных антител 113
против антидепрессантов
Получение иммобилизованных антител 114
Определение констант связывания иммунных комплексов 115
Оценка специфичности иммунохимического определения 115 дезипрамина
Характеристики процесса иммуноэкстракции 117
Иммунохимическое определение некоторых 117
антидепрессантов
Иммуноэкстракция нескольких (группы) трициклических 118 антидепрессанов
Иммунохимическое определение отдельного 120 антидепрессанта на примере дезипрамина
6,7,3. Иммунохимическое определение дезипрамина в 121
биологических жидкостях
7. ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ГРУППОВОГО И 123
ИНДИВИДУАЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Особенности функционирования предлагаемых тест- 123 систем
Этапы практической реализации предлагаемых тест-систем 125
Перспективы использования предлагаемых тест-систем 126
Разработка алгоритма иммуноэкстракционного 129 определения биологически активных соединений
различных классов в образце неизвестного состава с помощью предлагаемых тест-систем
ВЫВОДЫ 132
Список литературы 134
7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Аг - антиген
At - антитело
БСА - бычий сывороточный альбумин
БТХИ - бутирилтиохолин иодид
2,4 - Д - 2,4 - дихлорфеноксиуксусная кислота
ИАт - иммобилизованные антитела
ИМАО - иммобилизованная моноаминоксидаза
ИХА - иммунохимический анализ
ИХЭ - иммобилизованная холинэстераза МАО - моноаминоксидаза
НЦ - нитрат целлюлоза
ХЭ - холинэстераза
ПДК - предельно допустимая концентрация
ПМО - полимеры с молекулярными отпечатками ПрО - предел обнаружения сн - нижняя граница определяемых концентраций ТФЭ - твердофазная экстракция
Введение к работе
Разработка простых, экспрессных и в то же время чувствительных и
селективных способов определения широкого круга биологически активных соединений различной природы и происхождения - задача, которая была, есть и будет актуальной еще долгое время.
Зачастую, на стадии предварительных испытаний, отсутствует необходимость определять конкретное соединение, что всегда сопряжено с дополнительными материальными и временными затратами, и можно ограничиться информацией о наличии соединений определенного класса, т.е. получить сигнал «есть-нет», например, относительно потенциальных загрязнителей в объекте анализа. Это может послужить основанием для оперативного принятия соответствующих природоохранных мер и лишь затем, при необходимости, выявить конкретный загрязнитель.
Концепция обобщенных показателей и группового анализа, характеризующих состояние анализируемых объектов, которые в ряде случаев предшествуют определению индивидуальных соединений, находит все больше сторонников среди исследователей. При гораздо меньших затратах групповой анализ, зачастую, позволяет получить результат, который можно использовать в практических целях и который, в целом, определяет общую стратегию дальнейшего исследования.
Один из путей решения этой проблемы - разработка новых способов анализа, новых тест-систем. Они в зависимости от принципа действия, используемых химических реагентов, состава, условий проведения определений и способа получения информации, могут позволить найти подходы к анализу объектов неизвестного состава, что по-прежнему составляет одну из сложнейших и нерешенных задач аналитической химии. Все это и обуславливает актуальность проводимых в рамках диссертационной работы исследований.
В качестве таких способов для селективного определения группы (класса) соединений и последующего определения индивидуальных конкретных соединений в сложных по составу объектах, предлагается определение биологически активных веществ с применением иммобилизованных антител
9 разной специфичности действия или полимеров с молекулярными отпечатками с последующим определением амперометрическими биосенсорами.
Возможности таких вариантов анализа, преимущества предлагаемых подходов и приемов показаны на примере определения классов триазиновых и хлорорганических гербицидов, лекарственных соединений, относящихся к классу антидепрессантов и их отдельных представителей.
Применение предлагаемого способа определения биологически активных соединений, в том числе ксенобиотиков, может обеспечить с одной стороны, принятие своевременных природоохранных мер, а с другой стороны, обеспечит проведение лекарственного мониторинга в режиме реального времени, что должно способствовать повышению качества жизни населения.
Работа проводилась при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 03-03-33116.
Цель исследования заключалась в разработке подходов и методических приемов для создания комбинированного способа определения класса (группы) биологически активных веществ (пестициды, лекарственные препараты) и последующего определения индивидуальных конкретных соединений в сложных по составу объектах, путем иммуноэкстракции определяемых соединений с помощью иммобилизованных антител (сорбентов) с последующим определением амперометрическими биосенсорами.
Научная новизна
Предложен методический подход, основанный на иммуноэкстракции сначала группы соединений одного класса (групп-специфичный анализ), а затем иммуноэкстракции отдельных представителей этого класса соединений (индивидуальный анализ), осуществляемый за счет сочетания специфичности действия иммобилизованных сорбентов различной природы (антитела и полимеры с молекулярными отпечатками) и амперометрических биосенсоров. Рассчитаны количественные характеристики иммуноэкстракции пестицидов и антидепрессантов разных классов с помощью иммобилизованных антител.
10 Оценена возможность использования иммобилизованных полимеров с молекулярными отпечатками как альтернатива иммобилизованным антителам для определения гербицида 2,4-Д. Показана возможность концентрирования, исходя из максимальной сорбционной емкости иммобилизованных антител и полимеров с молекулярными отпечатками и величины отклика холинэстеразного биосенсора.
Для реализации предлагаемого способа определения антидепрессантов разработаны новые амперометрические биосенсоры на основе иммобилизованной моноаминоксидазы, печатных и стекоуглеродного электродов, в основу функционирования которых положены сочетание реакции окислительного дезаминирования биогенных аминов и электрохимического окисления продуктов их ферментативной реакции. Показана возможность оценки количественного содержания антидепрессантов разных классов по их ингибирующему действию на иммобилизованную моноаминоксидазу. Рассчитаны кинетические параметры окислительного дезаминирования дофамина в отсутствие и в присутствии различных концентраций ингибиторов моноаминоксидазы. Разработан вариант иммунохимического определения трициклических антидепрессантов с использованием иммобилизованных антител и амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров.
Предложен алгоритм проведения иммуноэкстракционных определений биологически значимых веществ в образце неизвестного состава с помощью иммобилизованных антител разной специфичности действия и амперометрических биосенсоров.
Практическая значимость
Предложен комбинированный способ анализа, представляющий собой новое решение задачи селективного и высокочувствительного определения группы соединений и (или) отдельного соединения в сложной по составу смеси, в присутствии родственных по структуре и свойствам соединений, что невозможно с использованием других приемов и подходов. Разработана методика иммунохимического определения как группы триазиновых гербицидов, так и их отдельных представителей в молоке, молочных продуктах и в соках, гербицида
2,4 - Д в молоке с использованием полимера с соответствующими молекулярными отпечатками.
Разработан вариант иммунохимического определения трициклических антидепрессантов с использованием иммобилизованных антител и амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров. Проведена апробация разработанных биосенсоров при определении лекарственных соединений (пиразидола и флуоксетина) в фармпрепаратах и дезипрамина в сыворотке крови.
Показаны перспективы практической реализации предлагаемого комбинированного способа определения биологически активных веществ в виде тест-систем для группового и индивидуального иммуноэкстракционного определения пестицидов, лекарственных соединений с амперометрическим детектированием.
На защиту выносятся:
Результаты изучения сочетания иммуноэкстракции группы триазиновых гербицидов, нескольких антидепрессантов с помощью соответствующих иммобилизованных Ат разной специфичности действия, а также отдельных представителей определяемых классов соединений с последующим детектированием амперометрическими биосенсорами (холинэстеразным, моноаминооксидазным).
Количественные характеристики и аналитические возможности процессов иммуноэкстракции (сорбции-десорбции) и концентрирования с помощью иммобилизованных антител и полимеров с молекулярными отпечатками.
Модели амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров на основе различных физических преобразователей - платиновых печатных и стеклоуглеродного электродов для определения антидепрессантов разных классов.
Кинетические параметры реакции окислительного дезаминирования дофамина в присутствии антидепрессантов.
Константы образования иммунных комплексов и оценка перекрестной реактивности используемых антител к антидепрессантам.
12 Методики определения группы триазиновых пестицидов (отдельных представителей гербицидов триазинового ряда), гербицида 2,4 - Д в пищевых продуктах, антидепрессантов в лекарственных формах (пиразидол, флуоксетин) и в биологических жидкостях (дезипрамин).
Апробация работы: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика И.П. Алимарина "Аналитика России" (Москва, 2004), II Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии" (Краснодар 2005), Всероссийской научной конференции с международным участием "Электроаналитика-2005" (Екатеринбург, 2005 г.), Международной научной конференции "Химия, химическая технология и биотехнологичя на рубеже тысячелетий" (Томск 2006), итоговой научной конференции Казанского государственного университета (2006), VI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно - образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века", Российской школе - конференции молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии" (Пущино 2006).
Публикации: По теме диссертации публиковано 17 работ. Из них 5 статей (2 из них включены в перечень ВАК) и 12 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях. 2 статьи приняты к печати.
Структура и объем работы: Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 25 таблиц и 14 рисунков. Работа состоит из введения, семи глав, выводов и списка литературы, включающего 163 ссылки.
Первая глава литературного обзора посвящена современным методам определения триазиновых и хлорорганических пестицидов. Уделено внимание применению твердофазной экстракции в сочетании с различными методами анализа, возможностям иммунохимического анализа, применению сенсорных устройств и полимеров с молекулярными отпечатками.
Вторая глава литературного обзора посвящена современным методам анализа лекарственных соединений на примере антидепрессантов.
Третья глава содержит постановку задачи, методы и условия эксперимента.
Четвертая глава посвящена разработке принципов комбинированного анализа за счет сочетания иммуноэкстракции группы триазиновых гербицидов с помощью соответствующих иммобилизованных Ат, а также отдельных представителей определяемых классов соединений с последующим детектированием амперометричесьсим холинэстеразным биосенсором. Представлены характеристики процесса иммуноэкстракции и концентрирования. Показана возможность группового определения симазина и атразина в молочных продуктах и соках.
В пятой главе представлены результаты определения гербицида 2,4 -дихлорфеноксиуксусной кислоты, используя иммобилизованные полимеры с молекулярными отпечатками, как альтернатива иммобилизованным антителам, и амперометрический холинэстеразный биосенсор. Оценены аналитические возможности иммобилизованных полимеров. Предложена методика определения 2,4 -дихлорфеноксиуксусной кислоты в молоке.
В шестой главе нашли отражение результаты, связанные с дальнейшим развитием представленных ранее (глава 4) подходов и приемов на примере иммуноэкстракционного определения другого класса биологически активных веществ - антидепрессантов. Представлены результаты разработки новых амперометрических биосенсоров на основе иммобилизованной моноаминоксидазы и планарных или стеклоуглеродного электродов, их аналитические возможности. Описаны методики определения антидепрессантов: дезипрамина в крови, пиразидола и флуоксетина в фармпрепаратах.
Седьмая глава посвящена перспективам практической реализации предлагаемого комбинированного способа определения биологически активных веществ в виде тест-систем. Приведен общий алгоритм проведения таких определений.
Научным консультантом работы является академик РАЕН и МАНВШ, доктор химических наук, профессор Будников Герман Константинович
