Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Особенности пигментного аппарата зеленых водорослей 6
Глава II. Каротиноиды зеленых водорослей
1. Общая характеристика пигментов и правила их номенклатуры 9
2. Первичные каротиноиды Chlorophyta 14
3. Вторичные каротиноиды Сhlorophyta 19
Глава III. Каротиноиды в кислородном фотосинтезе
1. Локализация и некоторые функции первичных каротиноидов 23
2. Каротиноиды и фотодинамическое действие 30
3. Локализация вторичных каротиноидов 36
4. Виолаксантиновый цикл 39
5. Свет и каротиногенез 45
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава ІV. Объект и методы исследования
1. Объект исследования и его культивирование... 49
2. Качественное и количественное определение фотосинтетических пигментов 51
3. Полярографическое определение фотосинтетической активности 58
Глава V. Хлорофиллы и общее содержание каротиноидов в клетках Chloreila зр.к в разных условиях культивирования
1. Ростовые характеристики 60.
2. Фотосинтетические пигменты 64
Глава VІ. Качественный состав каротиноидов chlorella ар. . 76
Глава VII. Количественное соотношение индивидуальных каротиноидов Chlorella sp.K в разных условиях культивирования
1. Влияние типа питания на каротиноидный состав клеток 92
2. Влияние спектрального состава света на соотношение каротиноидов в клетках 95
Глава VIII. Фотосинтетическая активность культуры Chlorella зр.к, выращенной в разных условиях
1. Кислородный обмен культуры, выращенной в фотоавто-, хемогетеро- и миксотрофных условиях..97
2. Кислородный обмен фотоавтотрофной культуры, выращенной при освещении белым, зеленым и красным светом 107
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗ
ВЫВОДЫ 118
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 120
- Особенности пигментного аппарата зеленых водорослей
- Общая характеристика пигментов и правила их номенклатуры
- Локализация и некоторые функции первичных каротиноидов
- Ростовые характеристики
- Качественный состав каротиноидов chlorella ар. .
Особенности пигментного аппарата зеленых водорослей
Зеленые водоросли представлены многочисленной группой неоднородных в систематическом отношении эукариот и объединяют в себе три группы высшего таксономического ранга - отделы Chlorophyta Euglenophyta 9 Charophyta ( Голлербах, Полянский, 1951; Гол-лербах с соавт., 1953; Седова, 1977). Отдел Chlorophyta объединяет два класса Volvocophyceae И Chlorococcophyceae с Двумя порядками Volvocales и Chlorococcales.
Эти растения преобладают в пресноводном фитобентосе и широко распространены в литоральной и сублиторальной зонах. Среда них встречаются свободноживущие и колониальные формы разнообразного строения и размеров: нитчатые, сифоновые, пластинчатые, в виде сильно разветвленных кустов (Гарибова с соавт., 1978).
Отделы, принятые в СССР для классификации водорослей (их всего 10), не всегда соответствуют таксонам, принятым за рубежом и обозначаемым как классы. В частности, Христенсен в отдел Chlorophyta объединяет классы Chloromonadoceae, Chlorophy-оеае. и Prasinophyceae (Christensen. 1962j "Dodge, 1974).
Советские альгологи считают целесообразным выделить евглено вые водоросли в самостоятельный отдел Euglenophyta (Голлербах с соавт., 1953).
Отделы, принятые в СССР; Классы по Христенсен ;
Euglenophyta Euglenophyceae
Chlorophyta Chloromonadophyceae
Chlorophyceae Prasinophyceae (Седова, 1977)
Правомерность выделения Eugienophyta в самостоятельный отдел подтверадается цитологическими исследованиями, проведенными на современном уровне (Седова, 1977).
В основу классификации всех водорослей положено два основных критерия: морфологический и физиологический. У эукариот в первую очередь учитывается окраска хлоропластов и на этом основании вычленяются три основные ветви, включающие зеленые и красные водоросли, а также растения, у которых преобладают желто-бурые пигменты (Голлербах с соавт., 1953). Окраска представителей каждого отдела обусловлена качественным составом и количественным соотношением трех групп пигментов: хлорофиллов, каро-тиноидов и фикобилинов. Иногда в природе встречаются бесцветные водоросли, относящиеся к разным систематическим группам: диатомеи, динофлагелляты, криптофиты, красные и зеленые водоросли ( Седова, 1977; Goodwin, 1976).
Очевидно, это явление - следствие мутации, в силу ряда экологических условий не оказавшейся летальной.
Первичные каротиноиды Chlorophyta
Цвет в начале века назвал желтые пигменты листа, выделенные при помощи предложенного им же метода колоночной хроматографии (1910, цит. по Фео$илова 1974). Однако соединения, относимые сейчас к классу каротиноидов, стали выделять из природных источников значительно раньше - в середине XIX века (Пиневич, Васильева, 1972). С той поры и до настоящего времени из природных источников растительного, микробного и животного происхождения выделено около 500 ПИГМенТОВ карОТИНОИДНОЙ природы ( Isler,I977; Eugster, 1979), причем, большая часть этих пигментов выделена в последние четверть века. Подобные результаты обусловлены развитием и совершенствованием методов химии природных соединений, которые позволяют идентифицировать сложную структуру новых пигментов и проверять точность идентификации путем их химического синтеза. Более трети известных в настоящее время каротиноидов уже синтезировано химическим путем ( isier, 1977;Eugster,1979).
Основной частью молекулы каротиноидов является полиеновая цепь, благодаря которой эти соединения относят к классу терпенов. Кроме того, их часто называют изопре владами, так как все терпены формально можно представить как вещества, происходящие путем конденсации разного числа молекул пятиуглеродного углеводорода изопрена (2-метил-1,3-бутадиена) ( isier,I977). Следует подчеркнуть, что класс терпеноидов объединяет большое число функционально совершенно отличных компонентов, сходство которых между собой определяется лишь их химическим строением.
Как и все терпены, каротиноиды хорошо растворяются в орга - 10 -нячееках растворителях, то есть являются лшшдами. Они также хорошо растворяются в ліішдах, поэтому часто каротиновды называют жири аетзорймыми пигмштами.
Согласно последним правилам, принятым Комиссией ЙЮПАК, каро-тиноиды являются классом углеводородов /каротины/ и их окисленных производных /ксантофіла/, состоящих из девяти изопреновых единиц. Эти изопреновые единицы расположены таким образом, что две центральные метильные группы каротиноидов находятся в положении1 1,6, а оставшиеся нетерминальные метильные группы оказываются в положений 1,5( рис.1 ). Все каротиноиды формально могут быть представлены из ациклической Sftfi СТРУКТУРН» обладающей длинной центральной цепью конъюгированных двойных связей при помощи: I/ гидрирования; 2/ дегидрирования; 3/ циклизации; 4/ окисления; а также при помоїр сочетания указанных реакций. Этот класс соединений включает также определенные продукты, которые могут быть образованы сокращением или деградацией углеродного скелета молекулы. При этом в молекуле должны сохраняться центральные метильные группы (IUPAC-IUB Comission, 1972 " . J. Правила описывают BGe возможные структурные модификации каротиноидов, используя только 6 различных названий для концевых групп молекулы: }р,р, е, к,ф, 9с# Из этих групп только четыре - , ,. ув стре-чаются у каротиноидов высших растений (Davies, 1981). При обозначении обычных каротиноидов для каждого из концов молекулы применяется название соответствующей группы/s, j-каротин; егка-ротин и т.д. (рис. I ).
Локализация и некоторые функции первичных каротиноидов
Вопрос о функции биологических соединений всегда бывает тесно связан с вопросом об их локализации в биологических системах, их взаимодействии с другими клеточными компонентами, то есть с условиями, при которых химические свойства соединения.могут реализоваться в виде биологических свойств.
Обобщение имеющихся на сегодняшний день данных позволяет заключить, что у всех фотосинтезирующих организмов основная часть каротиноидов ассоциирована с фотосинтетическими мембранами ( Кондратьева, 1972; Самуилов, 1983; Foi-k, Brown, 1975;Weedon, З979;Mathis,Schenck, 1982;Wloch,Wieckowsk$1982} Каротиноиды красных, бурых, синезеленнх водорослей и высоких растений локализованы в соответствующих структурах, несущих эти мембраны: хлоропластах, ламеллах или тилакоидах (Goedheer,1979). Именно связь с фотосинтетическими мембранами и непосредственная близость к хлоролмллу - основному фотосинтетическому пигменту - стала причиной того, что все структурное многообразие природных форм каротиноидов свели к единому понятию "сопровождающие пиг-менты фотосинтеза". Давлеющая роль этой традиционной терминологии постоянно ощущается в подходах к изучению функций каротиноидов, особенно у фотосинтезирующих организмов.
В настоящее время не существует сколько-нибудь надежных цитохимических методов для определения локализации каротиноидов (Петрушка, 1979 ) . Локализацию каротиноидов продолжают определять путем извлечения пигментов из клеток или клеточных ор- , ганелл с последующей идентификацией пигментов. Поэтому значительные успехи в этой области были достигнуты после совершенствования методов выделения иптактиых оогаяелл и биологически активных (и даже инактивированннх) субъединиц определенной степени автономности.
Одним из методических приемов для выяснения молекулярной организации фотосинтетического аппарата является разрушение фотосинтетических мембран иорганелл при помощи детергентов. Специфические хлорофилл-содержание белки затем фракционируют при помощи SDS -гель электрофореза (Ean,Thornber,1976; Tliornber, 1975).
В настоящее время считается установленным, что все молекулы хлорофилла существуют в виде комплексов с белками ((5quist, Samuelsson, 1980). К концу 60-х годов выяснилось, что и липо-фильные каротииоиды в фотосинтетических мембранах существуют в виде комплексов с белком. Причем большая часть каротиноидов входит в состав хлорофилл-белковых комплексов фотосинтетических мембран. Накопленный за последние 10-15 лет экспериментальный материал с очевидностью показывает, что все пигмент-белковые комплексы фотосинтетических мембран высших растений и зеленых водорослей по существу можно свести к трем основным видам, которые отличаются по ряду характеристических показателей: молекулярной массе, составу и соотношению в них пигментов и спектральным свойствам. Эти комплексы локализуются в субхлоропластных частицах с разной степенью фотохимической активности Mathis,Schensk,1982).
Ростовые характеристики
Для растительных организмов, конструктивный и энергетический метаболизм которых связан с фотосинтезом, главным экологическим фактором является свет.
В отличие от высших растений большинство водорослей (в том числе и зеленые водоросли) способны к хемогетеротрофному развитию. Гибкость систем адаптации этих растений к разным типам питания определяет высокую жизнеспособность представителей Chlorophyta В ПрИрОДНЫХ УСЛОВИЯХ.
Зеленые водоросли обитают на разных глубинах природных водоемов, где спектральный состав проникающего света определяется глубиной и разнообразными соединениями, растворенными и взвешенными в воде. Поэтому способность пигментных систем зеленых водорослей приспосабливаться и к спектральному составу света также дает им экологическое преимущество.
Целью работы, представленной в настоящей главе, было исследование общей реакции пигментов chlorella зр.к на изменяющиеся условия существования: разный спектральный состав света при фотоавтотрофном развитии. Исследовалось также состояние пигментов в отсутствие фотосинтеза и при миксотрофном типе питания культуры.
Ростовые характеристики.
Изучению пигментного состава в индивидуальных пигментов в динамике роста водорослей в периодическом режиме предшествовало снятие традиционных ростовых кривых, позволяющих в каждом изученном варианте в условиях опыта выбрать точки, в которых популяции клеток водоросли находятся в относительно к одинаковых физиологических состояниях, т.е. на одинаковых стадиях ростового цикла.
В качестве таких точек для характеристики динамических изменений пигментного аппарата водоросли были выбраны середина и конец экспоненциальной фазы и начало стационарной фазы.
Выращивание термофильной зеленой водоросли сhioreНа sp.I осуществляли при 35С в двух режимах, различающихся освещенностью и интенсивностью аэрирования. Условия для менее интенсивного роста создавали при выращивании на качалке-люминостате для более интенсивного роста культуры - в плоских сосудиках т установке, собранной при консультации проф. В.Е.Семененко и старшего научного сотрудника М.Г.Владимировой, за что автор выражает им искреннюю благодарность.
Качественный состав каротиноидов chlorella ар.
Каротиноидный состав клеток природных штаммов зеленых водорослей как правило, соответствует составу каротиноидов зеленых листьев высших растений Сн&ввЕу Stransky, 1970ь; Stramsby, Eager, 1970; Liaaem — Jensen, 1977; Goodwin, 197в}. Однако содержание желтых пигментов в клетках водорослей подвержено значительным колебаниям в зависимости от условий их развития (Ли, Титлянов, 1978; Титлянов, Ли, 1978). Существует также большое число пигментных мутантов зеленых водорослей (полученных искусственным путем или же иногда образующихся в процессе лабораторного культивирования водорослей , отличающихся по составу желтых пигментов от природных штаммов.
Поэтому при исследовании качественного состава и количественного содержания каротиноидов селеционного шт зеленой водоросли в изменяющихся условиях культивирования, а также при разном физиологическом состоянии культур (в динамике их развития) следует прежде всего выбрать метод, который позволит решить поставленные задачи.
В настоящее время для выделения каротиноидов из природных объектов применяют колоночную и тонкослойную хроматографию, а также высокоэффективную жидкостную хроматографию. В нашей работе мы лишены были возможности использовать последний метод, поэтому необходимо было сделать выбор между колоночной и тонкослойной хроматографией. Известно, что колоночная хроматография иногда позволяет более корректно выделить и идентифицировать природные соединения, однако, как правило, этот метод более продолжительный и требует больших количеств. Поэтому мы решили воспользоваться тонкослойной хроматографией и проверить качество разделения каротиноидов в разных системах адсобент-растворитель. Подобранная система должна была отвечать трем условиям: I. Выявлять максимальное число каротиноидов Chlorella sp. К одновременно и таким образом, чтобы каждая хроматографическая зона четко отделялась от соседних ,{ддя корректного количественного анализа индивидуальных каротиноидов) 2. Надежно выявлять новые каротиноиды, которые могут появиться в клетках при смене условий культивирования. 3. Хроматография в подобранной системе адсорбент-растворитель должна была минимально (и сходным образом при разных условиях) разрушать пигменты при разделении.
В этих целях были опробованы следующие сорбенты: окись алюминия щелочная и нейтральная - разной степени активности - незакрепленный и закрепленный слой; целлюлоза порошковая и силика-гель КСК - незакрепленный и закрепленный слой, а также готовые пластинки с закрепленным слоем силикагеля "Silufol, w-54№ и "Merk, JtLeselgel- 60w.
