Содержание к диссертации
Введение
3 Обзор литературы 10
3.1 Феномен симбиоза P. bursaria- Chlorella 10
3.2 Общая характеристика P.bursaria 10
3.3 Общая характеристика симбиотических водорослей Chlorella sp 13
3.4 Систематическое положение симбиотических хлорелл 14
3.5 Формирование и поддержание симбиоза P. bursaria — Chlorella 17
3.6 Координация жизненных циклов хозяина и симбиотических хлорелл.20
3.7 Специфичность взаимоотношений P. bursaria- Chlorella 22
3.8 Общая характеристика вирусов хлорелл 25
3.9 Филогенетические отношения вирусов хлорелл 29
3.10. Жизненные циклы вирусов 32
3.11 Литический цикл вирусов хлорелл P. bursaria 33
3.12 Протисты и вирусы 35
3.13 Поддержание вирусов хлорелл в природных водоемах и в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella 37
4 Материалы и методы 40
4.1 Материалы 40
4.1.1 Клоны P. bursaria 40
4.1.2 Клоны P. caudatum 40
4.1.3 Штаммы хлорелл 40
4.1.4 Штаммы вирусов хлорелл 41
4.2 Методы 50
4.2.1 Методы культивирования инфузорий 50
4.2.2 Тестирование клонов P. bursaria на наличие вирусов и определение титра вирусов 50
4.2.3 Пульс-Электрофорез 51
4.2.4 Гибридизация по Саузерну 53
4.2.5 Антитела и непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание клеток P. bursaria 54
4.2.6 Визуализация вирусов при помощи красителей SYTOX 57
4.2.7 Конфокальная микроскопия 59
4.2.8 Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) 59
4.2.9 Метод количественного стереологического анализа 60
5 Результаты 68
5.1 Скрининг клонов P. bursaria на наличие вирусов 68
5.2 Обнаружение вирусов в клонах P. bursaria разных сингенов 69
5.3 Идентификация вирусов хлорелл в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella методом пульс-электрофореза 70
5.3.1 Сравнительный анализ ПЭФ-профилей P.bursaria и хлорелл 70
5.3.2 Исследование природы полосы размером около 300 т.п.н. на электрокариотипах клонов P. bursaria 72
5.3.3 Локализация интегрированной ДНК вируса в симбиотической системе P. bursaria- Chlorella - вирус 74
5.3.4 Локализация неинтегрированной ДНК в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella - вирус 74
5.3.5 Оценка количества вирусных геномов 75
5.4 Исследование локализации вирусных частиц в ассоциации с клеткой P. bursaria 84
5.4.1 Идентификация вирусов в трехкомпонентной симбиотической системе P. bursaria - Chlorella - вирус методом непрямой иммунофлюоресценции 84
5.4.2 Конфокальная микроскопия клеток P. bursaria окрашенных красителем SYTOX in vivo 92
5.4.3 Конфокальная микроскопия клеток P. bursaria in vivo инкубированных с вирусами, предварительно окрашенными красителем SYTOX 93
5.5 Исследование вирусов и парамеций методом ТЭМ 97
5.5.1 Локализация вирусных частиц в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella - вирус 97
5.5.2 Распределение вирусных частиц на поверхности P. bursaria 98
5.5.3 Локализация вирусов в безвирусной системе P. bursaria — Chlorella 101
5.5.4 Локализация вирусов в ассоциации с P. caudatum 102
Обсуждение 114
6.1 Исследование симбиотической системы P. bursaria - Chlorella -вирус методом ПЭФ и гибридизации по Саузерну 114
6.2 Локализация вирусных частиц в симбиотической системе P. bursaria -Chlorella — вирус 117
6.3 Специфичность взаимодействия вирусов хлорелл парамеций и Р. bursaria 123
6.4 Ассоциация вирусных частиц с цилиатурой ротового аппарата Р. bursaria 126
6.5 Распределение вирусных частиц на поверхности клетки парамеции. 128
6.6 Роль P. bursaria в системе P. bursaria - Chlorella - вирус 134
6.7 Роль вирусов в эволюции и экологии симбиоза P. bursaria -Chlorella 138
6.8 Выводы 139
Приложение 143
Литература
- Общая характеристика симбиотических водорослей Chlorella sp
- Тестирование клонов P. bursaria на наличие вирусов и определение титра вирусов
- Идентификация вирусов хлорелл в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella методом пульс-электрофореза
- Локализация вирусных частиц в симбиотической системе P. bursaria -Chlorella — вирус
Введение к работе
Термин «симбиоз» был предложен Де Бари в 1979 году. Симбиоз (от греч. cruv - вместе, {Зшотс; - жизнь) - форма взаимоотношений при сожительстве неродственных организмов (Вагу, 1879). Сегодня под термином симбиоз понимают совместное сосуществование двух или более видов (Margulis, Fester, 1992; Douglas, 1995). Понимание симбиотических отношений имеет большое фундаментальное значение, как в зоологии, так и в микробиологии, а также практическую значимость для медицинской микробиологии (Осипов, Подлипаев, 1981; Margulis, Chapman, 1998). Симбиотические отношения можно рассматривать как модель для изучения межклеточных взаимодействий, иммунных механизмов (Gerashenko et al., 2000). Признано, что симбиоз - это один из основных механизмов прогрессивной эволюции в биосфере (Bhattacharya et al., 2007).
Протесты представляют широкий спектр возможностей для исследований симбиотических отношений и симбиогенеза. Они формируют симбиотические ассоциации как с про- , так и с эукариотическими организмами, включая бактерии, археи, грибы и микроводоросли (Epstein et al., 1998; Осипов, Подлипаев, 1981; Reisser et al., 1985).
Симбиотические отношения Paramecium barsaria (Ciliophora, Oligohymenophorea) и зеленой водоросли Chlorella (Chlorellaceae, Trebouxiophyceae) представляют собой пример классического симбиоза (Karakashian et all, 1968; Reisser, 1986). Эта симбиотическая система является одной из наиболее активно изучаемых систем. Исследования проводятся во многих лабораториях мира уже более полувека.
Хлореллы, выделенные из клеток парамеций, специфически инфицируются гигантскими ДНК-содержащими вирусами из рода Chlorovirus семейства Phycodnaviridae (Van Etten, Meints, 1999). Это активные литические вирусы, они не инфицируют свободноживущие хлореллы и не атакуют
хлореллы, находящиеся в симбиотических вакуолях внутри P. bursaria (Van Ettenetal., 1991).
Система P. bursaria - Chlorella sp. представляет особый интерес в качестве модельной вирус-содержащей симбиотической системы. Исследования данной многокомпонентной симбиотической системы невозможны без представления об особенностях каждого из партнеров как отдельного организма. Для многих систем раздельное культивирование участников симбиоза весьма трудоемко, а часто и невозможно. В выбранной нами системе этой проблемы не возникает. Участников симбиоза можно разделить и культивировать отдельно (Douglas, Huss, 1986; Kavako et al., 2005). С другой стороны, при изоляции клонов инфузорий и их культивировании сохраняются все три компонента симбиотической системы (Мигунова и др., 2000). Методика культивирования инфузорий P.bursaria в лабораторных условиях давно отработана (Sonneborn, 1970).
В распоряжении лаборатории кариологии одноклеточных Биологического НИИ СПбГУ (после 2008 года лаборатории кариологии одноклеточных биолого-почвенного факультета СПбГУ) имеется уникальная коллекция клонов P.bursaria из разных районов земного шара (Европа, Европейская часть России, практически все республики бывшего СССР, Япония, Китай, США). Коллекция ежегодно пополняется. Для каждого клона P.bursaria определена сингенная принадлежность. В сотрудничестве с лабораторией микробиологии БиНИИ СпбГУ (после 2008 года лаборатории микробиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ), которая обладает коллекцией симбиотических хлорелл и вирусов, значительная часть (около 100) клонов P.bursaria была протестирована на наличие вируса. Материалы этих коллекций стали базой для масштабного исследования симбиотической системы P. bursaria - Chlorella sp. и вирусов хлорелл.
2 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.
Целью настоящей работы стало исследование роли P. bursaria в трехкомпонентной симбиотической системе P. bursaria - Chlorella - вирус. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
выбрать адекватные методы и адаптировать их для работы с полноценной трехкомпонентной симбиотической системой Р. bursaria - Chlorella - вирус;
детектировать вирусную ДНК в симбиотической системе P. bursaria -Chlorella - вирус с помощью метода пульс-электрофореза, определить, в интегрированном или свободном состоянии вирусная ДНК находится в системе.
определить с помощью световой и электронной микроскопии локализацию вирусных частиц в симбиотической системе P. bursaria -Chlorella - вирус.
определить, существует ли специфичность между парамециями (видами, внутривидовыми группами) и вирусами симбиотических хлорелл парамеций.
3 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Общая характеристика симбиотических водорослей Chlorella sp
Симбиотические хлореллы из P.bursaria по морфологическим характеристикам являются типичными представителями рода Chlorella. Это мелкие одноклеточные агамные водоросли сферической или эллипсовидной формы, которые обладают ригидной клеточной стенкой, обычно содержат один хлоропласт (Karakashian et al., 1968). Вегетативная клетка растет и делится каждые 48 часов на четыре автоспоры, которые расходятся при разрыве родительской клеточной стенки (Karakashian et al., 1968). Между клеткой хозяина и эндосимбионтом существует энергетический обмен. Фотосинтезирующие хлореллы фиксируют С02, синтезируют сахара и передают 30-40% продуктов фотосинтеза парамеции (Reisser, 1987). Симбиотические хлореллы из клеток P. bursaria можно выделить в культуру. Клетки поддерживают в лабораторных условиях при постоянном освещении в среде Болда и Бристоля с добавлением 0,5% сахарозы и 0,1% пептона (Van Etten et al, 1983; Reisser, 1988a). Потребность в пептоне и слабый рост указывают на ауксотрофность, то есть водоросль испытывает потребность в веществах, которые в природе получает от клетки-хозяина (Мигунова, 2002). В отличие от свободноживущих видов, симбиотические хлореллы способны расти при значениях рН меньше 3.5 (Huss et al., 1993; Summerer et al., 2008).
Многие представители рода Chlorella являются эндосимбионтами различных пресноводных протистов, в частности, у инфузорий разных видов: Climacostoimim virens, Coleps hirtus, Enplotes daidaleos, Frontonia sp., Ophrydium sp., Vorticella sp., Stentor polymorphic, солнечников Acantocystis turfaceae (Rhizopoda), фораменифер, амёб Difflugia sp. и Mayorella viridis, a также у пресноводных губок, гидр и плоских червей (Goetsch 1924; Lee, Zucker, 1969; Trench, 1979; Graham, Graham, 1978; Rahat, Reich, 1987; Bubeck, Pfitzner, 2005). Симбиотические водоросли во всех этих организмах морфологически очень похожи. Внутри клетки хозяина каждая клетка водоросли заключена в индивидуальную периальгальную вакуоль (Graham, Graham, 1978; Rahat, Reich, 1987; Karakashian et al, 1968).
Систематическое положение симбиотических хлорелл, как и систематика хлорелл в целом, являются предметом дискуссии до настоящего времени. Это связано с тем, что на протяжении долгого времени идентификация хлорелл была чрезвычайно затруднительна, так как была основана, главным образом, на их морфологии (Huss et al., 1993). В целом принято считать, что все симбиотические хлореллы относятся к роду Chlorella, семейство Chlorellaceae, класс Trebouxiphyceae (Huss et al., 2002; Hoshina et al., 2004, 2005).
Хлореллы парамеций было принято разделять на две группы, «американскую» (или NC64A типа) и «европейскую» (или РЫ типа), на основании чувствительности к двум разным штаммам вирусов из семейства Phycodnaviridae (Van Etten et al., 1991; Reisser et al., 1986) (подробнее см. раздел 3.1.7.). На основании анализа последовательности 18S рДНК было показано (Hoshina et al., 2005), что «американские» и «европейские» хлореллы формируют две обособленные клады (Рис. 1).
Впоследствии было обнаружено, что чувствительность к разным штаммам вируса - это не единственная особенность этих групп. Между ними существуют и другие генетические и физиологические различия (Kvitko et al., 2001; Linz et al., 1999; Summerer et al., 2008; ). В дальнейшем «американские» хлореллы были обнаружены также в Японии, Австралии и Китае. Таким образом, названия «американские» и «европейские» не являются географическими, а лишь терминологическими и отражают существование двух генетически и функционально обособленных групп. Квитко (Kvitko et al., 2001) предположил объединить всех симбионтов P. bursaria в группу Chlorella paramecii и выделить в ней два экологических типа, или экотипа: «северный» и «южный». Эти экотипы различаются на основании чувствительности к температуре, по поверхностным антигенам и по чувствительности к вирусам (Мигунова и др., 2000; Kvitko et al., 2001).
Группа австрийских исследователей (Summerer et al., 2006, 2007, 2008) провела анализ молекулярной филогении симбиотических хлорелл из Р. bursaria и других видов инфузорий, а также свободноживущих хлорелл. Их результаты хорошо согласуются с результатами других авторов. Симбионты P. bursaria выделяются среди прочих хлорелл-симбионтов в отдельную кладу, которая родственна свободноживущим хлореллам Chlorella sp.. Однако внутри этой группы они распадаются на две линии. В одну попадают хлореллы «европейской» группы, конгруэнтные «северному» экотипу (sensu Квитко), в другую «американской» группы, которые соответствуют «южному» экотипу (sensu Квитко) (Summerer et al., 2008).
Однако решение вопроса о филогенетической принадлежности симбионтов P. bursaria не столь однозначно. Недавно, было выдвинуто предположение о полифилитическом происхождении эндосимбионтов Р. bursaria (Hoshina, Imamura, 2008). На основании анализа последовательностей 18S рДНК и ITS2 исследованные штаммы симбионтов P. bursaria отнесли к четырем разным видам. Вид Ch. vulgaris, «американские» и «европейские» хлореллы, которым также был придан ранг вида, на основании того, что различия между ними по последовательности ITS2 были велики 22.6—26.6%, относятся к роду Chlorella (Chlorellaceae, Trebouxiophyceae). Четвертый симбионт кластеризовался отдельно от Chlorellaceae, и оказался ближе всего к паразитическому организму Соссотуха spp. (Trebouxiophyceae, Chlorococcales, Coccomyxaceae).
В последние годы, с привлечением новых методик к изучению филогении симбиотических хлорелл и других симбионтов P. bursaria, возродился значительный интерес к этой теме (Kvitko et al., 2001; Summerer et al, 2006; Hoshina, Imamura, 2008). На сегодняшний день был проведен анализ на ограниченном количестве штаммов. Расширение исследований в этой области, изучение природного разнообразия симбионтов, а также анализ других последовательностей, возможно, в будущем прояснит существующие сегодня разногласия.
Тестирование клонов P. bursaria на наличие вирусов и определение титра вирусов
Для приготовления препаратов ДНК для ПЭФ брали культуры инфузорий. Клетки концентрировали при 600 g до объема 0.5 мл. Осадок суспендировали и смешивали в соотношении 1:1 с охлажденной до 50С, расплавленной 1.5% агарозой (SeaKem, FMC, США), приготовленной на 0.125 М ЭДТА, рН=8.0. Смесь пипетировали и разливали по шаблонам (между донышками двух 40 мм. пластиковых чашек Петри, фиксированных липкой лентой), получая агарозные пластины толщиной около 1 мм. Конечная концентрация клеток в препарате составляла 0.7-1.5x104 в 1 мл. Полученные пластины охлаждали при 4С в течение 5 минут. В застывших образцах контролировали целостность клеток под бинокуляром. Затем пластины инкубировали в лизирующем буфере ESP (0.5 М ЭДТА, рН=9.5, 1% лауроилсаркозин Na, проназа Е (200 мкг/мл) двое суток при 37С. Полученные блоки хранили в том же лизирующем растворе при 4С. Для проведения ПЭФ вырезали блок-вставки (V = 20 мкл.), соответствующие размеру карманов в геле. В качестве размерного маркера для ПЭФ использовали хромосомы дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамма 15В-П4 (Инге-Вечтомов, Андрианова, 1988), размер хромосом которого был определён ранее (Тимофеева, Раутиан, 1997). Приготовление агарозных блоков с ДНК S. cerevisiae осуществляли по стандартной методике (Carle, Olson, 1985).
Для приготовления препаратов ДНК среды клона P. bursaria использовали клон Т 316 (по результатам микробиологических тестов содержит вирус NC64A), из которого по стандартной методике готовили препараты для ПЭФ, однако непосредственно перед центрифугированием объем с суспендированными клетками разливали поровну в две пробирки. Затем из одной пробирки клетки полностью отфильтровывали и при приготовлении препарата для ПЭФ использовали только оставшуюся в пробирке среду, а из другой готовили стандартный (см. выше) препарат с клетками.
Клетки хлорелл, снятые микробиологической петлей с агара, суспендировали в среде Бристоль (Sonnebom, 1970). Суспендированные клетки концентрировали центрифугированием в течение 10 минут при 2 тыс. об/мин до объема 0.5 мл. Далее препараты готовили так же, как препараты ДНК P. bursaria.
Очищенные вирусные частицы, суспендированные в 100 мМ TRIS-HC1 рН 7,4 смешивали с расплавленной 1,5 % агарозой в соотношении 1:1, далее препараты готовили аналогично препаратам ДНК P. bursaria.
Препараты ДНК вирусов готовили из серии разведений. Для приготовления разведений использовали исходную суспензию, титр вируса в которой составлял 1x106 БОЕ на 1 мл. Титр определили методом титрования на чашках. Поскольку считается, что только половина частиц является инфекционными (Van Etten et al., 2002), то общее количество вирусных частиц в исходной суспензии составляло 2x10б вирусных частиц на 1 мл. Приготовили серию разведений суспензии вирусных частиц с концентрацией соответственно: 2х104, 2х5х104, 2х2,5х105, 2х5х105 и 2х106 вирусных частиц на миллилитр в 100 мМ TRIS-HC1 рН, рН 7,4. Далее готовили препараты ДНК для ПЭФ.
Для проведения ПЭФ использовали прибор авторской конструкции (Межевая и др., 1990), который позволяет создавать и чередовать два электрических поля с углом переориентации 120. ПЭФ проводили в 1% агарозном геле (Sea Kem, FMC, США), приготовленном на 0.5х буфере ТВЕ (45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН=8.0). Толщина геля составляла 4 мм. Электрофорез проводили в 0.5х буфере ТВЕ при температуре 16С. Напряжение составляло 10 В/см. Оптимальный режим разделения ДНК для P. bursaria: 30 с - 7 ч, 50 с - 7 ч, 70 с - 7 ч, 120 с - 7 ч, 150 с - 8 ч (секунды - время действия каждого электрического поля, так называемое «время пульса»; часы - продолжительность работы прибора при этом времени пульса).
После проведения ПЭФ ДНК переносили на нейлоновые фильтры (Amersham Pharmacia Biotech Nylone Membranes) капиллярным методом по стандартной методике с использованием 20х SSC (Маниатис и др., 1984) и иммобилизировали облучением ультрафиолетом.
Идентификация вирусов хлорелл в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella методом пульс-электрофореза
Для исследования вирусов хлорелл в симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella был адаптирован метод пульс-электрофореза. Прежде всего, проведенный нами сравнительный анализ ряда ПЭФ-профилей (в т.ч. отдельных участников симбиоза) позволил определить, в какой части профиля мигрирует ДНК того или иного партнера. Были получены и проанализированы ПЭФ-профили: ? клонов P.bursaria, содержащих Chlorella sp. (Рис. 6. д.4-6), ? клона P.bursaria, который не содержит хлорелл-симбионтов (Рис. 6. д. 3), ? штамма выделенной в культуру симбиотической хлореллы (Рис. 6. д.1).
Для получения более точной и объективной характеристики ПЭФ-профилей мы использовали разные режимы ПЭФ, варьируя время действия каждого электрического поля, так называемое «время пульса», и продолжительность работы прибора при этом времени пульса. Это позволило нам получить ПЭФ-профили P.bursaria с более высоким разрешением в разных размерных областях и более точно идентифицировать ДНК \ партнеров. Наши данные хорошо согласуются с полученными ранее характеристиками ПЭФ-профилей P.bursaria (Rautian, Potekhin, 2002).
В области высокомолекулярной фракции, более 2000 т.п.н., хорошо видны несколько интенсивных полос. Эти полосы присутствуют как на ПЭФ-профилях, образованных ДНК симбиотической хлореллы штамма ОСН-1 Pbi (северного) типа (Рис. 6, д. 1), так и на ПЭФ-профилях тотальной ДНК Р. bursaria (Рис. 6, д. 4-6). Сравнение ПЭФ-профилей P. bursaria и выделенных в культуру хлорелл показало, что в этой области находится ДНК хромосом хлорелл. На ПЭФ-профиле клона P. bursaria Mit R1 хорошо заметна слабая резкая полоса размером около 950 т.п.н (рис. 6, д. 6), на ПЭФ-профиле хлореллы штамма ОСН-1 (Pbi типа), выделенной в культуру, видны две полосы (рис. 6, д. 1): одна размером около 950 т.п.н., другая размером около 1150 т.п.н.. По всей видимости, эти полосы сформированы самыми маленькими хромосомами хлорелл.
На ПЭФ-профиле бессимбионтных P. bursaria в области более 2000 т.п.н. заметна слабая полоса (Рис. 6, д. 3), которая, по всей видимости, образована ДНК микронуклеуса. Хромосомная ДНК хлорелл полностью перекрывает эту полосу на профиле хлорелла-содержащих P. bursaria (Рис. 6. Д. 4-6).
Спектр относительно коротких молекул от 30-40 т.п.н. до 120-150 т.п.н., согласно литературным данным (Rautian, Potekhin, 2002), сформирован ДНК макронуклеуса P. bursaria (рис. 6, д. 3-6). Кроме того, было показано, что на ПЭФ-профилях всех клонов P.bursaria присутствует небольшое количество ДНК, размер которой больше 150 т.п.н (рис. 6, д. 3-6). Этот результат можно интерпретировать как частичнную деградацию высокомолекулярной ДНК хлорелл, либо это молекулы ДНК макронуклеуса P. bursaria.
Таким образом, на ПЭФ-профиле P. bursaria были выявлены ДНК хромосом Ма и Ми парамеции и хромосомы хлореллы. В ПЭФ-профиле также могли присутствовать кольцевые геномы хлоропластнои ДНК хлорелл размером около 120 т.п.н (Schuster et al., 1990) и митохондриальной ДНК хлорелл и парамеции. Однако подвижность кольцевых молекул имеет иную, чем для линейных молекул, зависимость от размера (Hightower et al., 1987), и мы не исследовали вопрос о локализации этих геномов на ПЭФ-профиле.
После того, как были уточнены характеристики ПЭФ-профилей тотальной ДНК P. bursaria, мы перешли к исследованию природы полосы размером около 300 т.п.н. в электрокариотипе системы P.bursaria - Chlorella sp. - вирус. Ранее было высказано предположение, что эта полоса образована ДНК вирусов хлорелл парамеций (Rautian, Potekhin, 2002). Для 35 клонов Р. bursaria, протестированных микробиологически на наличие вирусов (Таблица 7), мы получили ПЭФ-профили. Оказалось, что на ПЭФ-профилях 10 этих клонов стабильно выявляется четкая интенсивная полоса размером около 300 т.п.н. (Рис. 6, д. 4, 5. Рис.7, д. 2, 5).. По результатам микробиологических тестов именно эти клоны оказались вирус-содержащими (Таблица 7): в двух клонах были обнаружены вирусы NC64A типа (Т 316, Т 24-5), в восьми - Pbi типа (AZ 8-2, AZ 11-10, AZ 12-9, AZ 17-2, AZ 17-7, 02 В 1-2, MP 3, 87 МС 1), 25 были безвирусными. Клоны, не имеющие полосы в этой области на ПЭФ-профилях (Рис. 6. д. 6), были безвирусными. Таким образом, была установлена прямая зависимость между наличием вируса в клонах и наличием полосы на ПЭФ-профилях.
Для дополнительной проверки происхождения полосы 300 т.п.н. на ПЭФ-профилях вирус-одержащих клонов P. bursaria был проведен ряд экспериментов по блот-гибридизации ПЭФ-профилей тотальной ДНК клонов P. bursaria с вирус-специфичным зондом. В гибридизационном паттерне ПЭФ-профилей тотальной ДНК вирус-содержащих клонов парамеций всегда получали четкий сигнал, точно соответствующий полосе, образованной ДНК размером 300 т.п.н. (Рис. 7А, д. 2, 5. Рис. 7Б, д. 2, 5). В качестве контроля использовали препараты ДНК чистых вирусов. Эта ДНК также образовывала на ПЭФ-профилях полосу в области 300 т.п.н. (Рис. 7 А, д. 1, 3, 4, 6) и давала яркий сигнал при гибридизации (Рис. 7 Б, д. 1, 3, 4, 6). При гибридизации тотальной ДНК безвирусных клонов P. bursaria с вирус-специфичным зондом сигнала гибридизации не выявляли. На основании результатов по гибридизации, а также на основании того, что полоса образована ДНК размером 300 т.п.н., что соответствует размеру генома вируса (Van Etten et al., 2003) сделали выводы о том, что на ПЭФ-профилях тотальной ДНК клонов Р. bursaria в области 300 т.п.н. присутствует ДНК вирусов хлорелл, - это неинтегрированная геномная ДНК.
При гибридизации мы использовали два варианта зондов; в одном использовали зонд, полученный с матрицы вируса PBCV-1 (NC64A типа), в другом - с матрицы вируса PBCV-2L (Pbi типа). Оказалось, что сигнал гибридизации был ярче в тех случаях, когда для получения зонда в качестве матрицы использовали ДНК вируса такого же типа, который присутствовал в клоне P. bursaria по результатам микробиологического тестирования (Рис. 7Б, д. 2). При гибридизации с зондом, полученным с матрицы вируса другого типа, сигнал был относительно слабее (Рис. 7Б, д. 5).
Локализация вирусных частиц в симбиотической системе P. bursaria -Chlorella — вирус
Результаты, полученные нами, исключают всякие сомнения о том, что в природе существуют клоны, в которых содержатся инфекционные вирусные частицы. В этих же клонах на ПЭФ-профилях выявляется геномная ДНК вирусов, а на микрофотографиях выявляются вирусные капсиды. При разрушении клетки парамеции симбиотические хлореллы клеток такого клона мгновенно инфицируются вирусами. Такую систему по всем признакам можно назвать трехкомпонентной симбиотической системой P. bursaria - Chlorella — вирус.
Наряду с этой симбиотической системой в природе существует система P. bursaria - Chlorella, в которой не обнаруживаются ни инфекционные частицы, ни вирусные капсиды, ни геномная вирусная ДНК.
Разделение на вирус-содержащие и безвирусные системы было предложено ранее (Migunova et al., 1996). В нашей работе мы полностью подтвердили такое разделение и, благодаря проведенному нами комплексному исследованию данных симбиотических систем и вирусов, эта характеристика стала более ясной и точной. На основании анализа большой выборки клонов P. bursaria, полученных из удаленных географических точек, мы предположили, что характеристика «безвирусная» система или «вируссодержащая» система относится к единичной клетке, из которой был получен клон. При изоляции клонов инфузорий и дальнейшем культивировании симбиотическая система остается либо свободной от вируса, либо вируссодержащей (Мигунова и др., 1999). На сегодняшний день, недостаточно данных, чтобы объяснить существуют ли другие физиологические или генетические различия между клонами P. bursaria, содержащими вирусы, и безвирусными клонами.
В связи с вышесказанным важно упомянуть результаты проведенного нами эксперимента по инкубации вирусов с клетками P. bursaria и Р. caudatum. В ходе этого эксперимента было установлено, что вирусы установили ассоциации именно с клетками P. bursaria, но не с клетками Р. caudatum. На основании этого, можно предположить, что именно поверхность P. bursaria несет некие лиганды или рецепторы, которые ответственны за взаимодействия с вирусами хлорелл. Вопрос о возможном происхождении таких лигандов или рецепторов остается открытым. Мы не знаем, возможно ли установление ассоциации вирус - хлорелла, к примеру, с природным клоном P. bursaria, в цитоплазме которого не содержатся симбиотические хлореллы. В перспективе, проведение такого эксперимента представляется, несомненно, необходимым.
В экперименте по добавлению вируса мы использовали клон Р. bursaria AZ 17-5 - это исходный безвирусный клон, выделенный из той же природной популяции, что и клон AZ 17-2, содержащий вирусы Pbi типа и подробно исследованный нами с применением ТЭМ. Для клонов AZ 17-5 и AZ 17-2 ранее было показано наличие в цитоплазме хлорелл Pbi (северного) типа (Kvitko et al., 2007). Таким образом, мы считаем, что природный безвирусный клон AZ 17-5 по своим характеристикам (принадлежность к 2 сингену, тип хлорелл, популяция) - близок к клону AZ 17-2. Результаты эксперимента подтвердили, что после инкубации вирус Pbi типа был обнаружен на поверхности клеток клона AZ 17-5. Остается открытым вопрос о том, почему в природе данная система оставалась безвирусной. На основании проведенного эксперимента вы не можем утверждать, что установилась искусственная система вирус-парамеция. Для подтверждения этого необходимо длительное культивирование такой системы.
Хорошо известно, что вирусы высокоспецифичны к хлореллам одного типа либо NC64A, либо Pbi (Van Etten et al., 1991). С другой стороны, существуют хорошие подтверждения тому, что существует предпочтение парамеции по отношению к своему «штамму» симбионта (Summerer et al., 2007). Поскольку мультипликация вирусов на хлореллах «несоответствующего» типа невозможна (Van Etten et al., 1991), было бы логично предположить, что в природе отобрались системы, в которых присутствуют хлореллы и вирусы одного типа. Это подтверждается рядом наблюдений.
Для одного исследованного в нашей работе клона известно, что присутствующие в нем вирусы и хлореллы относятся к одному экотипу. Результаты сопоставления типа вируса и сингена P. bursaria, в ассоциации с которой он был обнаружен, показали, что тип вируса коррелирует с сингеном: вирусы Pbi типа были обнаружены в клонах сингенов 1 и 2, вирусы NC64A типа в клонах сингенов 3 и 4. Нетипичным можно считать обнаружение вируса NC64A типа в клоне парамеций первого сингена из Таджикистана, это единственная точка обнаружения сингена 1 так далеко на юге. Хлореллы, выделенные из этого клона, нетипичны по ряду молекулярных характеристик: в гене 18S рДНК обнаружен нетипичный интрон, по этому признаку хлореллы отличаются и от южных, и от северных хлорелл (Vorobyev -et al., in press). На основании этого сделали вывод, что присутствие вируса NC64A типа также аномально. Таким образом, мы предположили, что существует специфичность вируса по отношению к парамеции определенного сингена, и, следовательно, парамеция определенного сингена содержит определенный тип хлорелл: сингены 1 и 2 - хлореллы Pbi типа, сингены 3 и 4 - хлореллы NC64A типа. Существование специфичности между сингеном парамеции (для двух сингенов) и типом хлореллы также подтверждалось ранее (Hoshina et al., 2005).
