Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Клеточная пролиферация в эпителиальных тканях млекопитающих 7
1.1. Суточные и сезонные ритмы митотической активности в покровных эпителиях 7
1.2. Влияние стресса на митотическую активность в покровных эпителиях 17
1.3. Применение радиоавтографии при изучении кле точного цикла в тонкой кишке млекопитающих .20
Глава 2. Материал и методы исследования 23
2.1.Полевые методы 23
2.2.Экспериментальный метод 27
2.3. Гистологическая обработка материала 28
2.4.Метод радиоавтографии 28
2.5.Математическая обработка данных 29
Глава 3. Суточные и сезонные ритмы митотической активности в эпителии роговицы желтогорлых мышей .32
3.1. Суточный ритм митозов в эпителии роговицы желтогорлых мышей 32
3.1.1. Весной 32
3.1.2. Летом 37
3.1.3. Осенью .44
3.1.4. Зимой 52
3.2. Сезонные изменения митотической активности в эпителии роговицы желтогорлых мышей 57
3.2.1. Взрослые самки 57
3.2.2. Взрослые самцы 61
3.2.3. Молодые особи 63
Глава 4. Суточные и сезонные ритмы митотической активности в эпителии роговицы обыкновенных полевок .66
4.1. Суточный ритм митозов в эпителии роговицы обыкновенных полевок 66
4.1.1. Весной 66
4.1.2. Летом 73
4.1.3. Осенью ,.78
4.1.4. Зимой 85
4.2. Сезонные изменения митотической активности в эпителии роговицы обыкновенных полевок 91
4.2.1. Взрослые самки 91
4.2.2. Взрослые самцы 94
4.2.3. Молодые особи 96
Глава 5 Влияние стресса (присутствие хищника-ласки) на уровень митотической активности в эпителии роговицы обыкновенных полевок 110
Глава 6 -Среднесуточный митотический индекс как показатель суточной активности и обменных процессов организма 107
Заключение ІТ5
Выводы 118
Литература 120
Приложение 134
- Влияние стресса на митотическую активность в покровных эпителиях
- Гистологическая обработка материала
- Сезонные изменения митотической активности в эпителии роговицы желтогорлых мышей
- Сезонные изменения митотической активности в эпителии роговицы обыкновенных полевок
Введение к работе
Биологические ритмы проявляются на разных уровнях организации (Соколов, Кузнецов, 1978) и выступают в качестве одного из важных факторов поддержания функционирования организмов. В частности, митотическое деление клеток лежит в основе таких жизненно важных морфогенетических процессов как рост и развитие, поддержание постоянства клеточного состава обновляющихся тканей (Мамонтов, 1983).
Детальные исследования биологических ритмов помогают решению многих задач в области медицины, практики сельского и охотничьего хозяйства. На необходимость изучения биологических ритмов указывали В.И. Вернадский (1932, 1975); В.А. Эн-гельгардт, I960; Н.В. Доброхотов, 1963; И.А. Алов, 1964; Н.А.Агаджанян, 1975; Ю.А. Романов, 1980; Г.Д. Губин, Е.Ш.Гер-ловин, 1980 и многие другие.
В настоящее время исследованию биологических ритмов уделяется все возрастающее внимание. Однако несмотря на это, многие параметры биологических ритмов исследованы недостаточно (Соколов, Кузнецов, 1978).
Дикие млекопитающие, находясь по сравнению с лабораторными в совершенно другой экологической обстановке, имеют свои особенности поведения и протекания физиологических процессов в организме (Кузнецов, 1970). В связи с этим изучение закономерностей суточного ритма митозов и его сезонного изменения в тканях диких млекопитающих представляет большой интерес для понимания роли пролиферативных процессов в приспособлении к среде существования того или иного вида. Важно выяснить, как зависит ритм клеточного деления тканей от ритма активности организма в суточном и сезонном аспектах, т.е. как связаны
суточные ритмы, проявляющиеся на уровне клеточной популяции и организма. Изучение клеточного деления мелких млекопитающих позволит подойти к детальному выяснению физиологических и экологических процессов на цитологическом уровне.
Суточные и сезонные ритмы деления клеток у диких хивот-ных почти не изучены. По отдельным сезонам года имеются лишь отрывочные данные. В литературе отсутствуют данные об изменении суточного ритма митозов в течение годового цикла, хотя для понимания адаптивных реакций животных каждого вида, этот показатель имеет важное значение. Тот или иной образ жизни отражается на функционировании различных уровней систем животного. Следует ожидать, что различный суточный образ жизни будет оказывать влияние на характер протекания физиологических, биохимических и других процессов в организме.
Надо отметить, что оценка сезонных изменений интенсивности деления клеток у диких животных ранее проводилась без учета суточного ритма митозов. Обычно сравнивались показатели митотической активности только в определенные часы суток, чаще всего в утренние часы. Однако такое сравнение приводит к неправильной оценке интенсивности деления клеток у диких животных в отдельные сезоны года. В этой связи нами изучалась кинетика клеточного деления в различные сезоны года у видов мелких млекопитающих с различной экологией - желтогорлых мышей и обыкновенных полевок.
При оценке интенсивности пролиферации клеток у разных сезонных и возрастных групп желтогорлых мышей и обыкновенных полевок мы использовали среднесуточный показатель митотической активности.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы - выяс-
- б -
нить закономерности и особенности изменения суточной митотической активности в эпителии роговицы у разных возрастных и половых групп желтогорлых мышей и обыкновенных полевок во все сезоны года.
В задачи исследования входило: Т) выяснение суточной динамики деления клеток у желтогорлых мышей и обыкновенных полевок; 2) изучение интенсивности пролиферации клеток в различные сезоны года; 3) определение влияния стресса (присутствие хищника-ласки) на уровень митотической активности в эпителии роговицы обыкновенных полевок; 4) изучение клеточного цикла в тонкой кишке желтогорлых мышей и обыкновенных полевок; 5) разработка метода отлова мелких млекопитающих в живоловки с применением дистанционной сигнализации.
.-7-
Влияние стресса на митотическую активность в покровных эпителиях
Явление стресса было описано впервые Г.Селье (1936). Он обратил внимание на то, что организм при действии на него различных раздражителей физической или химической природы реагирует появлением неспецифических признаков. Заслуга Г.Селье заключается в том, что между неспецифическими признаками он увидел определенную связь, отражающую характер защитной реакции организма на повреждающее воздействие (Панин, 1983). Первая работа Г.Селье дала толчок многочисленным исследованиям по различным вопросам стресса. Да и сам ученый развил свою идею в последующих работах (Селье, I960; Selye, 1973, 1974).
Многие исследователи, признав теорию стресса, перестали придавать значение главному: что стресс - это стереотипная реакция в ответ на сильный раздражитель, на "любую трудную задачу", "непомерные требования" (Селье, 1977), а не на раздражитель вообще (Гаркави и др., 1980). И.А. Аршавский (1976, 1980) считает стресс, описанный Г.Селье, "патологическим" и говорит о необходимости выделения" физиологического стресса".
Впервые о возможности существования качественно другого, чем стресс, состояния организма, также приводящего к повышению неспецифической резистентности, но физиологам путем отметил Н.В. Лазарев (1963). Им описано состояние неспецифически повышенной сопротивляемости, развивающееся под влиянием особой группы веществ (элеутерококка колючего, женшеня), которые он объединил под названием "адаптогены". Многочисленные исследования показали, что последние в малых дозах повышают неспецифическую резистентность и защищают организм от стрессоров,Брехман, 1957, 1968; Кириллов, 1964; Розин, 1966; Дардымов, 1976 и др.), а в больших (дибазол и женьшень) приводят к изменениям, например, в эндокринной системе, характерных для стресса (Розин, 1966; Петков, 1974; Дардымов, 1976 и др.).
Мы в своей работе руководствовались формулировкой понятия "стресс": I) адаптационная реакция организма на слабые воздействия - "реакция тренировки"; 2) на воздействия средней силы, промежуточные между слабыми и сильными - "реакция активации"; 3) на сильные, чрезвычайные воздействия - стресс (Гар-кави, 1968, 1969; Квакина, Уколова, 1969; Уколова, Бордюшков, Гаркави, 1968).
Вопрос о влиянии раздражителей на митотическую активность у диких млекопитающих относится к числу малоизученных. Реальная жизнь животных подвергается целому ряду чрезвычайных воздействий (голод, встреча с опасностью, перепады окружающей среды и др.), вызывающих интенсивный стресс (Кириллов, 1973, 1977). По данным Fisker et al.,(1982, 1983), С.Г. Мамонтова (1983) и др., внешнее воздействие приводит к серьезным изменениям кинетики клеточных процессов. Такие изменения могут привести к заблуждениям при анализе результатов по пролиферации клеток и неправильным истолкованиям полученных данных.
По мнению J .Woods (1957), дикие животные более адапти рованы к стрессу, чем лабораторные и домашние, тем не менее эта проблема заслуживает всестороннего внимания. Почти все работы по изучению влияния различных внешних раздражений на интенсивность размножения клеток, главным образом, выполнены на лабораторных животных. Показано, что пересадка крыс из одной клетки в другую, шум, подкожные инъекции физиологического раствора, привязывание животных к станку и другие манипуляции приводят к уменьшению митотической активности в эпителии роговицы ( Fridenwald, Busche, 1944; Стрелин, Козлов, 1959). Аналогичные изменения были обнаружены при общем возбуждении мышей после перенесения клетки с животными в комнату, в которой находились кошки. Возбуждение, вызванное страхом, сопровождалось уменьшением пролиферации клеток в эпителии роговицы (Gyergyay,Hadnagy, 1955). Снижение митотической активности происходит и при изменении состава однородной группы животных. Уже через 15 минут, после удаления части мышей из общей клетки, отмечается торможение интенсивности размножения клеток в эпителии роговицы у оставшихся животных (Уткин, Косиченко, 1956).
В более поздних работах внимание многих исследователей влияния разных раздражителей на митотическую активность в эпителиальных тканях было направлено на изучение интенсивности размножения клеток в условиях хронического стресса. Е.И. Мельник, С.С. Тимошин (1984) изучали влияние хронического стрессового воздействия на процессы клеточного деления эпителия роговицы и языка лабораторных животных. Хроническое стрессовое воздействие моделировали ежедневным IjI/2 ч. охлаждением животных до 30-28С в течение 28 суток. Авторы установили, что воздействие стресса в течение 28 суток приводит к незначитель ному повышению МИ (от 5,6 до 6,2%о) в эпителии роговицы и незначительному снижению МИ в эпителии языка (от 7,4 до 6,7%о), в то время как 35-суточное стрессовое воздействие привело к резкому падению МИ в эпителии роговицы (от 10,6% в контроле до 4,0 в опыте).
Взаимодействие внешних факторов с митотическим ритмом в эпителии защечного мешка у хомячка изучал U.M0ler (1978). Автор при 12-часовом световом периоде в сутки в качестве дополнительно синхронизирующего фактора использовал прерывистый шум со звуковым давлением 60-70 дб. Такая обработка животных приводила к увеличению МИ в эпителии и ускорению его нараста-ниядо максимальных величин. Эффект усиливался с ростом уровня шума и зависел от условий обращения с животными. Инъекция меченного тимидина сама по себе вызывала усиление МИ в первые часы после инъекции. Полученные данные показывают, что воспроизводимые кривые митотической активности можно получить лишь при правильном учете влияния целого ряда внешних факторов.
Изложенные данные показывают, что влияние стрессовых ситуаций на клеточную пролиферацию, в особенности на суточный ритм деления клеток, нуждается в дальнейшей разработке.
Гистологическая обработка материала
Для изучения митотической активности у желтогорлых мышей ирбыкновенных полевок нами была выбрана роговица глаза, как наиболее простой для обработки объект. В то же время процессы, происходящие в роговице, отражают многие энергетические процессы в целом организме (Уткин, 1959; Уткин и др., 1961 и мн. др.).
Перед окраской роговицу вырезали по краю радужной оболочки глаза бритвенным лезвием или глазными ножницами. Затем роговицу хорошо промывали в дистиллированной воде и окрашивали кармином (Кублицкене, 1978). Разрез роговицы на 4 сектора мы осуществляли бритвенным лезвием в чашке Петри с абсолютным спиртом. Проводка через спирты и карболбензол была обычная (70 - 80 - 90 - 96 - абс.1 - абс.2 - карболбензол - бензол),после чего роговицу помещали на предметное стекло и заключали в бальзам. Приготовленный препарат на некоторое время держали в винтовых зажимах. Это давало возможность получить ровный тотальный препарат эпителия роговицы.
Методом авторадиографии была исследована длительность митотического цикла и его фаз в эпителии тонкой кишки желтогорлых мышей и обыкновенных полевок. Определение времени параметров митотического цикла проводилось графическим методом, разработанньм Квастлером и Шерманом (Quastler, Sherman, 1959). Меченый тимидин вводили внутрибрюшинно в дозе I мкКи/г. Материал для исследования брали через 30 мин., 1,5 и 2 ч. после введения изотопа и далее с интервалами 1-2 ч. Удельная активность изотопа - от 22 до 26,8 Ки/мМ. Срезы покрывали жидкой фотоэмульсией типа "М", экспозицией при 4С в течение 3-4 недель. Препараты проявляли по общепринятой методике и окрашивали гематоксилин-эозином. Для каждого срока анализировалось в среднем 100 митозов у 4-5 животных.
Подсчет клеток и митозов производили под бинокулярным микроскопом (ок. 7, об. 90х) по двум взаимноперпендикулярным линиям, пересекающим центр роговицы. Для каждого животного просматривали 100 полей зрения. Вследствие того, что у молодых полевок роговица имела маленький диаметр (менее 50 полей зрения на линии, пересекающей центр роговицы), мы у этих зверьков производили подсчет по 4 линиям: первыецве - взаим-ноперпендикулярные через центр роговицы и вторые - соответственно параллельные первым, спустя несколько полей зрения от первых. Подсчет клеток и митозов у молодых особей производили в роговице обоих глаз.
В каждом препарате роговицы учитывали профазы, метафазы, анафазы и телофазы. Поле зрения ограничивалось площадью при помощи специальных рамок размером 8x8 мм, помещенных в окуляры микроскопа. Митотический индекс (МИ) высчитывали в промилле (%о), пользуясь формулой где ЕМ - сумма митозов, ЕКл. - сумма клеток у исследованных животных (Епифанова, 1965).
Для определения числа клеток в одном поле у исследуемого вида просчитывали 100 полей зрения на препаратах разных сроков забоя каждого сезона и выводили среднее арифметическое число клеток на I поле зрения. Оно оказалось следующим: весной у взрослых самцов желтогорлых мышей - 199-1,94, у взрослых самок - 198 2,09; летом у взрослых самцов - 203±2,03, у взрослых самок - 207±2,12, у молодых особей - 219±2,36; осенью у взрослых самцов - 199-2,90, у взрослых самок - 198±2,84, у молодых желтогорлых мышей - 200±2,45 и зимой у взрослых самцов - 192±2,32, у взрослых самок - 190±1,90 и молодых мышей -193±2,69.
Среднее арифметическое число клеток на I поле зрения у обыкновенных полевок составило: весной у взрослых самцов -248 3,84, у взрослых самок - 256-3,22; летом у взрослых самцов - 255±3,91, у взрослых самок - 26І±4,2І, у молодых полевок - 262±4,20. Осенью у взрослых самцов - 253 2,34, у взрослых самок - 249 2,52, у молодых особей - 257 1,70; зимой эта цифра у взрослых самцов составляла - 248±2,42, у взрослых самок - 247±2,75 и молодых обыкновенных полевок - 254- »
Сезонные изменения митотической активности в эпителии роговицы желтогорлых мышей
По данным, приведенным в таблицах 2, 4, 7 и 10 видно, что самая низкая митотическая активность в эпителии роговицы взрослых самок желтогорлых мышей -в течение суток в 3 ч. в сезонном аспекте обнаружена весной (МИ - 0,01%о). Летом она в эти часы достоверно повышается (табл. 5, Приложение). Осенью интенсивность деления клеток в 3 часа ночи такой же самой величины как летом. В зимний сезон она в эти часы суток повышается и достигает наивысшей величины в течение года. Надо отметить, что интенсивность размножения клеток зимой по сравнению с летним и осенним сезонами, повышается на достоверную величину.
В б ч. по сравнению с предыдущим сроком отмечается повышение интенсивности пролиферации клеток во все сезоны года (рис. 7.). В отдельные сезоны колебания митотической активности в эти часы суток незначительны и не достигают достоверных величин. Амплитуда колебаний МИ - от 0,3 до 1,Ъ%о. В следующий срок, т.е. в 9 ч., наибольшая интенсивность деления клеток в эпителии роговицы взрослых взрослых самок желтогорлых мышей отмечается весной с МИ 3,9%о. В другие сезоны года она в эти часы постепенно понижается. Достоверные различия интенсивности размножения клеток в 9 ч. 1наружены только в сезонах весна-зима. В 12 ч. пролиферация теток наибольшей величины достигает осенью (МИ - 12,3%о). Зимой она в эти часы незначительно снижается, а весной - повышается. В 12 ч. летом интенсивность деления клеток наиболее низкая в сезонном аспекте. Она достоверно ниже таковой в эпителии роговицы взрослых самок желтогорлых мышей, обнаруженной в весеннем и осеннем сезонах.
В следующий срок, т.е. в 15 ч., наибольшей интенсивности размножение клеток, почти одинаковой величины достигает летом и осенью (соответственно МИ - 22,8 и 21,7%), а самая низкая - падает на зимний сезон. В 18 ч. митотическая активность наибольшей величины зарегистрирована летом с МИ - 18,1%е. Затем, в эти часы в следующие сезоны, т.е. осенью и зимой - понижается. Продолжая понижаться к весне, интенсивность размножения клеток в сезонном аспекте падает до самой низкой величины. В 18 ч. различия МИ недостоверны периодов осень-зима и зима-весна.
В 21 ч., как и в предыдущие два срока, т.е. в 15 и 18 ч., наибольшая интенсивность пролиферации клеток зарегистрирована летом (МИ - 5,8%о). Осенью она в эти часы незначительно понижается. Продолжая понижаться к зимнему сезону, интенсивность деления клеток в эти часы падает до самой низкой степени, а весной опять повышается. Различия МИ в 21 ч. периодов зима лето, зима-осень и весна-осень достоверны.
В 24 ч. интенсивность размножения клеток очень низкая (амплитуда колебаний МИ - от 0,01 до 0,24%о). Но все таки в осеннем сезоне МИ достоверно выше этого показателя интенсивности деления клеток летом, зимой и весной.
Из вышеизложенного следует, что митотическая активность в эпителии роговицы взрослых самок желтогорлых мышей во все сезоны года носит монофазный характер с наибольшой интенсивностью деления клеток в 15 ч. Наиболее плавно она проходит в утренние часы, т.е. в б ч., а более динамично в сезонном аспекте - в ночные и вечерние часы (в 3 и 18 ч.), когда происходит перестройка фаз интенсивности двигательной активности.
Сезонные изменения митотической активности в эпителии роговицы обыкновенных полевок
Из данных, приведенных в таблицах 12, 14, 17, 20 и рисунке 16, видно, что митотическая активность в эпителии роговицы взрослых самок обыкновенных полевок в 3 ч. в течение года достигает наибольшей величины в летнем сезоне (МИ - 8,5%о). К осени в эти часы она снижается на не достоверную величину (табл. 15 в Приложении). Зимой в 3 ч. наблюдается самая низкая интенсивность пролиферации клеток в сезонном аспекте. В следующий сезон, т.е. весной по сравнению с зимним периодом отмечается заметное ее повышение.
В б ч. во все сезоны года интенсивность деления клеток в эпителии роговицы взрослых самок обыкновенных полевок изменяется плавно (амплитуда МИ - 2,08%о) и только в промежуточных сезонах весна-осень отмечены ее достоверные различия. В следующие часы, т.е. в 9 ч. самая высокая интенсивность размножения клеток отмечается весной с МИ - 4,0%о. Летом и осенью она снижается на достоверную величину. Зимой митотическая активность по сравнению этого процесса в осенний период незначительно повышается. В 12 ч. летом обнаруживается наибольшая интенсивность деления клеток в течение суток и в течение всех сезонов года (МИ - 11,8%о). Осенью она резко понижается. К зимнему сезону продолжает понижаться, но на не достоверную величину. Весной в эти часы суток наблюдается заметное повышение интенсивности размножения клеток. В следующий срок, т.е. в 13 ч., отмечается довольно сходная и мало отличающаяся интенсивность пролиферации клеток во все сезоны года. Амплитуда колебаний МИ - от 2,9 до 5,0). В 15 ч. зарегистрирована наибольшая динамичность размножения клеток в течение года. В эти часы различия МИ в эпителии роговицы взрослых самок обыкновенных полевок всех сезонов, кроме промежуточных лето-зима - статистически достоверны. Амплитуда колебаний МИ в эти часы - от 2,5 до 8,7 о.
После вышеуказанного срока, т.е. в 16 ч., во все сезоны года наблюдаюлзся недостоверные различия МИ в эпителии роговицы. В 18 ч. весной и летом зарегистрирована схожая интенсивность пролиферации клеток (МИ соответственно равняется 4,1 и 4,0%о), которая по сравнению ее в осенний и зимний сезоны намного выше. Различия МИ в эти часы достоверны летнего- осеннего, зимнего-весеннего и летнего-зимнего сезонов.
В последующие часы, т.е. в 20 часов, наибольшей интенсивности пролиферация клеток достигает зимой с МИ - 4,0%. Весной незначительно снижается, а летом отмечается незначительное по вышение. Осенью она в эти часы падает до самой низкой степени в сезонном аспекте.. Различия интенсивности размножения клеток достоверны сезонов лето-осень и осень-зима. В 21 ч. митотичес-кая активность в эпителии роговицы взрослых самок обыкновенных полевок во все сезоны года довольно одинакова. В эти часы наибольший МИ обнаружен осенью (МИ — 5,8%о). Зимой и весной он постепенно снижается, а летом опять начинает повышаться. Различия МИ в 21 час в эпителии роговицы во все сезоны года недостоверны. В 24 часа, как и в 21 ч., различия пролиферации клеток всех сезонов года недостоверны. Наибольший МИ в эти часы обнаружен в зимнем сезоне с МИ - 7,0% . Весной и летом он понижается на одинаковую величину, а осенью достигает самой низкой величины.
Из вышеизложенного следует, что митотическая активность в эпителии роговицы взрослых самок обыкновенных полевок довольно ровно проходит во все сезоны года в 13, 16, 21 и 24 ч. В эти сроки суток в сезонном аспекте не обнаружено достоверных различий МИ, т.е. митотическая активность изменяется равномерно. Наиболее динамично интенсивность размножения клеток изменяется во все сезоны года в 15 часов. Различия МИ в эти часы суток достоверны всех сезонов года, кроме промежуточных -лето-зима.
