Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Материал и методы
1. Материал
1.1. Мыши лабораторные
1.1.1. Лабораторные мыши - носители t-гаплотипов), полученные на основе коллекции
1.1.2. Гетерозиготи
1.1.3. Гетерозиготи no Робертсоновской транслокации Rel(8,17)/t, несущие различные t-гапло-типы (t6, tl2, twl2, tw!8, tw73, twPa-1, tw5) .
1.1.4. Мыши-носители реципрокнои транслокации Т(1б,17)43Н)
1.1.5. Мыши, гомозиготные по Робертсоновсой транслокации Re ЕМ)
1.2. Лабораторные грызуны других родов
1.2.1. Хомяки рода Phodopus - Ph.sungorus и Ph.camp-belli
1.2.2. Крысы Rattus norvegicus линии Wistar и беспородные
1.3. Дикоживущие мыши p.p. Mus и Apodemus различ ных видов
1.3.1. Mus domesticus (Куба, Перу), Mus musculus (Сев. Кавказ), Mus musculus wagneri (Прикаспий), Mus musculus tataricus (Азербайджан), Mus abbotti (Армения), Mus specilegus (Молдова)
1.3.2. Apodemus flavicoll is (Киевская область), Apodemus.agrarius (Восточная Украина)
1.4 Гибриды лабораторных и диких мышей
1.4.1 Гибриды Fl Mus musculus tataricus х
1.4.2 Гибриды Fl Mus musculus tataricus x M.domesticus (Куба)
1.4.3. Гибриды Flu F2 Mus Vagneri x Mus musculus
1.5. Гибридные грызуны других родов: полевки, хомяки, крысы
1.5.1 Полевки - гибриды рода Microtus
1.5.2. Полевки - гибрид возвратного скрещивания [F1 Terricola majori х T.daghestanicus) х T.daghesta- nicus]
1.5.3. Хомяки (рода Phodopus): гибриды от прямого, реципрокного и возвратного скрещивания видов Ph. sungorus и Ph. campbelli
1.5.4. Крысы Rattus rattus (2n= 42) x Rattus flavijpectus (2n=38)
2. Методы
2.1 Генетические методы исследования
2.1.1. Определение плодовитости самцов
2.1.2 Определение нарушения соотношения передачи потомству гетерозиготных самцов мышей
2.2. Цитогенетический анализ
2.2.1. Световая микроскопия (митотические хромосомы, мейотические хромосомы в первой про
фазе мейоза — диакинезе)
2.2.2 Электронно-микроскопический анализ препаратов распластанных сперматоцитов
2.3. Молекулярный анализ
2.3.1. Блот-гибридизация
2.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.4. Статистический анализ..
Глава III Результаты
3.1. Экспериментальные данные на основе стоков мы шей, несущих различные t-гаплотипы (коллекция t-ком-плексных мышей)
3.1.1 Выявление животных-носителей t-гаплотипов в выборках мышей из природных популяций с помощью генетического анализа
3.1.2 База данных на основе коллекции t— комплексных мышей
3.1.3. Молекулярно-генетический анализ ДНК мышей, несущих і-комплекс,и других грызунов.
3.1.4. . Оценка комплементации по жизнеспособности и плодовитость и самцов мышей, несущих различные t-гаплотипы - компаунды tx/ty.
3.2. Поведение мейотических хромосом у самцов мышей, несущих t-гаплотипы .156
3.2.1. Цитогенетическое исследование поведения мейотических хромосом у компаундов
3.2.2. Свето-микроскопический анализ синаптонем-ных комплексов у гетерозиготных самцов Rbl/t П
3.2.3 Поведение мейотических хромосом у мышей, несущих t- комплекс, гетерозиготных по транслокациям Rbl и Т(16,17)
3.2.4. Анализ взаиморасположения Rb-тривалента (ТК), 17-хромосомы, несущей t-гаплотип, uX-Y- бивалентов в связи с плодовитостью и геноти пом мышей - гетерозиготных носителей различ ных гаплотипов и транслокаций Rbl и Т(1б,17) 43 Н.
3.2.5. Нарушение соотношения передачи(ТКО) t-ком- плекс (потомству структурных гетерозигот, несущих различные t-гаплотипы и Робертсо- новскую транслокацию Rb (8,17) 1 Іет /so Генетический анализ плодовитости и ЭМ исследо вания влияния повышенного радиационного фона в 30-километровой зоне ЧАЭС на самцов мышей, не сущих летальные 1-гаплотипы /94 Анализ цитогенетических особенностей, сопровож дающих эффект гибридной стерильности у самцов различных видов грызунов
3.4.1. Световая микроскопия и ЭМ анализ СК спер-матоцитов гибридов, полученных в результате скрещиваний различных видов диких и лабораторных мышей 203
3.4.2. Световой и ЭМ анализ СК сперматоцитов гибридных форм полевок рода Microtus 2.07
3.4.3. Световой и ЭМ анализ СК сперматоцитов гибридных форм полевок рода Terricola
3.4.4. ЭМ анализ СК сперматоцитов гибридов крыс первого поколения F1 при гибридизации Rattus flavipectus (2п =38) из Вьетнама с Rattus rattus (2п = 42) из Эстонии <22 Гибриды хомячков Phodopus sungorus и Phodopus campbelli 225
3.5.1 Параметры развития репродуктивной системы 2-28
3.5.2. Кариотипы исходных видов и гибридов рода Phodopus
3.5.3. Нарушения на стадии первого деления мейозау межвидовых гибридов хомячков Phodopus (sungorus и.campbelli) (СВ анализ)
3.5.4. Мейотические аномалии у межвидовых гибриде Fl Phodopus (sungorus u.campbelli ) прямого и реципрокного скрещивания
3.5.5. Сравнительный световой и ЭМанализ СК спер- матоцитов хомячков рода Phodopus (Ph. sun- gorus и Ph. campbelli) от прямого, реципрокного и комбинации возвратных скрещиваний ,236
Глава 1X. Обсуждение
4.1. Аномалии СК у плодовитых гетерозигот Rbl/T
4.2 .Аномалии СК у стерильных гетерозигот Rbl/T43H
4.3 Генетические и цитогенетические особенности гетерозигот Rbl/t
4.4. СК у гетерозиготных самцов
4.5. Причины стерильности дигетерозигот по разным t-гаплотипам
4.6. Возможная роль интеркаллярной ДНК в стерильности компаундов
4.7. Физиологические механизмы стерильности компаундов
4.8. Анализ гибридной стерильности различных таксономических групп грызунов
4 8.1. Гибриды мышей
4.8.2 .Гибриды крыс Rattus rattus X Rattus flavipectus
4.8.3. Гибриды трех видов серых полевок группы аг-valis
4.8.4. Гибриды полевок рода Terricola
4.8.5. Гибриды хомячков Phodopus .sungorus и Ph.campbelli
Заключение
Выводы
Список литературы
- Лабораторные грызуны других родов
- Определение нарушения соотношения передачи потомству гетерозиготных самцов мышей
- Поведение мейотических хромосом у самцов мышей, несущих t-гаплотипы
- Параметры развития репродуктивной системы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди видовых изолирующих механизмов важное место принадлежит полной или частичной стерильности гибридов. Генетические и цитологические аспекты гибридных нарушений начали изучаться в 30-х годах и обобщены в ряде классических работ (Dobzhansky, 1951; Stebbins, 1950; White, 1954). В настоящее время известно, что плодовитость млекопитающих определяется значительным числом генетических факторов, например, у домовых мышей известно не менее 25 локусов, контролирующих плодовитость (Searle, 1982). Одной из причин стерильности гибридов служат структурные перестройки хромосом, в гетерозиготном состоянии уменьшающие число жизнеспособных гамет.
Поскольку в ранних цитологических исследованиях было обнаружено, что большинство видов растений и животных отличается по кариотипам, то хромосомные перестройки стали рассматривать как первостепенный фактор процесса видообразования, значительно его ускоряющий (Goldschmidt, 1940; White, 1954 и др. работы 50-х годов; Воронцов, 1960). В настоящее время чаще полагают, что хромосомные перестройки лишь сопровождают процесс видообразования и, подобно генным мутациям, проходят длительный период внутрипопуляционного полиморфизма (Орлов, 1974; Futuyma, Mayer, 1980; Орлов, Булатова, 1983; Sites, Moritz, 1987; Coyne, Orr, 1998).
Современные модели хромосомного видообразования учитывают не только снижение приспособленности (fitness) гибридов, гетерозиготных по хромосомным перестройкам, но и уменьшение потока генов в результате подавления рекомбинации (Rieseberg, 2001; Бородин, 2003; Бородин и др., 2004). В связи с этим
значительное внимание уделяется мейотическому процессу, разнообразным нарушениям мейоза. Появление новых методов изучения мейоза, цитологических и молекулярных, позволило значительно продвинуться в этой области.
Одним из современных методов изучения раннего мейоза является электронно-микроскопический анализ (ЭМ) синаптонем ного комплекса (СК) (Moses, 1977,Богданов с соавт., 1996). Этот метод обладает большей разрешающей способностью по сравнению со светомикроскопическим и позволяет визуалировать структурные перестройки хромосом, не выявляемые на поздних стадиях мейоза. Необходимо детальное исследование мейотической системы, т.е. точное определение стадий мейоза и нарушение структуры СК, которое возможно только с помощью ЭМ анализа СК ( Moses, 1977).
Однако до настоящего времени цитогенетические механизмы снижения приспособленности гибридов и подавления рекомбинации в мейозе млекопитающих изучены недостаточно. Изучение мейоза гибридов млекопитающих связано с целым рядом трудностей и ограничений. Поэтому для исследования нарушений мейоза желательно использовать также удобный модельный объект. Подобными модельными объектами могут стать виды легко размножающиеся в лабораторных условиях и характеризующиеся значительным полиморфизмом по хромосомным перестройкам.
В частности, этим требованиям отвечают домовые мыши, Mus musculus sensu lato. У западноевропейских домовых мышей, Mus domesticus Pall., и многих лабораторных линий домовых мышей известен полиморфизм по соединениям акроцентрических хромосом (т.е. робертсоновские соединения). В популяциях домовых мышей с различной частотой встречается также ґ-комплекс. Локализованный в проксимальной части 17-й хромосомы домовых мышей /-комплекс
представляет собой серию хромосомных перестроек (четыре неперекрывающиеся инверсии) (Herrmann et al,1984).
Известно, что /-комплекс влияет на мужскую фертильность, а именно на сперматогенез. Это выражается в том, что самцы домовых мышей вида Mus musculus с определенными комбинациями /-гаплотипов являются стерильными или почти стерильными, тогда как самки остаются фертильными, хотя их плодовитость снижена (Dunn, Bennett, 1967; Bennett, 1959, 1975; Lyon, 1986). Изучение генетических особенностей многочисленных гаплотипов (аллелей) t-комплексных домовых мышей и нарушений плодовитости самцов в различных вариантах скрещиваний линий (стоков), несущих различные /-гаплотипы, позволили нам использовать коллекцию t-комплексных мышей в качестве удобной модели для изучения разнообразных мейотических нарушений (Демин, Сафронова, 1972, 1980.; Сафронова с соавт., 1988, 1989).
Исследования в указанных направлениях достаточно актуальны и должны иметь целенаправленный характер.
Целью настоящей работы явилось исследование цитогенетических механизмов (основ) стерильности у внутривидовых гибридов, структурных гетерозигот, несущих различные /-гаплотипы и межвидовых гибридов-самцов для определения ультраструктурного поведения мейотических хромосом, характеризующего основные особенности синапсиса половых хромосом и аутосом при нарушении фертильности (анализ СК половых хромосом и аутосом и взаимосвязь с изменением плодовитости).
В связи с этим были поставлены следующие задачи: создать экспериментальную модель на основе коллекции /-комплексных домовых мышей Mus musculus гибридных самцов - различных
комбинаций гетерозигот - для изучения плодовитости и проведения цитогенетических исследований. Провести скрещивания с различной комбинацией /-гаплотипов из коллекции для получения стерильных компаундов, для введения в геном ^-комплексных мышей коллекции транслокаций Rb(8,17)Iem и Т(16.17) 43Н для получения стерильных гибридов; провести цитогенетическое исследование поведения меиотических хромосом у мышей-гетерозигот с различными гаплотипами (tl2/twl8, tPa-l/twl8, tw5/twl8); для определения особенностей синапсиса половых хромосом и взаимосвязи их с аутосомами при нарушении плодовитости с помощью светового и ЭМ анализа СК; также провести сравнительный анализ структуры и поведения СК половых хромосом и аутосом, связанный с плодовитостью мышей; определить поведение половых хромосом у самцов гибридов диких и лабораторных мышей, межвидовых гибридов различных видов грызунов (полевок, крыс ) с нарушенной плодовитостью.
У самцов хомячков рода Phodopus, полученных в результате гибридизации видов Ph. sungorus и Ph. Campbelli (F1 -от прямого и обратного скрещивания и от возвратных скрещиваний) определить типы нарушений синапсиса меиотических хромосом как половых, так и аутосом в зависимости от принадлежности к поколению и направления скрещивания, а также возможную стадию нарушения сперматогенеза.
Исследовать фено- и генетические свойства /-гаплотипов коллекции, для создания базу данных в виде реляционных таблиц. Изучить нарушение менделевского соотношения у структурных гетерозигот, несущих различные ґ-гаплотипьі.
Исследовать роль /-комплекса в таксономии у самцов родов Mus и Rattus с использованием молекулярных методов. (блот-гибридизация )
Научная новизна. На базе коллекции /-гаплотипов домовых мышей Mus musculus, принадлежащей лаборатории проблем микровоэволюции ИПЭЭ создана экспериментальная модель для изучения нарушения плодовитости межвидовых изолирующих механизмов или гибридной мужской стерильности. Представлены генетические свойства коллекции /-комплексных мышей. Впервые проведен количественный анализ различных показателей коллекции и прогнозирования биологических процессов в популяционных исследованиях. Создана база данных, включаю -щая результаты экспериментальных наблюдений с 1975 по 1998 гг. Проведена систематизация большого количества информации по гено- и фенотипическим признакам, оформленная в виде реляционных таблиц и предназначенная для обработки полученных данных методами прикладной математической статистики с использованием компьютерных программ.
Впервые с помощью блот-гибридизации обнаружена гомология к ряду /-специфических проб ДНК (Ти 66, Ти 119) в геноме видов грызунов Mus musculus и сем. Muridae (род Rattus) из разных географических точек. Показана возможность использования /-комплекса в качестве маркера для решения вопросов таксономии рода Mus
Впервые проведен генетический анализ комплементации для выявления /-гаплотипов из природных популяций.
С помощью генетического анализа изучена фертильность самцов-компаундов, полученных при скрещивании Разработаны генетические методы получения гибридных стерильных
компаундов, несущих различные f-гаплотипы, необходимые для
цитогенетических исследований. Применен метод
цитогенетического маркирования 17-й хромосомы, несущей t-комплекс, с помощью транслокаций Rb (8,17) lem, позволяющий идентифицировать 17-ю хромосому в кариотипе домовой мыши Mus musculus.
У стерильных самцов (компаундов), несущих ґ-гаплотипьі домовой мыши Mus musculus, показана высокая частота неслучайной ассоциации между аберрантной аутосомой 17 и XY-бивалентом, и высокая частота унивалентов половых хромосом, приводящая к стерильности в результате блокировки сперматогенеза на стадии пахитены.
Обнаружена аналогичная ассоциация транслокационной конфигурации с XY-бивалентом. у стерильных гетерозигот, несущих различные 7-гаплотипы в сочетании с транслокациями Rbl и Т43Н.
Исследовано влияние Робертсоновской транслокации Rbl на поведение ^-комплекса, связанное с преимущественой передачей t-несущей хромосомы у гетерозиготных самцов лабораторных мышей.
Идентифицированы различные типы повреждений как аутосомных, так и половых бивалентов с помощью ЭМ анализа СК у мышей -родителей и их потомков F1 и F2 ,несущих различные t -гаплотипы, под влиянием радиционного фона ЧАЭС.
У гибридов диких и лабораторных мышей, межвидовых гибридов различных видов грызунов (полевки, крысы, хомяки) с помощью ЭМ анализа СК выявлены аномалии поведения XY-половых хромосом, связанные с нарушением плодовитости самцов.
Впервые у гибридных самцов, полученных при гибридизации хомячков Ph.sungorus и Ph.campbelli (F1, прямое и реципрокное и возвратные скрещивания), обнаружены разные типы нарушений
синапсиса мейотических хромосом (как половых, так и аутосом) при световом и ЭМ анализе СК на стадии раннего мейоза в пахитене.
Практическая значимость работы. Многочисленные факторы загрязнения окружающей среды( химические вещества и радиация) воздействуют на мейоз (фертильность), поэтому репродуктивное здоровье человека является одной из самых актуальных проблем современной медицины. Для оценки таких факторов возникла необходимость создания экспериментальной модели. Наиболее соответствуют этой цели домовые мыши Mus musculus, несущие t-комплекс, локализованный в 17-ой паре хромосомы мыши. Кроме того,в этой области локализована Н-2 система гистосовместимости мыши, аналогичная системе HLA человека.
Поэтому оказалось возможным использование ^-комплексных мышей в качестве экспериментальной модели, характеризующейся влиянием на сперматогенез (нарушения плодовитости), и исследования ее цитогенетических механизмов. Исходя из этого, полученные на этой модели данные могут существенно помочь для дальнейшего изучения репродуктивного здоровья человека и являются актуальной проблемой современной медицины, а также могут быть полезны в медицинской практике.
Однако до настоящего времени результаты исследований феномена мужской гибридной стерильности не дают окончательного и ясного ответа о цитогенетических механизмах, определяющих данное явление, именно поэтому исследования по указанным направлениям достаточно актуальны и должны иметь систематический целенаправленный характер.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1 Межвидовая и внутривидовая гибридная стерильность самцов как одна из форм нарушения фертильности
1.1. Стерильность самцов-гибридов между различными видами Фертильность, нормальное развитие которой обусловлено генным балансом, обычно относительно редко нарушается при внутривидовых скрещиваниях, поскольку она является одним из основных признаков, характеризующих адаптацию вида. Напротив, при межвидовой гибридизации нарушение плодовитости и жизнеспособности наблюдается скорее как правило, нежели как исключение. Показателями гибридных нарушений является снижение жизнеспособности особей первого гибридного поколения, а также плодовитости и стерильности у гибридов в разных типах скрещиваний (число потомков при различных вариантах скрещиваний и т.д.) (Haldane, 1922, Мейер,1986). 1.1.1. Гибридная стерильность у мышей
Часто наблюдаемая у межвидовых гибридов мужская стерильность послужила причиной широкого проведения специальных лабораторных экспериментов с использованием самых разнообразных объектов, включая мелких грызунов (мыши, полевки, землеройки, крысы, песчанки ящерицы), хищных, жвачных, приматов, рыб и т.д. У млекопитающих основным объектом анализа гибридной стерильности обычно служили различные виды мелких грызунов. В основном это были мыши лабораторных линий и дикоживущие домовые мыши. В проведенных экспериментах были получены гибриды от скрещивания особей некоторых лабораторных линий домовых мышей с "дикими формами", такими, как, например, М. spretus, М. molossinus, М. castaneus, М. urbanus, М. bactrianus, М. domesticus и Mus. musculus из Центральной Европы и из окрестностей Новосибирска (Forejt, Ivanyi, 1974; Matsuda etal., 1982; Бородин, Горлов, 1983, 1986).
При гибридизации М. domesticus с М. musculus и М. spretus было обнаружено, что самцы от скрещивания этих видов, как правило, стерильны, а самки фертильны (Bonhomme et al.,1982). Свободное скрещивание видов М. domesticus и М. musculus отмечается только в узкой зоне в Центральной Европе или в лабораторных условиях. Гибридов же от скрещивания М. domesticus и М. spretus в зоне естественного перекрывания их ареалов не было обнаружено вообще (Klein, 1986), они были получены только в лабораторных условиях путем спаривания животных. Кроме того, с применением техники искусственного осеменения была проведена экспериментальная гибридизация лабораторных мышей с тремя видами подрода Mus из Юго-Восточной Азии (West et al.,1977). При этом самки диких видов осеменялись спермой от животных лабораторной линии (ICR), но ни в одном случае ни одного живого гибрида получено не было, хотя при гибридизации М. domesticus и М. caroli в такой же серии экспериментов было получено 4 жизнеспособных гибридных самца, которые оказались стерильными (Forejt, Ivanyi, 1974). При исследовании стерильности гибридных самцов, полученных от скрещивания домовых мышей, отловленных в природе, с лабораторными мышами линии С57 В L10, среди исходных 533 диких самцов было выделено три группы по критерию фертильности их сыновей:
- только стерильные,
- только фертильные,
- как фертильные, так и стерильные сыновья.
У стерильных гибридных самцов семенники были недоразвиты, а в диакинезе преобладали_метафазы с хромосомной фигурой, состоявшей из 21 бивалента (Ivanyi, 1974) Явление гибридной стерильности было также обнаружено во время установления
видового статуса четырех из пяти европейских форм домовых мышей (взятых из природных источников) путем проведения серии экспериментальных скрещиваний с лабораторными особями. Сюда
относились домовые мыши из различных районов России (Московская, Тульская, Херсонская, Кировоградская обл.), а также Таджикистана, Молдовы, Кубы, Эфиопии, Чехии (Лавренченко, 1990; Лавренченко с соавт., 1994).
Стерильность (или, по крайней мере, неполная фертильность) самцов также была отмечена при гибридизации М. abbotti с М. musculus. Семенники у этих гибридов были недоразвиты и уменьшены в размере; в мазках содержимого придатков семенников отсутствовали зрелые сперматозоиды. Интенсивность размножения потомков первого поколения, а также их плодовитость, в целом были гораздо ниже, чем во внутривидовых скрещиваниях. Соотношение полов у гибридов F1 составило 1самец:4самки. При возвратных скрещиваниях гибридные самки также имели пониженную плодовитость (среднее число детенышей в помете 3,56) и невысокий уровень интенсивности размножения (из 5 пар размножались 3), большая часть самцов-бэккроссов (4 из 5) также оказалась стерильной, и их семенники были уменьшены. В диакинезе у одного из самцов преобладали_метафазы с хромосомной фигурой, состоявшей из 21 бивалента. В то же время одна гибридная пара от М. abbotti и М. domesticus успешно размножалась; еще 2 гибридные самки также успешно размножались, хотя их плодовитость была несколько сниженной. При совместном содержании в течение 5 месяцев двух самцов-бэккросов с гибридными самками ни в одном случае не было получено потомства. Как было показано, семенники одного из этих самцов были уменьшены в размере, и в мазках содержимого придатков семенников не было зрелых сперматозоидов; в мазках же второго самца содержалось много зрелых сперматозоидов, которые имели дефектную форму головки (Лавренченко с соавт., 1990). В лабораторных условиях была также проведена успешная гибридизация М. spicilegus с M.musculus в прямом и обратном направлении. Потомство F1 и F2 в этих скрещиваниях было жизнеспособно и фертильно, однако интенсивность размножения и
плодовитость самок в смешанных парах была ниже, чем в контрольных,
внутривидовых спариваниях. У 4 гибридных самцов в диакинензе было
обнаружено нормальное число бивалентов (п=20) (Лавренченко, 1990).
Булатовой с соавт. (1986) была проведена в лабораторных условиях
гибридизация курганчиковых мышей КМ ( окрестности г. Кишинева),
которых отлавливали ловушками в жилых постройках и природных
биотопах, с домовыми мышами симпатричных популяций ( ДС) из
природных популяций, и лабораторной мышью (ЛМ)с образованием
жизнеспособных фертильных гибридов F1 и F2 обоегл пола. Для
сравнения были изучены результаты скрещивания курганчиковых мышей
с аллопатрическими домовыми (ДА) и лабораторной мышью (ЛМ).
Авторами была отмечена в общем пониженная плодовитость смешанных
пар и возвратных скрещиваний. Изучение мейоза гибридов показало у
гибридных самцов от скрещивания КМ х ДС прямого и реципрокного
вариантов, что метафазные пластинки содержали нормальное число
бивалентов п =20 (диплоидное число хромосом у домовой и
курганчиковой мыщи одинаковое - 2 п=40). В диакинезе обоих изученных
гибридов курганчиковой и лабораторной мыщи преобладали пластинки с
21 мейотической фигурой, в том числе 19 бивалентов и 2 унивалента. На
некоторых пластинках половой бивалент имел ассоциацию "конец- в
конец", а также обнаружены аутосомные униваленты. В других вариантах
половые биваленты диссоциировали и оказывались унивалентами..
Сравнительный анализ цитологической картины мейоза у гибридов
первого поколения указывает на нестабильность и нарушения
хромосомных наборов курганчиковой и лабораторной мышью. Как
отмечают авторы, полученные данные не имеют отношения к видовым
цитогенетическим различиям между курганчиковой и лабораторной
мышью и не говорят о дифференцировке природных домовых и
лабораторных мышей в связи с вопросом таксономических
взаимоотношениях мыщей и механизмах репродуктивной изоляции.
Кроме того, в сообщениях Матсуда с соавт. (Matsuda et al.,1981,1982, 1989,1990,1991, 1992) по результатам межвидовой гибридизации лабораторных (М. musculus) и диких мышей (М. spretus) был продемонстрирован феномен диссоциации X-Y-половых хромосом в метафазе 1 мейоза, который определен как частота расхождения половых хромосом. Диссоциация классифицировалась по трем типам (Matsuda et al.,1982). Первый тип обнаружен у_гибридов F1 при скрещивании филогенетически отличимых подвидов - лабораторных мышей линии BALB/C6J с М. castaneus, М. urbanus, М. bactrianus и М. molossinus. В данном случае диссоциация достигала высокого уровня - 70-90%. Второй тип наблюдали при скрещивании чистых линий, диссоциация находилась в пределах 30% и третий тип - у гомозигот, для которых средняя частота диссоциации достигала 50 % (Matsuda et al., 1981,1982). При гибридизации лабораторных мышей М. musculus (линии С57 BL10) с М. spretus были получены стерильные гибридные самцы как в F1, так и среди потомков от возвратного скрещивания. При этом гибридные самки - имели пониженную плодовитость (Hale et al.,1993). Электронно-микроскопический анализ результатов этих скрещиваний продемонстрировал значительные мейотические нарушения у гибридных самцов. Например, на стадии пахитены обнаруживалась диссоциация Х- и Y-половых хромосом (унивалентность); кроме того, были выявлены различные аномалии как аутосомных, так и половых бивалентов. Вариабельность отмеченных мейотических нарушений, вероятно, и определяла неспособность животных к оплодотворению.
1.1.2. Гибридная стерильность у грызунов других родов Среди различных видов полевок наиболее успешно скрещиваются восточноевропейская и закаспийская, в меньшей степени - виды-двойники, и наименее результативны в этом отношении комбинации скрещиваний киргизской и обыкновенной полевок (Малыгин, 1983). Безрезультатно
закончились эксперименты по межвидовой гибридизации монгольской полевки. Интересно отметить, что в кариотипе монгольской полевки третья пара акроцентриков представлена уникальным рисунком поперечной исчерченности (G-полосы). Вероятно, этой паре хромосом невозможно подобрать гомологичные (сходные по G - окраске) элементы или участки хромосом среди кариотипов остальных видов обыкновенной полевки. Пока не выяснены причины столь дифференцированной результативности межвидовой гибридизации. Возможно, они связаны с разной цитогенетической совместимостью видов, отражающей определенную степень их родства. По-видимому, степень различий видов обыкновенной полевки в какой-то мере связана с нарушениями гаметогенеза гибридов .(Малыгин, 1983).
Чем больше отмечается хромосомных нарушений, тем чаще нарушается конъюгация и расхождение хромосом в мейозе гибридов (Погосянц,1971). Наиболее значительные нарушения в процессе формирования гамет у гибридов, полученных от скрещивания восточноевропейской и киргизской полевок, обычно наблюдаются на стадии спермиогенеза. Цитогенетический анализ гибридных животных с применением дифференциальной окраски выявил инвертированный рисунок поперечной исчерченности в трех парах крупных акроцентриков и отсутствие гетерохроматина в акроцентрической Х-хромосоме киргизской полевки. В отличие от приведенного примера гаметогенез гибридов, полученных от скрещивания восточноевропейской и закаспийской полевок, прерывается на более ранней стадии - стадии формирования сперматогониальных клеток. Данное обстоятельство хорошо согласуется с хромосомными различиями, отмечаемыми у исходных родительских видов: у закаспийской полевки (2п=46) на восемь хромосом меньше, чем у восточноевропейской, а разница в числе хромосомных плеч составляет 28. Следовательно, в тех случаях, когда кариотипы исходных видов были близки (восточноевропейская и закаспийская, восточноевропейская и
киргизская полевки), гаметогенез у гибридов прерывался на поздних стадиях (Малыгин, 1983).
Ахвердян (1989) провел гибридизацию кариотипически близких полевок Microtias shidlovski (2n=60) х M.socialis. (2п=62) и получил стерильных самцов и самок с пониженной плодовитостью.
Ранее в экспериментах по гибридизации Terricola majori с 54-хромосомными Т. daghestanicus было получено бесплодное потомство, и, следовательно, подтверждена их репродуктивная изоляция (Мамбетов,1986). В результате экспериментальной гибридизации было получено потомство от двух кариоформ Т. daghestanicus (от 42-хромосомного самца и 38-хромосомной самки), но, к сожалению, не была выяснена их плодовитость (Ахвердян, 1989, Ахвердян с соавт.,1992). G-окраска показала гомологию родительских хромосомных наборов, что подтвердило и исследование синаптонемного комплекса на стадии пахитены гибридных самцов - нормальный синапсис бивалентов. Ю. М. Ковальская получила гибридный выводок (F1) от скрещивания самки Т. majori (2n=54; NF=60, где NF - число плеч хромосом) и самца 54 -хромосомной формы T.daghestanicus (NF=58), затем - двух гибридных самцов от возвратного скрещивания гибридной самки F1 (2n = 54) и самца T.daghestanicus (2п =54) (Малыгин и др., 2000) .
В основном сведения Малыгина (1983) по результатам экспериментальной гибридизации обыкновенных полевок согласуются с данными Мейер (1978,1980). Как показали эксперименты Мейер с соавт. (1996), при межвидовой гибридизации серых полевок рода Microtus (М. transcaspicus, М. arvalis, М. rossiaemeridionalis, М. ilaeus) все гибриды в большинстве составленных сочетаний оказались стерильными, однако степень морфологической выраженности ее была различной. Авторы полагают, что сперматогенез у гибридов может блокироваться на разных стадиях в зависимости от степени совместимости родительских геномов, или степени различий кариотипов указанных видов.
Морфологическое исследование сперматогенеза стерильных гибридных самцов от трех вариантов скрещивания (М. rossiaemeridionalis х М. arvalis, М. rossiaemeridionalis х М. ilaeus, М. transcaspicus х М. ilaeus) показало блокирование мейоза на уровне первичных сперматоцитов. Гибридные самцы характеризовались уменьшением массы семенников по сравнению с родительскими видами и отсутствием сперматозоидов в придатках семенников, хромосомы только сперматогониальных клеток нормально проходили деление. Нормальные сперматогониальные метафазы обнаруживались на препаратах в большом числе, однако, на стадии пахитены мейотические аномалии были уже очевидны и, в общем, сходны у гибридов разного происхождения. Наблюдали частично спаренные хромосомы и униваленты. Ни одной пахитены с полным синапсисом и половыми пузырьками не идентифицировали ни в одной из клеток. Дальнейшие исследования мейоза у потомков от выше перечисленных вариантов скрещиваний показали, что у гибридов второго и третьего вариантов клетки на стадии диплотены - диакинеза встречаются с очень незначительной частотой. При этом в диакинезе - метафазе I обнаруживали, в основном, униваленты, и лишь в некоторых из них иногда отмечали присутствие мультивалентов, но ни разу не были обнаружены отчетливые метафазы I, - что, вероятно, связано с дегенеративными изменениями клеток гибридов (Matsuda,1992).
У гибридов первого варианта клетки на стадии диплотены - диакинеза присутствовали в несколько большем числе, хотя при этом в сперматогониальных клетках также наблюдали аномальные конфигурации, такие, как очень грубая (спирализованная) структура хромосом, темноокрашенныи пикнотическии хроматин, отсутствие связи между хроматидами в центромерном районе. При диффференциальном окрашивании хромосом показаны различия в положении центромер на хромосомах, что может являться причиной предотвращения нормальной конъюгации хромосом и приводить к структурным нарушениям. Авторы
полагают, что стерильность гибридов может быть обусловлена различием хромосом родительских видов (форм), приводящим к блокировке мейоза на ранних его стадиях, хотя не исключают и другую возможность. Картины нарушений мейоза у гибридов разных вариантов скрещивания, в основном, сходны и соответствуют тому, что описано для других межвидовых гибридов.
В прямых и обратных вариантах скрещиваний Microtus mujianensis с М. maximowiczii полученные самцы оказались стерильными. Исследования мейоза у гибридных самцов позволили установить, что переход от диакинеза к метафазе I характеризуется присутствием сложных мультивалентных конфигураций; метафазы II, в основном, отсутствуют, указывая на значительные нарушения расхождения хромосом в анафазе, в результате чего и образуются аномальные гаметы. Предполагается, что выявленные нарушения у гибридных самцов происходят на стадии первого деления мейоза. Гибридизация М. maximowiczii с М. evorensenis , а также с дальневосточной и сахалинской полевками показала аналогичные результаты, но наиболее сходными они оказались у первых двух вариантов скрещиваний в связи с имеющимися кариотипическими различиями родительских форм.
Таким образом, можно предположить, что в тех случаях, когда кариотипы исходных видов достаточно близки (восточноевропейская и закаспийская, восточноевропейская и киргизская полевки), гаметогенез у межвидовых гибридов прерывается на поздних стадиях, а в случае скрещивания более отдаленных видов сперматогенез прерывается на более ранних стадиях мейоза.
В лабораторных условиях была создана модель свободного скрещивания разных кариоформ гибридов (различающихся по диплоидному набору хромосом между собой) - слепушонок Ellobius, обитающих в природных популяциях в долине реки Сурхоб. В этих экспериментах было получено 9 гибридов с числом 2п=44, 46, 48, и 50, включая: гибридов первого
поколения и гибридов от возвратного скрещивания гибридов F1 с родительскими формами (Коломиец с соавторами, 1986). Также были исследованы гибриды F1 (2п=33 и 2гг=51) от скрещивания кариоформ, отличающихся по одной паре хромосом - Е. tancrei (2п=34 и 32), Е. alaicus (2п=52) и Е. tancrei (2п=50). На препаратах у гибридов 2п=33 обнаружено 14 аутосомных бивалентов, половой бивалент и один тривалент. У всех самцов-гибридов отмечалось снижение плодовитости, причем у гибридов 2п=51она была снижена почти в 2 раза по сравнению родительскими формами (Ляпунова и др., 1990). Авторы считают, что различие в числе хромосом родительских форм при скрещивании приводит к нарушению фертильности потомства не только при межвидовой гибридизации, но и при внутривидовом разведении.
Исследование австралийских крыс показало, что различные виды Rattus способны гибридизовать в лабораторных условиях, а некоторые гибриды могут иметь ограниченную фертильность(Вауегзюск et al., 1983) Однако, только в случае скрещивания R.vilosissimus с Rxollentti действительно были получены достаточные данные, демонстрирующие пониженную фертильность гибридов. Эти два вида крыс обладают хромосомными различиями с моноброхиальной гомологией. У гибридов образуется в мейозе цепь из бивалентов (3, 3/10, 10/6, 6/9, 9).
Иосида (Yosida,1980) показал, что гибриды, полученные при обратных скрещиваниях родительских кариоформ 2п=38 и 2n=42 R. rattus имеют значительно редуцированную фертильность, определяемую очень небольшим размером помета. Эти формы отличаются двумя Робертсоновскими слияниями, вовлекающими 4 хромосомы (акроцентрики), которые образуют соответственно два тривалента в мейозе. По-видимому, данные две формы сильно различаются генетически, следствием чего является редуцированная фертильность их гибридов. В отношении хомячков также было отмечено существование стерильных межвидовых гибридов, хотя до недавнего времени джунгарский хомячок
Phodopus sungorus и хомячок Ph. campbelli рассматривались как подвиды вида Ph. sungorus. Впервые Юдин и соавторы (1969) обратили внимание, что при скрещивании данных подвидов в F1 получаются стерильные гибриды-самцы, на основании чего предположили, что Ph. sungorus и Ph. campbelli являются самостоятельными видами. Стерильность гибридов Ph. sungorus и Ph. campbelli была также отмечена Раджабли и Крюковой (1971). Однако, небольшой размер выборки животных (2 пары в опыте Юдина с соавт. ) не позволил прийти к определенному выводу. Видовая самостоятельность Ph. sungorus и Ph. campbelli была доказана Соколовым и Васильевой только в 1993 году. При этом были проведены как прямые, так и реципрокные скрещивания. Число размножавшихся пар в обоих вариантах скрещивания было значительно меньше, чем в контрольных партх, состоящих только из Ph. sungorus или Ph. campbelli. Размер помета у гетероспецифических пар по сравнению с конспецифическими оказался уменьшенным. Соотношение полов также различалось и составило при прямом скрещивании 2самки: 1 самцу, а при обратном - 1:2, что свидетельствует, по мнению авторов, о выраженной дифференциальной пренатальной смертности, поскольку у гибридных потомков были обнаружены аномалии пренатального развития типа гидроцефалии, недоразвития конечностей и головного мозга. Помимо этого, гибридное потомство отличалось по размеру и массе от потомков обоих родительских видов. Живая масса новорожденных детенышей от прямого скрещивания (самка Ph. sungorus х самец Ph. campbelli) в F1 была значительно выше, чем у гибридов от обратного скрещивания. Гибридные самцы оказались полностью стерильными.
У самцов-гибридов семенники были уменьшены. Анализ мазков придатков семенников выявил отсутствие в них зрелых сперматозоидов. Фертильные самцы из бэккроссов имели нормальный размер семенников, но плодовитость их была ниже, чем у исходных форм. Цитогенетические исследования показали, что частота унивалентов в мейозе уменьшается как в ряду поколений гибридов, так и по мере бэккроссирования. Корреляции
между частотой встречаемости диссоциированных хромосом в диакинезе и стерильностью самцов-гибридов отмечено не было. 1.1.3. Вероятные причины стерильности гибридных самцов Подводя итог рассмотрению представленных материалов, необходимо уточнить одно важное обстоятельство - связаны ли мейотические нарушения, отмечаемые при гибридизации животных, со стерильностью или пониженной плодовитостью гибридов. Forejt, Ivanyi (1974), Matsuda et al. (1982), Бородин, Горлов, (1983, 1986), Лавренченко, (1990) и Лавренченко с соавт. (1994) специально исследовали вопрос существования мейотических нарушений в диакинезе у гибридов между мышами некоторых лабораторных линий и домовыми мышами из естественных популяций. Было показано достоверное увеличение частоты диссоциации X-Y-хромосом и небольшое увеличение частоты встречаемости унивалентов малых аутосом в диакинезе у гибридов первого поколения. При возвратных скрещиваниях частота встречаемости унивалентов и других мейотических нарушений снижалась, мейоз нормализовался.
Некоторые авторы полагают, что высокая частота унивалентности не является причиной, способной вызвать стерильность у самцов-гибридов (Forejt,, Ivanyi, 1974, Matsuda et al., 1982 ,1992). В то же время Матсуда с соавт. (Matsuda et al., 1982) отмечает положительную корреляцию между частотой диссоциации половых хромосом и уменьшением относительного веса семенников. Механизм данного явления далеко не ясен, однако позволяет авторам высказывать на этот счет различные гипотезы. Одна из них предполагает, что ассоциация X-Y-половых хромосом контролируется несколькими аутосомными генами, а также генами самих половых хромосом (Matsuda et al., 1992).
Взаимоотношения между частотами унивалентов и мейотическими конфигурациями (бивалентами) изучались также при гибридизации у лабораторных мышей линий DBA/2J,C57B16 и flp.(Leonard et al.,1987).
Оказалось, что в диакинезе -Ml гомологичные хромосомы ассоциируют как биваленты, а присутствие унивалентов может быть связано с индукцией явления сегрегации. Частота аутосомных и половых унивалентов в диакинезе была линейно связана с частотой анеуплоидии гоноцитов в метафазе II сперматогенеза и овогенеза различных линий мышей. В то же время у самцов и самок отмечается высокий уровень нерасхождений, хотя у самок он значительно меньше. По мнению авторов, эти различия между самцами и самками могут быть следствием деятельности Y-хромосомы, которая способна повлиять на элиминацию различных хромосом в процессе сперматогенеза.
Коррелятивная связь между частотой X-Y-унивалентности и частотой анеуплоидных клеток в метафазе II, возможно, указывает на то, что прохождение начальных стадий мейоза находится под контролем комплекса генов, взаимоотношения между которыми при гибридизации нарушаются, и их дезинтеграция, соответственно, приводит к появлению унивалентов (Бородин и Горлов, 1982, 1986).
Детальное исследование поведения половых хромосом в диакинезе у гибридных животных выявило особенность, присущую большинству млекопитающих - диссоциацию половых хромосом, ведущую к унивалентности. Приведенные данные, видимо, также свидетельствуют о существовании специфических генов, обуславливающих не только поведение половых хромосом в мейозе, но и какие-то более сложные процессы, приводящие, в конечном счете, к появлению эффекта мужской стерильности.
Таким образом, при изучении гибридных форм различного происхождения, с участием различных видов животных, было установлено не только существование явления гибридной, преимущественно мужской, стерильности, но и связь данного явления с генетическим аппаратом: числом и структурой хромосом, их поведением в мейозе.
1.1.4 Генетический контроль изолирующих механизмов Репродуктивная изоляция является следствием адаптивной дивергенции. Для возникновения изоляции любого типа достаточно одной мутации, которая будет размножаться в последующих поколениях, причем для этого совсем не обязательна географическая изоляция. В новых экологических условиях возможна перестройка генома и формирование нового типа развития, что является предпосылкой для устойчивости процесса дивергенции. Наследственные изменения в одной из популяций проникают в соседние и вид эволюционирует как единое целое. Их изоляция возникает или вследствие пространственного разобщения или связана с изолирующими механизмами (Митрофанов с соавт.,1988). Показано, что изоляты всегда дивергируют, т.е. эволюция идет разными путями. В настоящее время многими фактами доказано, что изолирующие механизмы подвержены географической изменчивости и что в условиях географической изоляции возникают не только гибридные нарушения, но даже это логическая изоляция. .
Если гибридное потомство оказывается менее жизнеспособным, чем родительские формы, или бесплодным, то отбор сможет усовершенствовать механизмы, препятствующие спариванию таких форм. Мейр (Mayr Е., 1963) разделяет изолирующие механизмы на две категории: 1)механизмы, .препятствующие успешному межвидовому скрещиваник>,2) механизмы, понижающие успешность межвидового скрещивания .(нарушающие половые процессы после спаривания).
Применение методов молекулярной генетики для оценки генетического разнообразия помогает выявить различия между популяциями и видами. Анализируя генетические основы изоляции, можно сказать, что все гены, которые называют «генами стерильности», являются нормальными генами хромосомной элиминации, функционирующими в своей генетической среде. Сочетание с чужеродными комплексами генов при отдаленной
гибридизации приводит к нарушению основных генетических процессов: репликации, трансляции и транскрипции.
В геноме домовой мыши были идентифицированы 25 локусов гибридной стерильности. Самцы мышей, несущие в гетерозиготной форме различные хромосомные перестройки, проявляют такие же самые мейотические фенотипы, что и гибридные особи: частичный асинапсис, ассоциация перестроенных аутосом с X -хромосомой. Таким образом, Х-хромосомная инактивация у самцов в мейозе может функционировать, как точка отсчета, приводящая к мейотическому аресту у стерильных гибридов. Хромосомная и генетическая гибридная стерильность могут быть взаимосвязаны, потому что характерные атрибуты хромосомной стерильности, такие, как Х-хромосомная ассоциация, обнаруживаются как у межвидовых гибридов с генетической стерильностью, так и у близкородственных форм, гетерозиготных по хромосомным перестройкам.
Стерильность гибридов F1 между различными видами мышей часто проявляется согласно правилу Холдейна, то есть стерильным оказывается только гетерогаметный пол. Правило Холдейна применимо для хромосомной стерильности у всех изученных видов млекопитающих, включая человека. Таким образом, для млекопитающих стерильность ограничивается гибридными самцами. Генетические и молекулярные механизмы правила Холдейна остаются пока еще неясными. Возможно, его природа могла бы быть проанализирована при хромосомной стерильности, которая также подчиняется правилу Холдейна. Модельная система синапсиса генетически идентична, и самки инбредных штаммов мышей, отличающиеся только присутствием только одной хромосомной перестройкой и воспроизводящие стерильных самцов, могли бы стать особенно полезны ми для этой цели. Хромосомная самцово-ограниченная стерильность функционирует, как мейотический фильтр, который препятствует распространению определенных типов хромосомных перестроек.
Хотя генетическая и хромосомная стерильности, подчиняющиеся правилу Холдейна, варьируют, обе они проявляют самцово-специфический мейотический фенотип Х-хромосомной ассоциации с частично асинаптирующими аутосомами. Экспериментальные данные (Forejt, 1996), указывают на целостность полового пузырька, содержащего X и Y хромосомы, в пахитенных клетках самца и мейотическую Х-хромосомную инактивацию, как возможные составляющие самцово-специфического мейотического механизма выживания.
В исследовании Орлова (1968) рассмотрены изолирующие механизмы у пространственно изолированных форм лесных полевок - рыжей C.glareolus Schreb (из Московской и Костромской областей), тянынанской C.frater Thom (Заклийский Алатау) и красной C.rattius Pall, (из Костромской и Пермской областей). Было показано бесплодие гибридных самцов первого поколения в любых комбинациях C.glareolus, C.frater, C.rattius; тройные гибриды-самцы также оказались полностью бесплодны. Сперматогенез у гибридов заканчивался в массе на стадии образования сперматоцитов первого порядка. Сперматоциты первого порядка и сперматиды встречались на отпечатках семенников первых гибридных комбинаций крайне редко, спермиогенез - переход сперматид в сперматозоиды -не обнаруживался. Таким образом, у (географически замещающихся) аллопатричных форм лесных полевок показаны сформированные изолирующие механизмы
1. 2. Стерильность, обусловленная t-комплексом домовой мыши
t-комплекс представляет собой сложную комбинацию хромосомных перестроек, занимающую проксимальную треть хромосомы 17, общей протяженностью около 20 сантиморганид, то есть примерно 0.7% от всего генома домовой мыши.(рис 1,.2) Внутри этой области локализованы сайты, детерминирующие многочисленные и разнообразные эффекты t-комплекса
(влияние на эмбриональное развитие, сперматогенез, нарушение менделевского наследования, поведенческие особенности и другие), наследующиеся в большинстве случаев как единое целое. Генетические эффекты t-комплекса, обнаруженные еще на ранних стадиях его изучения, изначально давали возможность предположить, что он представляет собой серию хромосомных перестроек в проксимальном районе хромосомы 17, причем различные его варианты - t-гаплотипы - способны включать различающиеся комбинации инверсий, дупликаций или делеций (Lyon, Meredith, 1975). Аллельное поведение t-гаплотипов могло объясняться частичным сходством хромосомных перестроек (аберраций) в отдельных участках ДНК (Lyon, е.а.,1979). Однако данная гипотеза не имела каких-либо цитогенетических доказательств, поскольку при электронно-микроскопическом исследовании не было обнаружено никаких свидетельств структурных нарушений (инверсионных петель или делеций и др.), детерминированных присутствием t-комплекса (Tress, Erickson, 1973, Erickson, 1973,1978). Подобная картина могла наблюдаться в том случае, если структурные перестройки хромосом t-комплекса расположены сериями небольшой протяженности и, возможно, разграничены участками не инвертированной ДНК (Lyon, е.а.,1979). 1 2.1. Молекулярная структура t-комплекса
Окончательное доказательство того, что t-комплекс представляет собой серию инверсий, было получено только с помощью методов молекулярного анализа. Первые специфические зонды к t-комплексу были получены в 1994 году X. Лерахом с помощью микродиссекций метафазных хромосом мыши (Roehme et al.,1984). Использование этих микрофрагментов хромосом в качестве проб при блот-гибридизации с ДНК мышей, несущих различные варианты t-комплекса, подтвердило предположение о наличии в нем по крайней мере двух инверсий - проксимальной (начинающейся от центромеры) и дистальной (включающей МНС-комплекс), разделенных участком не инвертированной ДНК (Рис.2) (Fox et al.,1984,1985, Hermann
etal., 1986,1987). Процессы неравного кроссинговера, генной конверсии и внутрихромосомной рекомбинации могут служить основным источником вариабельности проявления характерных фенотипических особенностей t-гаплотипов и структурного полиморфизма данной области генома. Различные варианты t-комплекса - t-гаплотипы - действительно обладают вариабельностью структуры и широким спектром проявления типичных свойств. Кроме того, как для t-комплекса, так и для соответствующего участка хромосомы 17 " дикого типа" характерно присутствие ряда полиморфных последовательностей ДНК, наличие которых, наряду с существованием тандемных дупликаций и обилием псевдогенов в некоторых областях t-комплекса дает возможность данному району хромосомы 17 домовой мыши эволюционировать быстрее, чем большинству других геномных областей у этого вида (Fox et al,1985, Hermann et al.,1987).
Дальнейший молекулярно-генетический анализ, проводившийся с использованием ряда независимых ДНК-проб, полученных с помощью микродиссекции метафазных хромосом мыши и с использованием кДНК хромосомы 17, показал наличие в t -комплексе четырех парацентрических инверсий, получивших согласно своей локализации наименование прицентромерной, проксимальной, медиальной и дистальной (Hammer et al.,1989). Прицентромерная, проксимальная, медиальная инверсии разделены короткими участками не инвертированной ДНК, тогда как дистальная вплотную прилегает к медиальной (Hammer et al.,1989 , Pilder et а1.,1991.(Рис.5)
Рецессивные летальные мутации t-гаплотипов не являются однородной группой. Летальные мутации, вызывающие сходные нарушения в эмбриогенезе и гибель зигот на одних и тех же стадиях развития, объединяются в одну комплементационную группу. При сочетании в зиготе гамет, несущих гаплотипы, летали которых принадлежат к одной и той же комплементационной группе, эмбрионы погибают; в случае слияния гамет,
гаплотипы которых принадлежат к разным комплементационным группам, происходит взаимная компенсация летальных эффектов и, хотя число выживших сложных гетерозигот (компаундов) обычно ниже ожидаемого, они имеют нормальный фенотип (Bennett, 1985). К настоящему времени насчитывается до 16 комплементационных групп (Klein, 1986). (Рис.3 )
1. 2. 2. Проблемы эволюции структур t-комплекса
Другое интригующее свойство t-гаплотипов — преимущественная передача t-несущей хромосомы потомству гетерозиготных самцов (transmission ratio distortion - TRD ) - долгое время оставалось основным объектом пристального внимания генетиков и эволюционистов. Полные гаплотипы природного происхождения (то есть имеющие полную протяженность инверсий) имеют, как правило, уровень TRD около 90-95% (Bennett, 1975). Частичные рекомбинантные гаплотипы показывают широкий спектр изменчивости данной характеристики - от высокой, приближающейся к величинам TRD полных гаплотипов, до крайне низкой - не более десяти процентов (Bennett, 1975; Lyon, 1984).
Молекулярно-генетические методы, прежде всего блот-гибридизация с t-специфическим ДНК-пробами, позволили обнаруживать в природных популяциях мышей носителей t-гаплотипов, в том числе и таких, которые невозможно было выявить только гибридологическими методами, то есть с помощью скрещиваний с особями, несущими маркерную мутацию Т, вызывающую отсутствие хвоста у гетерозигот. Распространение и фиксация гаплотипов в популяциях определяются сбалансированным соотношением действия генетических факторов летальности и преимущественной передачи t-несущей хромосомы потомству. Абсолютное большинство известных полных t- гаплотипов природного происхождения характеризуется высоким уровнем нарушения соотношения передачи (TRD) и наличием рецессивных леталей (Bennett, 1975; Lyon, 1984). Однако только уровень TRD и гибель
гомозигот t/t не объясняют существующих в природе популяционных частот t-гаплотипов. Известны случаи длительного существования в популяциях полулетальных гаплотипов, определяющих, впрочем, и стерильность гомозиготных самцов (Ardlie, Silver,1996). Значительную роль в поддержании определенной частоты t-гаплотипов в природе играет социальная структура популяций мышей, представленная семейными группами, или демами, благодаря которой в популяциях усиливаются процессы генетического дрейфа. Для природных популяций мышей характерен низкий уровень полиморфизма по t-гаплотипам, который, согласно гипотезе Левонтина, является результатом генетического дрейфа в малых демах и процессов междемной миграции (Lewontin, Dunn, 1960). Дарэнд с соавт. предлагает альтернативное объяснение этого явления. Низкий уровень полиморфизма является нестабильным. Природная популяция мышей может находиться в одном из двух стабильных состояний: вымирания t-гаплотипов или их высокой частоты (Durand et al.,1997).
При изучении полиморфизма t-гаплотипов у двух видов домовых мышей -
Mus domesticus и Mus musculus - методами популяционно-генетического
анализа, основанного на взаимодействии t-гаплотипов с мутацией Т и
последующем определении принадлежности к комплементационной
группе, было установлено, что у особей вида Mus musculus чаще
встречается tw73 группа комплементации, тогда как Mus domesticus
характеризуется гораздо более широким спектром комплементационной
принадлежности (Bennett, 1975; Lyon, 1984; Herrmann etal., 1984,1986).
Еще в одной из первых работ, посвященных анализу полиморфизма района
t-комплекса методом блот-гибридизации с t-специфичными ДНК-пробами,
были тестированы 35 гаплотипов различного происхождения,
обнаруженные в природных популяциях мышей видов Mus domesticus и Mus musculus из Европы, Америки, Северной Африки и с Ближнего Востока (Silver et al., 1987). Исследование не показало существенных
различий в структурной организации данных гаплотипов, хотя было известно, что входящие в их состав летальные мутации принадлежат к различным комплементационным группам. Сходство структур гаплотипов двух различных видов мышей предполагает их происхождение от единой предковой хромосомы.
Как было отмечено выше, присутствие серии инверсий подавляет
рекомбинацию между t-гаплотипами и гомологом "дикого типа". Столь
длительный период рекомбинантной изоляции должен был привести к
накоплению различий в последовательностях ДНК t-несущей и +-
хромосом и стабилизировать аллели, отличающие два данных типа
организации хромосомы 17. Ряд молекулярных исследований
подтверждает данное предположение. Так, например,
последовательности ДНК некодирующего участка Тср-1, D17 Lehl22-элемента, Тер-10b, Hba 4 ps - псевдогена-4 а -глобина показали различия между t - и +-формами около 1-2% (Willison et al., 1986,1987). Кроме того, ряд локусов кодирует белки, характерные исключительно для t -комплекса (Silver et al., 1980).
Однако еще в первой работе, посвященной анализу полиморфизма t-комплекса, в популяции мышей из Израиля было обнаружено наличие хромосом, включающих как t-специфичные аллели, так и аллели "дикого типа" в цис-положении (Silver et al., 1987). Впоследствии такие мозаичные хромосомы были зарегистрированы еще в нескольких популяциях. Некоторые авторы предполагают, что присутствие мозаичных хромосом в популяциях отражает картину предкового полиморфизма хромосомы 17, давшей начало как t-комплексу, так и современному "дикому типу" организации (Figueroa et al., 1987). С точки зрения других авторов, мозаичные хромосомы представляют собой результат генной конверсии или неравного кроссинговера между t-гаплотипом и нормальным гомологом, возможных благодаря наличию тандемно повторяющихся элементов (Hammer et al., 1991).
Поскольку абсолютное большинство изменений в структурной организации t-гаплотипов сопровождается нарушением сбалансированной генетической системы поддержания их в популяциях, вызванным в первую очередь уменьшением TRD , большая часть новообразованных комбинаций t- и +-аллелей элиминирует из природных популяций. Вследствие этого регистрируется лишь небольшая часть вновь возникающих мозаичных хромосом, и прежде всего те комбинации, которые обладают селективным преимуществом. Наряду с относительным консерватизмом организации t-гаплотипов был обнаружен полиморфизм по ряду t-специфических элементов соответствующего геномного района хромосомы "дикого типа". Этот факт заставил более детально проанализировать особенности структуры хромосомы 17 не только у представителей тех видов мышей, у которых обнаружен t-комплекс, но и других родственных видов, с целью определения возможных путей происхождения t-комплекса.
В настоящее время существование t-комплекса как варианта структурной организации хромосомы 17 зарегистрировано в популяциях четырех видов рода Mus: Mus musculus, Mus domesticus, Mus molossinus и Mus castaneus (Hammer et al., 1991; Kaneda et al., 1989). Особый интерес представляет организация хромосомы у вида Mus spretus. Если t-комплекс представлен 4 инверсиями - прицентромерной, проксимальной, медиальной и дистальной - по отношению к хромосоме "дикого типа", то хромосома 17 Mus spretus несет единственную инверсию, соответствующую проксимальной инверсии t-гаплотипов (Hammer et al., 1986). В связи с данным открытием возник вопрос, не является ли t-комплекс результатом первичной интрогрессии хромосомы 17 Mus spretus к Mus domesticus и Mus musculus. В сочетании с данными об относительно низком полиморфизме собственно t-комплекса в природных популяциях, эти данные отодвигают дату появления t-комплекса предположительно на период от 2 миллионов лет назад до разделения данных видов (Bonhomme, 1986). (Рис.4)
1. 2. 3. Взаимосвязь эффекта TRD и стерильности
Сопоставление данных, касающихся структуры и уровня TRD у природных и рекомбинантных гаплотипов, привели к выводу о том, что система нарушения менделевского расщепления в потомстве гетерозиготных по t-гаплотипам самцов контролируется несколькими факторами, различающимися как по их положению на хромосоме, так и функционально. Итоговая величина TRD определяется соотношением так называемых генов-дистортеров (Ted), локализованных проксимально, медиально и дистально в пределах t-комплекса и различающихся по своей активности, и гена-респондера, локализованного в области проксимальной инверсии t-комплекса (Tcr) (Silver, 1985). Различные авторы насчитывают от двух (Bennett е.а.,1988) или трех (Lyon, 1984, 1988,1989) до шести генов-дистортеров (Silver, 1985) действующих, по мнению большинства авторов, аддитивно. (Рис.2)
Предполагается, что взаимоотношения Ted - Tcr генов в гетерозиготном состоянии можно описать следующим образом. При наличии в t-гаплотипе одного лишь Тег - гена в отсутствие всех или большинства дистортеров уровень передачи t-несущей хромосомы снижается до 10-20%; при полном наборе дистортерных генов и наличии респондера наблюдается максимальная величина TRD - до 95%; при отсутствии одного-двух Ted-генов передача снижается до 40-60 % и при этом становится высоковариабельной. При отсутствии респондера расщепление в потомстве гетерозиготных самцов соответствует менделевскому (Lyon, 1984). Следует заметить, что TRD является характеристикой, достаточно легко модифицируемой инбредным возрастом или генетическим фоном линии не только самца, но и самки, участвующей в скрещивании (Демин и др., 1983; Bennett е.а.,1988).
Одним из наиболее рано обнаруженных свойств t-гаплотипов оказалось их специфическое влияние на мужскую плодовитость. Для оценки последней
было предложено понятие "единицы скрещивания" (Dunn, 1950; Bennett, Dunn ,1958). Фертильность самцов при этом показателе оценивается как число потомков на единицу скрещивания (е. с), где условной считается пара (1 самец х 1 самка), сидящая вместе в течение одного месяца. Стандартное сочетание (5 самок х 1 самец) х 2 месяца =10 е.с. На основании такого тестирования стерильными считаются самцы, которые не дали потомства при 10 е. с, а псевдостерильными - те, которые дали потомство менее, чем на 1 е.с, что соответствует, примерно, 20% (или менее) от уровня контрольной плодовитости.
В целом воздействие t -гаплотипов на мужскую плодовитость можно охарактеризовать следующим образом: самцы и самки гетерозиготы +/t или компаунды с находящейся в транс-положении маркерной микроделецией T/t, независимо от того, к какой категории жизнеспособности относятся t-гаплотипы, полностью жизнеспособны и нормально плодовиты (Braden, 1972, Braden, Glueckschen,1958). Самцы-компаунды по летальным гаплотипам (t x/ty) - стерильны. Самцы-компаунды по летальным или полулетальным и жизнеспособным гаплотипам в зависимости от сочетания гаплотипов проявляют широкий спектр изменчивости в диапазоне от почти стерильных до почти нормально плодовитых, часто проявляется псевдостерильность. Половое поведение стерильных и псевдостерильных самцов не отклоняются от нормы и наблюдаемые эффекты бесплодия не связаны с ранней эмбриональной смертностью. Необходимо подчеркнуть, что животные имеют нормальный фенотип, плодовитость самок "стерильных" и псевдостерильных генотипов, в отличие от таких же самцов, остается нормальной.
При исследовании мужской стерильности у самцов-носителей t -гаплотипов, было установлено, что стерильность гомозигот отличается от стерильности гетерозигот.. Стерильность гомозигот сопровождается уменьшением размеров тестикул, нарушением сперматогенеза, высоким
процентом аномальных спермиев и падением количества производимых самцом спермиев (Bennett, Dunn ,1967; Bennett, Dunn, 1971; Johnson 1968; Bennett ,et al ,1959). Гомозиготы по гаплотипам twl8 (полулетали) имеют средний вес семенников_примерно вдвое меньший, чем у других исследованных категорий самцов, и у стерильных компаундов t 7ty в том числе. Результатом недоразвития семенников являются почти полное отсутствие спермиев (Dunn, Gluecksohn- Walesch, 1950, 1953) в гениталиях самок, покрытых такими самцами. Результаты анализа веса семенников и количества спермиев у самок показывают, что по этим показателям стерильные компаунды не отличаются от контрольных +/t животных и фертильных гомозигот t x/ty. Установлено также, что количество аномальных спермиев у стерильных компаундов не выходит за пределы нормальной изменчивости, и что нет корреляции в этих случаях между частотой дефектных спермиев и плодовитостью (Bryson, 1944; Braden , 1944). Было проведено изучение половых путей самок в интервале 6-24 часов после спаривания со стерильными и псевдостерильными компаундами по t-гаплотипам. Подсчитывали количество сперматозоидов и оценивали их подвижность.
На основании результатов экспериментов было сделано предположение, что стерильность, или псевдостерильность, связаны не с уменьшением количества продуцируемого самцом семени, а с определенными дефектами сперматозоидов и, прежде всего, нарушением их подвижности. По этой причине спермин не достигают места оплодотворения, а те, которые все-таки достигают яйцеклетки, сохраняя подвижность, оказываются неспособными к оплодотворению. Учитывая данное обстоятельство, были сделаны попытки переноса с помощью инъекции спермиев от компаундов по летальным гаплотипам (tw 8/tw32) непосредственно в яичники (Olds-Clark, 1977). Оказалось, что оплодотворяющая способность спермиев, несмотря на то, что они находились вблизи готовых к оплодотворению яйцеклеток, является
чрезвычайно низкой по сравнению с контрольным вариантом, проявляющим высокую оплодотворяющую способность. Таким образом, стерильность компаундов по летальным и полулетальным гаплотипам можно рассматривать как "генотипическую" в отличие от "физиологической" стерильности гомозигот, поскольку она связана не с уменьшением числа образуемых сперматозоидов, а с нарушением контроля их развития. Последнее обстоятельство отражается, с одной стороны, на подвижности спермиев, которые в большинстве своем не проходят через фаллопиевы трубы, и с другой - на оплодотворяющей способности спермиев, достигших места оплодотворения (Bennett, Dunn, 1967, Gluecksohn-Waelsch, Erickson, 1971). В дальнейшем эти предположения подтвердились работами Кинг и др., (King, 1996; Patel-King,1997), в которых было показано, что гены, контролирующие подвижность сперматозоидов относятся к категории, так называемых, дистортеров и респондеров, обуславливающих не только подвижность спермиев, но и связанное с ней явление «нарушения расщепления (segregation distortion)» или «нарушения соотношения передачи t-несущей хромосомы потомству гетерозиготных самцов».
На ранних этапах изучения свойств t-комплекса предполагалось тесное сцепление факторов летальности, стерильности и TRD, однако не их полная идентичность (Lyon, Mason, 1977). В работах М. Лайон и соавторов первоначально было выдвинуто предположение о наличии в t-комплексе трех раздельно расположенных факторов стерильности - SI, S2 и S3 (Lyon, 1984), обладающих, как и дистортеры, аддитивным действием. В последующее время господствующей стала гипотеза о единстве факторов стерильности и дистортеров (Tcd=S=tcs) (Silver, 1985; Lyon, 1986). Предполагалось, что белковые продукты, кодируемые генами Ted, вызывают инактивацию +-несущих спермиев, возможно, связывая их по типу реакции комплемента, у гетерозигот +/t. При сперматогенезе у гомозиготных или компаундных по t-гаплотипам самцов инактивирующие
эффекты двух гаплотипов вызывают полную или частичную стерильность (Lyon, 1986). Эксперименты, сочетавшие методы молекулярного анализа t-гаплотипов с методами классической генетики, позволили по-новому оценить взаимоотношения дистортерных и респондерного генов. В работе Силвера и Ремиса, посвященной данному вопросу, был сделан вывод о первичной роли гена-респондера в нарушении менделевского расщепления.
В использованных авторами сочетаниях t-гаплотипов преимущество в наследовании получала Тсг-несущая хромосома. Также данными авторами был сделан вывод о существовании прямой зависимости величины TRD от числа и активности генов-дистортеров. Согласно полученным ими данным, отсутствие дистального дистортера снижает TRD почти до 50%, а в отсутствие проксимального или медиального дистортеров величина преимущественной передачи t-несущей хромосомы колеблется от 60 до 90% (Silver, Remis,1987). Тем не менее, последующая работа Лайон показала, что увеличение TRD в пользу хромосом, несущих большее количество Ted-факторов, не является постоянным эффектом (Lyon, 1989). Согласно полученным данным, использованные в эксперименте t-гаплотипы в соответствии с их TRD можно было подразделить на несколько групп, которые, по мнению М. Лайон, характеризуются различиями в структуре самого респондерного гена у t-гаплотипов различного происхождения (Lyon, 1989). Неожиданные результаты дало исследование влияния на величину TRD t-гаплотипов делеции проксимального фрагмента хромосомы 17 - Т22Н, захватывающей область, в которой картирован проксимальный дистортер Ted 1. Оказалось, что присутствие данной делеции увеличивает TRD частичных гаплотипов таким же образом, как и присутствие t-формы гена-дистортера. Исходя из этих данных, Лайон выдвинула предположение о том, что проксимальный дистортер, а возможно, и другие Ted -факторы являются аморфами или гипоморфами (Lyon, 1992). Согласно М. Лайон, ведущую роль в
worm СКАЯ
ГОСУДАР(-;ГЕЯїП
БИБЛИОТЕКА определении эффекта TRD играет исключительно t-форма гена-
респондера, отвечающего, по-видимому, за инактивацию или разрушение
белковых продуктов +-форм дистортеров (Lyon, 1992).
Взаимодействие генов, определяющих стерильность, изучалось на самцах
мышей, несущих ряд частичных t-гаплотипов, отличных по содержанию
двух главных факторов стерильности, ЭЦили Ted 1) и S2 (или Ted 2),
внутри прицентромерной и дистальной инверсий соответственно.
Поскольку стерильность может быть плейотропным результатом дефектов
спермий, провели детальное исследование различных функциональных
параметров последних, включая подвижность, капацитацию ( т.е.
способность сперматозоида к оплодотворению) связывание в зоне
пеллюцида, связывание с мембраной ооцита и проникновение зоны
пеллюцида свободного ооцита. Оказалось, что каждая из зон локализации
этих факторов содержит множество генов, способных обеспечить
стерильность. Следовательно, результаты указывают, что гены внутри S1
взаимодействуют с генами в S2 во всех исследованных функциях спермы.
Однако, расположенные в S1 и S2 гены, действующие на подвижность,
взаимодействуют аддитивно, в то время как гены тех же факторов S1 и S2,
действующие через другие характеристики сперматозоидов,
взаимодействуют как синергисты. Кроме того, образцы синергизма
обнаруживались между S1 и S2 аномалиями в капацитации и связывании с
мембраной ооцита. Это позволяет предполагать наличие трех дефектов,
вызванных мутацией одних и тех же генов внутри каждого из факторов
стерильности. Эти данные служат не только инструментом, объясняющим
дефекты различные спермий t-гаплотипов, но могут способствовать более
полному пониманию клеточных и генетических механизмов,
поддерживающих самцовую стерильность.
1. 2. 4. Обнаружение t-специфических генов стерильности
Картирование и определение последовательности гена-респондера в
последние годы являлось основным направлением молекулярных
исследований, посвященных проблемам стерильности и неменделевского наследования t-комплекса. Изучение генетических характеристик t-гаплотипов и молекулярный анализ их структуры позволил локализовать положение гена Тег в области семейства D17 Leh66 ДНК-элементов в районе протяженностью менее 500 т.п.н. Более 400 т.п.н. этой области было клонировано с целью анализа +-формы респондера (Schimenti, Bullard, 1988). Каждый клон из числа кросс-гибридизующихся D17Leh66 последовательностей был использован в качестве пробы для нозерн-гибридизации с poly (А)+РНК, выделенной из тканей мышей, принадлежащих к инбредной линии, не несущей t-комплекса. Были отобраны пробы, избирательно гибридизующиеся с РНК ткани семенников взрослых самцов. Данные пробы были использованы для скрининга и создания библиотеки кДНК; полученные клоны кДНК были секвенированы. Проведенный сравнительный анализ показал значительное сходство между четырьмя кДНК клонами и двумя исходными клонами, напоминающее результат альтернативного сплайсинга (Schimenti, Bullard, 1988, 1989). На основании данных сиквенса была предложена последовательность с открытой рамкой считывания, которая могла бы кодировать полипептид, состоящий из 438 аминокислотных остатков (Bullard, Schimenti, 1991). Детальный анализ ряда t-гаплотипов позволил ограничить область вероятной локализации Тсг-гена участком ДНК протяженностью от 30 до 140 т.п.н. в D17 ЬепббВ-элементе. В данной области была обнаружена единственная транскрибирующаяся в семенниках мыши последовательность, получившая название Тер-10 b -testicular cell protein - 10b (Shimenti et al., 1988; Rosen et al.,1990). По данным Чименти, Тер 10 b является наиболее вероятным кандидатом на роль респондера в t-комплексе. Тер 10 b демонстрирует уникальный постмейотический сплайсинг в семенниках, a TCP 10 -протеин аккумулируется в круглых сперматидах (Ewulonu 1993). Экспрессия продуктов как +-, так и t-формы Тер-10 b определялась впервые на стадии
предмейотических диплоидных сперматоцитов и продолжала обнаруживаться в постмейотических гаплоидных клетках (Cebra-Thomas е.а., 1991). Кроме того, результаты, полученные в ходе экспериментов с использованием трансгенных мышей, показали явную функциональную связь между Тер-10 b и t-формой гена-респондера (Bullard е.а., 1992). Следует отметить также, что при изучении экзон-интронной структуры функционально активного Тер- 10Ь t-гена, был обнаружен псевдоген Тср-10 ps-t, соответствующий фрагменту ДНК D17Leh66C 7b 0-3 (Bullard, Schimenti,1991).
Однако попытки подтверждения роли данного псевдогена как респондера пока остаются безуспешными, поскольку мыши с частичными рекомбинантными гаплотипами, не имеющими функциональных копий генов Тер 10 Ь, продолжали проявлять уровень TRD, характерный для t-гаплотипов (Green et al, 1996). Одно из возможных объяснений этих результатов заключается в том, что респондер, который всегда действует в цис-положении, сам по себе не кодирует протеин, но представляет собой последовательность ДНК, которая связывает протеины дистортеров. Согласно этой модели, единственный путь идентификации респондера -это найти его по способности связывания продуктов дистортеров, ни один из которых, впрочем, не был окончательно определен генетически. В целом в семействе D17 Ьепбб-элементов зарегистрирован ряд транскрибирующихся генов, функции которых остаются пока невыясненными. По мнению Германа с соавт.(Неггтапп et al., 1999) причиной неменделевского наследования t-несущей хромосомы потомством гетерозиготных самцов мышей является кодируемая геном-респондером Тег мутантная форма протеинкиназы. Согласно предложенной авторами схеме, аддитивно действующие в составе одного гаплотипа дистортеры нарушают функцию жгутиков у всех сперматозоидов - как +-, так и t-несущих, а наличие респондера обеспечивает защиту t-несущим сперматозоидам, но не сперматозоидам
дикого типа. Таким образом, t-несущие сперматозоиды имеют
преимущество по сравнению со перматозоидами дикого типа в отношении
оплодотворения яйцеклеток. В связи с таким предположением Тег
изолировали с помощью позиционного клонирования и показали, что он
является членом нового протеинкиназного семейства генов,
обозначенного как Smok, которое экспрессируется в течение позднего сперматогенеза. Smok-киназы являются компонентами сигнального каскадного механизма (когда первый фермент воздействует на второй, второй на третий и т.д., - главным образом, в реакциях фосфорилирования с целью обеспечения быстрого появления больших количеств активной формы последнего фермента цепи), который обеспечивает подвижность сперматозоидов. Продукт Тег имеет редуцированную киназную активность, что может позволить ему уравновешивать сигнализирующие повреждения, вызванные действием дистортеров. Тег в составе трансгенных конструкций вызывает не-менделевскую передачу хромосом, на которых он находится. Выделение Тег вместе с Y-хромосомой приводит к нарушению соотношения полов в потомстве трансгенных особей. Следует заметить, что TRD является достаточно легко модифицируемым показателем инбридинга или генетическим фоном линии не только самца, но и самки, участвующей в скрещивании (.Демин, Сафронова,1981; Fraser, Dudley, 1999).
В целом, количество генов, идентифицированных как потенциальные
дистортеры, довольно велико, что является несомненным отражением
больших генетических расстояний, определенных в исследованиях . Лайон
( Lyon, 1992). Среди этих генов - Tcte2, Tcpll, Tctexl и Tctex2.
Теоретически, их роль в TRD и стерильности может быть определена
путем создания трансгенных животных, но данные ни по одному из
изученных генов пока не показали увеличения дистортернои активности на
генетическом фоне присутствующего респондера. Возможным
объяснением данного явления, как уже отмечалось, является то, что
хромосома 17 «дикого типа», обладающая делецией по району ДНК, соответствующему дистортеру -1, демонстрирует такое же TRD, как и t-гаплотип (Lyon ,1992). Из этого можно заключить, что дистортер является аморфом или гипоморфом и что мыши t/+ обнаруживают достаточное количество гаплоидных продуктов генов-дистортеров. В этой ситуации только респондер Tcr-t, который проявляет большую резистентность к продукту дистортера, чем его «нормальный» гомолог Тег +, сохраняет свою активность, и сперматозоиды, несущие t-хромосому, остаются функционирующими. Приложимы ли аморфные модели к другим дистортерам - пока не установлено.
Кандидат на роль дистортера Ted 3, ген Tctex2 входит в состав генного семейства, впервые описанного Ладер с соавт. (Lader et al, 1989). Первоначально предполагалось, что он кодирует поверхностный протеин хвоста сперматозоида (Huw, 1995), но в последнее время стало известно, что его продуктом являются легкие цепи динеина - белка, характерного не только для аксонемных "ручек" сперматозоидов мыши, но и для сперматозоидов других видов животных, таких, как морской еж, канадская форель или лосось. При этом предполагается, что недостаточное фосфорилирование этого белка может быть причиной снижения скорости поступательного движения семени (Inaba et al,1999). Поскольку, как полагают (Green et al, 1996), изгибание жгутика связано с присоединением динеиновых отростков А-микротрубочек к В-микротрубочкам в периферических фибриллах, при котором осуществляется гидролиз АТФ, а инициация первоначального изгиба происходит с участием только 5 из 9 периферических фибрилл на одной стороне жгутика (остальные 4 фибриллы включаются позже), то нарушение процесса фосфорилирования легких цепей динеина может заблокировать включение четырех остальных фибрилл и привести к остановке двигательной функции сперматозоидов, а также кривизне жгутиков в фенотипической форме "завитка".
Пазоур с соавт. (Pazour et al, 1999) предполагают, что мутантные формы
динеина, синтезируемые t-гаплотипами у мышей, являются
нефункциональными. В комбинации с динеином «дикого типа» они
образуют гетеродимеры, в результате чего возникает дисфункция
ресничек, и +-несущие сперматозоиды теряют подвижность. В итоге
сперматозоиды, несущие t-гаплотип и соответственно ген Tcr-t, получают
преимущество в процессе оплодотворения. Кроме того, при
молекулярном анализе белка весом 19 Kd от Chlamydomonas Пазоур с соавт. (Pazour et al, 1999) обнаружили, что он представляет собой гомолог белка t-комплекса, кодируемого геном Tctex2, который является одним из кандидатов на роль продукта дистортера и вызывает нарушение менделевского расщепления. Исследованный белок экстрагируется из аксонемы и мигрирует в градиенте плотности вместе с динеином внешних «ручек». Он также специфически отсутствует в аксонемах мутантов, которые не собирают внешних «ручек». Эти данные позволили авторам (Pazour et al, 1999) выдвинуть предположение, что Tctex2 является динеиновым компонентом жгутика сперматозоида. Tctexl можно рассматривать как биохимическую модель появления специфических дефектов спермиогенеза, результатом которых является неполноценность сперматозоидов «дикого типа» по отношению к t-несущим сперматозоидам. Рассмотренная аналогия вполне согласуется с современными представлениями о структуре генома млекопитающих, в котором нашли свое отражение не только гены, характерные для высших, но и для низших, простейших, животных.
Точное картирование локусов Ted и Тег на 17 хромосоме мыши позволило клонировать ряд других последовательностей ДНК, рассматриваемых в качестве наиболее вероятных кандидатов на роль «второстепенных» дистортеров (Braidotti, Barlow, 1997; Hurst, 1993; Lader et al.,1989; Mazarakis et al,1991; Rappold et al., 1987; O'Neill, Artzt,1995). Например, ген Tcpll, претендующий на роль дистортера, который был выделен и
идентифицирован в районе t-комплекса (Ма2агакіз,1991),зкспрессируется только в половых клетках семенников. Его транскрипты появляются в течение мейоза, но протеина, кодируемого им, не удается обнаружить вплоть до стадии предшествующей появлению зрелых сперматозоидов (Hosseini, 1997), т.е. транслируется он только во время спермиогенеза, и его протеин располагается как на головке, так и на жгутике сперматозоида. На основании экспериментальных данных было установлено, что протеин TCP-11,. вероятно, выполняет роль рецептора для TRD-связанного пептида FPP (fertilization promoting peptide), запускающего аденилатциклазный путь превращения неактивного спермия в активный и даже гиперактивный (Yanagimachi,1981). Согласно имеющимся представлениям спермин семенных канальцев неподвижны, их дозревание и приобретение способности к движению происходит, главным образом, в канальцах эпидидимиса при их перемещении из краниальной его части в каудальную (Дыбан, 1998). Возможно, это связано с накоплением циклической АМФ и изменениями молекулярной организации мембран. Окончательную готовность к оплодотворению сперматозоиды млекопитающих приобретают в результате капацитации, происходящей в половых путях самки. В связи этим вся цепочка указанных превращений, обуславливающая процесс капацитации и повышение оплодотворяющей способности спермиев, со значительной степенью вероятности, теперь может быть представлена более полно, чем это делалось ранее (Fraser,1998, Fraser, Hosseini, 1997).
1.3. Специфические гены гибридной стерильности (Hst)
Впервые предположение о существовании специфических генов гибридной стерильности (Hst - hybrid sterility) у мышей было высказано И.Форейтом и Иваний (Forejt, Ivanyi, 1975; Forejt, 1981) на основании
анализа ряда скрещиваний линейных и диких мышей. Самцы, полученные от скрещивания диких мышей Mus musculus с представителями лабораторной линии C57BL/10ScSnPh, были стерильны, а самки имели нормальную плодовитость. В то же время все потомство исходных форм (диких мышей и линейных особей) было фертильным. Дальнейший анализ, проведенный с помощью возвратных скрещиваний - самок F1 с дикими самцами, показал, что только половина полученных самцов была стерильна. Данное обстоятельство обычно свидетельствует о моногенном характере наследования (Forejt, Ivanyi, 1975).
Последующие исследования с привлечением других лабораторных линий мышей и дикоживущих мышей Mus musculus из различных географических точек позволили определить несколько аллелей данного гена, получившего название гена гибридной стерильности -1 (Hst-1). Использование биохимических методов дало возможность картировать его положение на 17 хромосоме, в участке между маркерной Т-мутацией и Н-2 - комплексом гистосовместимости, т.е. в районе t-комплекса. Однако Hst-І не является одним из факторов стерильности t-комплекса, так как все возможные комбинации аллелей Hst-1 с t-гаплотипами не влияли на плодовитость самцов (Forejt, 1985). Следует отметить, что моногенный характер стерильности самцов, связанной с Hst-І, был отмечен только в возвратных скрещиваниях гибридных самок с дикими самцами. При скрещивании этих же самок с самцами из родительской линии наблюдалась более сложная картина наследования, позволяющая предположить участие в определении фертильности самцов-бэккроссов по крайней мере трех неаллельных генов (Forejt, Ivanyi, 1975). В последующих работах, посвященных изучению гибридной стерильности у мышей, в качестве объектов были использованы мыши вида Mus spretus и лабораторные нелинейные мыши (Mus domesticus). Самцы, полученные от скрещивания мышей этих видов, как правило, стерильны, самки нормально плодовиты (Bonhomme et al, 1982). Анализ потомства, полученного в
результате возвратных скрещиваний гибридных самок и линейных самцов мышей, позволил выявить два независимых гена гибридной стерильности -Hst-2 и Hst-З. Как показали молекулярно-генетические исследования с использованием более чем 130 ДНК-проб, данные гены располагаются соответственно на 9 и Х-хромосомах мыши (Bonhomme et al, 1982, Guenet etal, 1990).
В связи с обнаружением инвертированного проксимального участка у современной хромосомы 17 М. spretus (Hammer е.а., 1989), как уже было отмечено выше, возник вопрос, не является ли t-комплекс результатом первичной интрогрессии хромосомы 17 от М. spretus к М. domesticus и М. musculus. Проведенные с целью проверки данного предположения экспериментальные скрещивания (серии бэкроссов до 9 поколения включительно) показали наличие асимметричной гибридной стерильности у особей, несущих хромосому 17 М. spretus на генетическом фоне М. domesticus, но не в обратном сочетании. Комбинация хромосомы 17 М. spretus с t-гаплотипами обусловливала симметричную стерильность гибридных самцов на генетическом фоне каждого из использованных видов (Pilder е.а., 1991). Эти результаты показали, что, несмотря на кажущееся сходство в организации, современные t-гаплотипы функционально не родственнны современной хромосоме 17 Mus spretus, и гипотеза интрогрессии не является вероятной (Pilder е.а., 1991). Следует также отметить, что инвертированная структура хромосомы 17 М. spretus по отношению к той же хромосоме М. domesticus, как и случае t-гаплотипов, сама по себе не влияет на плодовитость.
Оба обнаруженных вида стерильности авторы связывают с одним и тем же геном Hst-4, картированного с помощью блот-гибридизации с ДНК-пробами на 17 хромосоме дистальнее гена Hst-І, и действующим независимо от последнего (Pilder etal., 1991). Проявления стерильности, обусловленной данными генами, также различно. Самцы мышей, несущие разные аллели Hst-І, обнаруживают недоразвитие семенников и отсутствие
спермы (Forejt, Ivanyi, 1975), тогда как стерильность самцов, вызванная Hst-4, проявляется сходным образом со стерильностью, обусловленной t-комплексом (Pilder et.al., 1991). Однако, если симметричная стерильность гибридных самцов легко может быть объяснена как моногенный признак, то в случае асимметричной стерильности авторы предполагают наличие несовместимости белкового продукта, кодируемого последовательностью Hst-4 Mus domesticus, с продуктами последовательностей, расположенных на 17 или других хромосомах Mus spretus. Таким образом, асимметричная гибридная стерильность является в конечном итоге результатом действия системы генов. Интересно, что Hst-4 картируется в том же районе, что и наиболее активный из генов дистортеров t-комплекса Ted 2, гомозиготность по которому (в присутствии гена-респондера), как правило, определяет стерильность самцов.
Предполагалось, что гены Hst на хромосоме 17 «дикого типа» могут соответствовать локусам дистортеров t-гаплотипов (Hurst, 1993, Pilder et al.,1993). Ted 2 (дистортер 2), по крайней мере, действует совместно с аллелями факторов Ted (других дистортеров) и Тег (респондера), на что указывает и нарушение передачи хромосомы 17 у фертильных самцов, несущих 17 хромосому Mus spretus на генетическом фоне Mus domesticus, и полная стерильность самцов при сочетаниях хромосомы 17 М. spretus с t-гаплотипами (Pilder et.al, 1991).
Точное картирование локусов генов-дистортеров и респондера на 17 хромосоме мыши позволяет провести их клонирование, с тем, чтобы идентифицировать гены, определяющие эффекты t-комплекса. Однако, хотя кандидаты на роль респондера (Ewulona et al.,1993) и дистортеров (Ted 1 - Nell, Artzt,1995; Ted 2 - Mazarakis et al.,1995; Ted 3 - Rappold et al.,1987; Haw et al.,1995; Libby, 2003) уже клонированы, но до сих пор еще однозначно не идентифицированы. Что же касается генов Hst, то кандидаты на эти роли пока что не были обнаружены. В сообщении Брайдотти и Барлоу (1997) описан ген, названный Tcte2, экспрессирующий
на семенниках t-комплекса. Было выявлено, что Tcte2 экспрессирует исключительно в терминальных клетках самцов в течение первого мейотического деления. При этом производится множество транскриптов, причем один класс транскриптов обладает открытой рамкой считывания, в то время как второй, для которого наблюдается недостаток открытой рамки считывания, вариабилен (за счет альтернативного сплайсинга) у различных видов мышей. Экпрессия протеина Tcte2 всецело ограничена теми стадиями мейоза самца, когда наблюдается сегрегация гомологичных хромосом. Хотя биохимическая роль Tcte2 неизвестна, его локализация и избирательность экспрессии позволила предложить его на роль одного из дистортеров. Иначе говоря, Tcte2 отвечает некоторым критерям для Hst-1 гена. Однако, недавнее картирование Hst-1 (Gregorova et al.,1996) показало, что маловероятно, чтобы Tcte2 представлял Hst-І сам по себе, - скорее, он соответствует одному из модификаторных генов, необходимых для собственной экспрессии Hst-І фенотипа. Кроме того, ген Hstl на хромосоме 17 дикого типа, возможно, соответствует дистортерному локусу t-гаплотипа (Hurst, 1993; Pilder,1993).
Молекулярные механизмы, обьясняющие самцовую специфичность стерильных гибридов, основываются прежде всего на эффекте нерасхождения X-Y-половых хромосом. Однако гены гибридной стерильности были картированы и на аутосомах (Wu,C. I., Rappold M.F., 1994). В некоторых случаях возникновение стерильности предполагает вовлечение в процесс большей части дивергирующих локусов многих совместно действующих минорных генов. Более «сильные» локусы были идентифицированы, причем они оказались единственной внутривидовой вариацией гена, объясняющей гибридную стерильность самцов. Эти локусы приковывают внимание исследователей, поскольку позволяют решить некоторые проблемы видообразования на молекулярном уровне. Однако гены, ответственные за гибридную стерильность у абсолютного большинства видов, еще не клонированы. Среди кандидатов на роль генов
гибридной стерильности (Wu, Rappold, 1994) картированы 4 отличные от дикого типа формы на 17 хромосоме. Hst-І локус совместно с тремя или четырьмя модифицированными генами контролируют стерильность гибридных самцов М. domesticus и М. musculus (Forejt, Ivany,1975; Forejt, 1985; Gregorova et al.,1996). Hst-4 (Pilder et. al., 1991), Hst-5 и Hst-6 (Pilder et. al,1993) контролируют стерильность самцов у M.spretus. Механизм, при котором Hst-аллели разных видов представляют собой «пусковой механизм» стерильности гибридных самцов, как и то, что является «мишенью» этого механизма, пока что не известен. Однако обнаружены случаи патологии у гибридных самцов: определенные аномалии в мейозе I, характерные для Hst-І и дефекты хвоста спермия -для Hst-5 and Hst-6 (Forejt, 1985).
Незначительная подвижность спермы, характеризующаяся четкой аберрацией волнистой формы жгутика, известной как "курчавый", является отличительным признаком гомозиготной стерильности самцов, несущих t-гаплотипы. Предыдущие исследования отнесли "курчавость" и дефект развития жгутика, называемый "отсутствие эффекта хлыста", к локусу гибридной стерильности Hst- 6, локализуемым между маркерами Piml и Cryal. Более поздние эксперименты по межвидовому скрещиванию Mus spretus и М. Domesticus картировали первичный источник обоих признаков в виде небольшого суб-локуса Hst-6 - Ccua (Curlicue -«курчавость»). (Рис. 5)
В работе Фозелла с соавт (Fossella et al,2000) сообщается о полной физической изоляции локуса Ccua и идентификации в его проксимальном участке кандидата в гены, оределяющего как "отсутствие эффекта хлыста", так и "курчавости" - гена тяжелой цепи аксонемного динеина, Dnahc8. Формально Dnahc8 был картирован около гена Piml с помощью анализа внутривидовых бэккроссов. Экспрессия тРНК гена Dnahc8 начинается в семенниках у М. domesticus дикого типа как раз перед сбором жгутика и является специфичной для семенников взрослых самцов. Однако
экспрессия Dnahc8 практически не обнаруживается в семенниках как М. spretus, так и у животных с признаком "отсутствие эффекта хлыста", гомозиготных по spretus-аллелю гена Dnahc8 на фоне генотипа М. domesticus . Эти результаты доказывают, что Dnahc8 является фундаментальным для организации и функции жгутика у М. domesticus, но не у М. spretus.
Hst-6 может рассматриваться как наиболее вероятный кандидат на роль факторов Ted (=S)2, расположенных в дистальной части t -комплекса. Самцы мышей, гетерозиготные по аллелям Hst~6 М. spretus и t-гаплотипам, (Hst6 / t) являются стерильными, поскольку продуцируют аномальные (закрученные) жгутики спермиев, неотличимые от такового спермия t / t гомозигот. Самцы с генотипом Hst6 / Hst6 являются также стерильными, однако продуцируемые ими спермин являются полностью неподвижными из-за отсутствия собранного жгутика. Как было показано впоследствии, в полном выражении «кучерявость» жгутика вызывается взаимодействием нескольких факторов: Curlicue а (Ccua), локализованного проксимально, и Curlicue b (Ccub) - дистально, с фактором, воздействующим на сперма-оолемма проникновение, Stopl р, который картируется между ними. Последний был выявлен при количественном анализе оплодотворяющей способности спермы мышей с генотипом s/t и +/t в оношении яйцеклеток, освобожденных от зоны пеллюциды. Эти данные позволили предположить, что Stopl является сложным локусом, состоящим, по крайней мере, из двух генетических элементов. Один из них (проксимальный) частично перекрывает л оку с Hst-б, тогда как второй расположен дистальнее данного локуса (Redkar, 1998). Hst-7, еще один локус гибридной стерильности мыши, был картирован вблизи от серии четырех других локусов гибридной стерильности на проксимальной части 17 хромосомы внутри t-комплекса. Как уже отмечалось, гибриды самцов мышей, несущих хромосому 17 М. spretus на генетическом фоне (бэкграунде) «дикого типа» М. domesticus, были
стерильны (Pilder е.а., 1991). Аллели Hst-7 на 17 хромосоме «дикого типа» (+) отличны от таковых как на ее структурно вариантном гомологе, известном как t-гашютип (t), так и на 17 хромосоме М. spretus (s). Самцы Hst-7+ продуцируют сперму, которая после выхода из эпидидимиса обнаруживает умеренную астеноспермию (их скорость по прямой равняется 49-+4 мт/ сек, что значительно ниже, чем скорость сперматозоидов контрольных конгенных животных дикого типа). Самцы Hst-7 генотипа s/t производят сперматозоиды с низкой подвижностью. Кроме того, эти спермин проявляют вариабильность аномалий жгутиков. Около трети из них имеют нормальные головки, прикрепляющиеся к мешкоподобному каудальному району. Мешкоподобный каудальный район формируется в результате сокращения шейки (хомута) и средней части ( цитоплазмы мешка), содержащей бесформенные аксонемные элементы. Часть спермы мышей генотипа s/t имеет жгутик с нормальной на вид аксонемой, хотя у многих спермиев отмечается увеличение содержания цитоплазмы. Жгутики часто имеют неорганизованные или нарушенные аксонемные элементы. Митохондрии s/t спермий также обнаруживают диффузный и вакуолизированный матрикс, напоминающие таковой у мейотических зародышевых клеток. Эти данные позволяют предположить, что Hst -7 как М. spretus, так и t-гаплотипов являются дефектными аллелями, которые вносят вклад в формирование нескольких астеноспермальных фенотипов и генетически взаимодействуют между собой с итоговым эффектом нарушением развития жгутика (Pilder et. al., 1997).
Ранние исследования продемонстрировали, что генетическое
картирование положения Hst-7 перекрывает tstl (ted 1)фактор стерильности. Хотя одного факта генетического перекрывания недостаточно для того, чтобы постулировать вовлечение Hst-7 в экспрессию tcsl и родственность их влияния на стерильность самцов, четыре наблюдения говорят в пользу этого предположения. Во-первых,
значительное увеличение аномалий, обнаруживаемых в спермеатозоидах s/t самцов по сравнению с самцами s/+, позволяет предполагать, что t-аллели Hst-7 проявляют мутантные свойства, отличные от +-аллелей. Во-вторых, деструктивные последствия от экспрессии доминантного негатива s-аллелей Hst-7, нейтрализуются посредством взаимодействия только с аллелями дикого типа (+), подразумевая, что t-аллели Hst-7 являются нулли аллелями. В-третьих, подвижность сперматозоидот Hst-7 гетерозигот значительно понижена (Olds-Clarke, 1993). В-четвертых, одна из вызываемых Hst-7 аномалий сборки жгутика морфологически идентична тому фенотипу сборки жгутика, который характерен для сперматозоидов самцов, гомозиготных по Hst-б -аллелям (кандидатам на роль ted 2) (Pilder, 1993). Эта наблюдаемая фенотипическая эквивалентность двух разных генотипов предполагает возможное клеточное взаимодействие между Hst 7 и Hst 6, - аналогичное тому, которое ожидается между tcs 1 и tcs 2. В то время как каждое из этих наблюдений является недостаточным для проверки предположения об идентичности Hst-7 и tcs 1, эти данные, взятые вместе, свидетельствуют о высокой вероятности вовлечения Hst-7 в экспрессию tcs 1. Представленные данные также предполагают потенциальное взаимодействие между Hst-7 и Hst-б в сборке и функции жгутика. Таким образом, фенотипическая дифференциация, производимая различными аллелями Hst, создает возможность для изучения взаимодействия не только различных аллелей гена друг с другом, но также и их продуктов.
Хотя астеноспермия - главная причина мужской стерильности, о генетических основах аномального движения сперматозоидов у человека известно очень мало. Тем не менее, имеются прямые доказательства значительной гомологии и синтении между генами, обнаруживаемы у мыши и человека (Silver et al., 1993). Гомологи генов t- комплекса, экспедирующих в семенниках, были обнаружены для хромосомы 6 человека (Hamvas et al., 1996).Таким образом, изучение генов, которые
воздействуют на развитие жгутика и функцию сперматозоида у мышей, может быть применимо для выявления механизмов человеческой астеноспермии (снижение подвижности.)
Ранние исследования показали, что при нормальном течении развития и
созревания спермы млекопитающих, представляют собой уникальный
способ морфологической дифференциации их митохондрии (Andre, 1962).
Казалось, что митохондрии премейотических зародышевых клеток должны
быть морфологически схожими с большинством соматических клеток.
Однако оказалось, что в течение мейоза митохондрии с диффузным и
вакуолизиро ванным матриксом, позже во время созревания
сперматозоида в эпидидимусе, митохондрии замещаются 3
морфологически различным слоем с конденсированным матриксом. Хотя
этот морфологический способ дифференциации соответствует
отличительным биохимическим изменениям в митохондриях (De Martino et
al,1979), в настоящее время немного известно о том, как эти изменения
могут воздействовать на подвижность сперматозоидов. Самцы мышей,
несущих ted (=S)1, показывают астеноспермию. Хотя оказалось, что
аксонема их сперматозоидов развивается нормально, митохондрии многих
из них, по-видимому, не меняют морфологию, характерную для
мейотических клеток, и развитие митохонриальногой оболочки (футляра)
часто является аберрантным. Ранее сообщалось, что селениум-
связывающий протеин, названный МСР, образует нерастворимую капсулу
вокруг митохондрий сперматозоида и недостаточность селениума ведет к
аномалиям развитии, включая дезорганизованный митохондриальный
футляр (Calvin et al., 1981). Другие исследования продемонстрировали, что
митохондриальный футляр прикрепляется к лежащей системе
(филаментов), названных субмитохондриальный ретикулум (SMR) (Olson,Wintrey, 1985) . Эти филаменты внутри латерально связаны, соединяются каудально и считаются, что при дифференциации поддерживают правильное распределение митохондрий в
митохондриальном футляре. Можно строить различные спекуляции о том, какие взаимоотношения связывают Hst-7 с МСР, метаболизмом селениума или SMR, но определение точной роли Hst-7 в положении митохондриального футляра требует изоляции и молекулярной характеристики этих различных аллелей.
Сперматозоиды самцов мышей ted 1- генотипа показывает такую малую подвижность, что их неспособность к оплодотворению не удивительна. Однако,, объяснение причин стерильности самцов s/t генотипа менее доказательно. Поскольку подвижность сперматозоида от самцов последнего генотипа уже позволяет ей проникать в зону свободной яйцеклетки (Olds-Clarke, 1993; Pilder et al., 1993), то акросомная реакция этих сперматозоидов, возможно, имеет нормальную функцию. Таким образом, сперматозоид не показывает очевидных дефектов, кроме снижения подвижности, создавая тем самым подходящую модель для изучения влияния умеренной астеноспермии на процесс фертилизации.
2. Цитология и генетика сперматогенеза
2. 1. Цитологический механизм гаметогенеза
Цитологически сперматогенез можно охарактеризовать как сложный процесс, который сводится к превращению малодифференцированной клетки зародышевого пути - сперматогония, в высокоспециализированную - сперматозоид, все структуры которого направлены на обеспечение оплодотворения яйцеклетки. Деление зародышевых клеток и их дифференцировка у взрослых особей происходят в семявыносящих канальцах семенников. В выстилающем сперматогенном эпителии этих канальцев по периферии, пристеночно, располагаются менее зрелые клетки, а по направлению к центру, по мере созревания - более зрелые. Гоноциты и сперматогонии - наиболее ранние клетки, предшественники
мейотических клеток, активно делятся митозом, а часть из них дифференцируется. Большинство зрелых сперматогониальных клеток вступают в стадию роста и превращаются потом в сперматоциты. Первоначальная фаза мейоза - мейотическая профаза - с генетической точки зрения является решающей, поскольку именно в ней происходит спаривание гомологов и. генетическая рекомбинация, а сперматоциты при этом подвергаются двум последовательным делениям. В результате первого они превращаются во вторичные сперматоциты, а в результате второго - в гаплоидные клетки, называемые сперматидами. Последние в дальнейшем удлиняются и превращаются в сперматозоиды. Процесс превращения сперматиды в сперматозоид носит название спермиогенеза, в течение которого геном половой клетки «переупаковывается» протаминами, что связано с необходимостью снижения объема полезного генетического груза, переходящего от относительно большой и громоздкой круглой сперматиды к обтекаемому и небольшому по размерам сперматозоиду. Кроме того, в семенниках находятся соматические клетки, поддерживающие сперматогенез. К ним относятся: находящиеся внутри канальцев секреторные клетки Сертоли, играющие важную роль в поддержании межканальцевой среды и регуляции сперматогенеза посредством паракринного взаимодействия с зародышевыми клетками. Показана их способость синтезировать андрогенсвязывающий белок, который транспортирует мужской половой гормон к сперматидам. Вырабатывается этот гормон (тестостерон) другим видом соматических клеток - клетками Лейдига, находящимися в межканальцевом пространстве.
2 .2. Генетические механизмы сперматогенеза
Представления о современных генетических механизмах сперматогенеза основаны, главным образом, на результатах экспериментальных
исследований в области молекулярной генетики и иммуноцитохимии модельных объектов, таких как мышь, дрозофила и дрожжевые клетки. Эти исследования в основном были направлены на определение специфических белков - продуктов специфических генов сперматогенеза, картирование последних, изучение их структуры и функции. Нарушения, касающиеся одного из составляющих процессов сперматогенеза, таких, как клеточное деление, дифференцировку клеток или клеточное взаимодействие, могут приводить к результатам, характеризующимся как бесплодие или стерильность (Elliott , Cooke, 1997). У человека в связи с данным обстоятельством патологию сперматогенеза часто используют в целях выявления генов, необходимых для нормального прохождения процесса сперматогенеза. Вообще, развитие семенников и прохождение нормального сперматогенеза, по-видимому, требуют присутствия и взаимодействия большого числа факторов, таких, как регуляторы транскрипции, соответствующие гормоны, их рецепторы и т.д. Вероятно, должно быть большое число генов, в том числе и еще не идентифицированных, которые необходимы для развития гонад и нормального прохождения гаметогенеза.
В целом ряде исследований (Tiepolo, Zuffardi, 1976; Burgoyne, 1987), было показано, что, по крайней мере, три гена в составе Y-хромосомы являются наиболее важными для нормального прохождения сперматогенеза у человека. Эти гены, обозначенные как AZF (a,b,c) (azoospermia factor), оказывают существенное влияние на прохождение сперматогенеза, вплоть до стерильности (Elliott , Cooke, 1997). В частности, у мужчин с азооспермией была обнаружена терминальная делеция в длинном плече Y-хромосомы. Этот факт послужил основанием для предположения о том, что один из генов локализован в дистальном районе Yqll (Chandley et al., 1994; Chandley, Cooke, 1994). В дальнейшем была обнаружена маленькая интерстициальная делеция у мужчин с азооспермией и нормальным кариотипом. Было сделано предположение о том, что локус AZF может
включать более чем один ген сперматогенеза. Первые экспериментальные результаты показали, что у особей с делецией AZF блокировка сперматогенеза происходит перед развитием сперматогониев и связана с нарушением дистального, Yqll.22, или проксимального,Уц11.23, района хромосомы (Henegariu et al., 1992).
Дальнейшие исследования позволили установить, что делеция гена AZFc маркирует небольшое семейство генов, именуемое DAZ /SPGY (Elliott, Cooke,, 1997), которое транскрибируется в сперматоцитах и ранних сперматидах (Glaser et al., 1998), а делеция гена AZFb района вызывает функциональную инактивацию другого семейства генов, называемого RBM (RNA-binding motif gene) (Ma et al.,1993; Ried et al., 1994; Kenan et al., 1991). Члены этого семейства RBM обнаружены также в других районах Y-хромосомы, однако только делеции в районе AZFb предотвращают экспрессию белка RBM, что свидетельствует о содержании большинства активных генов RBM именно в этом районе. Предполагается, что гены обоих семейств кодируют белки, которые могут принимать участие в метаболизме важных для сперматогенеза РНК (Kenan et al., 1991). В то же время отмечается, что RBM является ядерным белком, обнаруженным на всех транскрипционно активных стадиях развития зародышевых клеток (Elliot et al., 1997).
RBM является близким гомологом аутосомного гена, названного hnRNPG, из большого семейства hnRNPG белков, которые связываются в ядре с полиаденилатной PFflC, а в некоторых случаях обнаруживаются в процессе ее транспорта из ядра в цитоплазму (Graves, 1995; Weighardt et al., 1996). У гена DAZ/SPGY также существует ближайший гомолог, которым является аутосомный ген, названный DAZLA (синонимы - SPGYLA и DAZ Н) (Saxena, Rejio et al., 1996). В отличие от hnRNPG его экспрессия ограничена только гонадами.
Рассматривая значение аутосомных генов для процесса гаметогенеза и сперматогенеза, следует отметить существование генов инициации
мейотической рекомбинации, к которым относятся гены Spoil, обнаруженные у мыши, и SP011 - у человека, а также генов системы репарации ошибок спаривания ДНК (DNA mismatch repair system (MMR)., которые могут происходить из-за нарушений механизмов репликации и генетической рекомбинации (Baker et al, 1995; de Vires et al., 1999; Romanienko, Camerini, 2000; Baudat et al., 2000; Kneitz et al., 2000). Исследования на дрожжах и более недавние работы на мышах обнаружили также участие белков MMR в контроле мейотической рекомбинации. Бактериальная система репарации ошибок спаривания ДНК, типичным представителем которой является система Mut HLS Escherichia coli, наиболее проста и понятна. Эта система способна репарировать ошибки спаривания как одиночных нуклеотидов, так и небольших инсерций/делеций. На примере Е. Coli это выглядит так: белок MutS узнает и прикрепляется к нуклеотидам с ошибкой спаривания, второй белок MutL взаимодействует с MutS и активирует третий белок MutH, который является эндонуклеазой. MutH вырезает неметилированную нить полуметилированной ДНК в районе ошибки спаривания и тем самым дает команду репарировать вновь синтезируемую нить. У эукариот основные компоненты системы MMR сохраняются, но являются более сложными, чем у Е. Coli, за счет включения нескольких MutS- и MutL- гомологов. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae, например, имеется шесть гомологов ДНК-связывающих белков MutS, обозначенных MutS-гомологами (MSH) 1-6, а также четыре известных гомолога гена MutL, обозначаемых как MLH1, MLH2, PMS1 и MLH3 (Crouse, 1998).
Геном млекопитающих имеет гомологи всех рассмотренных генов за исключением MSH1, который, как ожидается, еще предстоит обнаружить (Buermeyer et al., 1999; Kolonder, Marsischky, 1999). Кроме того, известно, что у эукариот помимо продуктов генов MSH2, MSH3, MSH6 в репарации ошибок спаривания ДНК также принимают участие продукты генов MLH1, PMS1 и MLH3. В результате для репарации ошибки спаривания по
единичному основанию у эукариот необходим комплекс MSH2-MSH6, а для репарации ошибок спаривания типа инсерция/делеция - MSH2-MSH3 (Guerette et al.5 1999). Два MSH комплекса взаимодействуют с комплексами MLH1-PMS1 (у человека MLH2) или MLH1-MLH3 для репарации разнообразных ошибок спаривания (Wang T.F. et al, 1999). Mut S-подобные протеины Msh5 мышей небходимы для правильного синапсиса хромосом у самцов и самок в мейозе(ёе Vires, 1999) . Недавно было признано, что у дрожжевых клеток и клеток млекопитающих протеины ошибок репарации действуют как на уровне ДНК репликации, так и хромосомных взаимодействий в течение первого мейотического деления клеток. Эти протеины были определены как Mut S и Mut 1. Бактериальный Mut S протеин узнает неспаренное основание, которое возникает как ошибка репликации ДНК, в то время как Mut 1 действует в качестве моста -фактора, связывающий ДНК- Mut S комплекс и необходимую мишень для ресинтеза. Было продемонстрировано, что мыши, несущие нарушение Mut S у гомолога Msh5 показывают мейотический дефект, ведущий к стерильности, как самцов, так и самок. Гистологические и цитологические исследования профазы 1 мейоза у обоих полов обнаружили протяженную стадию зиготены, характеризующуюся повреждением и аберрантными хромосомами синапсиса, за которым следовала апоптотическая смерть клеток (ссылка). Таким образом, Mut S протениы продвигают синапсис гомологичных хромосом в профазе I мейоза.
Протеины MMR, помимо их роли в коррекции ошибок в течение
репликации, обладают и другими функциями. Ранее предполагалось, что
протеин М sh2p и менее протяженный Prnsl р предотвращают
мейотическую рекомбинацию между дивергирующими
последовательностями, ведущими к межвидовой гибридной нежизнеспособности. Сейчас продемонстрировано, что мейотическая нежизнеспособность, связанная с последствиями дивергенции, проистекает
по крайней мере из двух источников: нерасхождения хромосом в мейозе I и потери хромосом. М sh2p, Prnsl р и М sh6p в обоих процессах принимают неравное участие. Это не похоже на митоз, при котором два из трех комплексов - как с М sh2p, так и Prnsl р - создаются для коррекции репликационных ошибок.
Кроме того, оказалось, что двум протеинам присущи различные пути для
распределения рекомбинации между дивергирующими
последовательностями. Предварительные данные позволяют предполагать, что М sh6p вовлечен с М sh2p в антирекомбинационный путь, но не участвует в пути, ведущему к потерям хромосом (Chambers et al, 1999 Предварительное изучение эффектов msh3, lh2, h3m3m указывают, что все они играют существенную роль в процессах гомологичного кроссинговера. Кроме того, М sh3p может быть вовлечен в сестринский хроматидный обмен и внутрихромо сомальную рекомбинацию.
Чамберс с соавт. (Chambers et al, 1999) проанализировали роль индивидуальных протеинов. В случае, если наблюдается менее чем 0,6 % дивергенции, все они - Prnsl р, Mlhlp и Msh2p играют роль в процессе дивергентной последовательности. На основании этого было выдвинуто предположение, что это есть via exciccion реакциии репарации Эукариоты могут репарировать двунитчатые разрывы ДНК (DSBs) с помощью рекомбинации или негомологичного обмена. У дрожжей некоторые протеины, включая Ки70, вовлечены только в негомологичный обмен, в то время как другие протеины, такие, как RaD50, MRE11 вовлечены как в него, так и в гомологичную рекомбинацию. MRE11и Ки70 протеины млекопитающих изучали методом иммунопреципитации Ки70 с MRE11 из экстрактов клеток мышиных гибридом, используя анти-MREll. Взаимодействвие между МКЕПи Ки70 биологически обнаруживается не во всех клетках. Так, в семенниках мышей определили оба протеина в сперматогониях и клетках Сертоли. Однако, сперматоциты на стадии лептотены - зиготены в мейозе, когда инициируется мейотическая
репарация двунитевых разрывов, содержали высокую концентрацию MRE11 протеинов, тогда как Ки70 не определялся. В позднюю стадию мейотический профазе мейоза оба протеина находились совместно локализованными на X-Y-бивалентах. Предполагается, что Ки70 выключается в ранней мейотической профазе и к ее окончанию все DSBs сведены к гомологичным рекомбинационным путям (Heyting,1999). Исследования препятствующих репродукции у мышей мутаций в Y-хромосоме привели к заключению, что короткое плечо Y-хромосомы содержит ген, имеющий большое значение для пролиферации сперматогониальных клеток (Burgoyne, 1987; Bishop, 1996; Mitchell et al., 1994). В ходе экспериментов были разработаны мозаичные мыши, которые содержали половые клетки ХО (с X, но без Y- хромосомы) и X-Y (с X и Y-хромосомой). Y- хромосома в клетках XY приводила к развитию самцов, и взрослые самцы производили сперму; в течение сперматогенеза дифференцировались только XY половые клетки, в то время как ХО клетки блокировались на стадии сперматогоний. Это позволило предположить, что ХО клетки лишены основного гена сперматогенеза, кодируемого Y-хромосомой и необходимого для пролиферации сперматогональных клеток (Spy). Более точно Spy картировали на мышиной Y-хромосоме, частично используя информацию о событиях, наблюдаемых при транспозиции (Mitchell et al., 1994). Мыши генотипа ХО развиваются как самки, поскольку у них отсутствует Y-хромосома, но мыши XSxrO, содержащие транспозицию короткого плеча Y-хромосомы, несущего пол-детерминирующий район Sry, на их единственной Х-хромосоме, становятся самцами, и у них развиваются семенники. Из-за свойства вызывать реверсию пола (поскольку содержит Sry) эта часть короткого плеча Y- хромосомы была названа пол-ревертирующим районом (Sex reversed region, Sxr), а сейчас она носит название Sxr-a. У мышей-мозаиков половые клетки XsxrO в отличие от клеток ХО могли проходить сперматогониальную стадию сперматогенеза и
вступать в мейоз, в связи с чем считается, что район Sxr должен
содержать ген Spy. Этот же ген позднее был картирован внутри другого,
одного из самых небольших районов, названного Sxr-b. Клетки мышей с
генотипом XSxrO, которые теряют этот район в результате делеции,
блокируются на сперматогониальной стадии сперматогенеза, подобно
тому, как это наблюдается у мышей-мозаиков XO/X-Y. На роль гена Spy
предлагается несколько кандидатов внутри района Sxr-b, один из них - это
ген Ubely, специфически транскрибируемый в семенниках. Он
представлен внутри делеции Sxr-b (Kay, 1991) и кодирует
убекутинактивирующий энзим - член группы белков, инициирующих убекутинзависимые протеолитические реакции (Elliot et al., 1997). Однако ген SRY, располагающийся на Y- хромосоме и контролирующий, по современным представлениям, у млекопитающих определение пола самца, является главным среди генов сперматогенеза. Он кодирует белок, относящийся к группе HMG (high mobile group), и, возможно, действует как локальный организатор структуры хроматина (Capel et al., 1993). Предполагается, что он регулирует запуск генов в каскаде действий, определяющих пол, хотя его прямые мишени пока неизвестны. При исследовании этого вопроса с помощью мутаций у мыши и человека было изолировано несколько генов, таких как DAX1, SOX9, SF1 (ядерный гормон-рецептор), WT1 (Jemenez, Burgos, 1998). По крайней мере три из них, SRY, SOX9 и DAX1, оказались дозочувствительными, доказывая, что процесс определения пола приводится в действие на критическом пороге. Ген SRY инициирует развитие семенников из бипотенциальных клеток ранней гонады, ведет, прежде всего, к развитию клеток Сертоли и Лейдига, и, в итоге, к развитию фенотипа самца. Это развитие зависит от присутствия и действия андрогенов, связывающихся с рецептором в ядрах клеток- мишеней, стимулирующих транскрипцию спаецифических генов (Lamb, 1995). Механизмы органогенеза семенников, запускаемые геном SRY, включают клеточную сигнализацию, контролирующую
реорганизацию, пролиферацию, миграцию клеток и образование сосудистой системы семенников (Koopman, 1999). Вначале предполагалось, что он действует непосредственно активируя другие гены, определяющие развитие семенников. В дальнейшем появилась еще одна гипотеза, говорящая о том, что SRY действует опосредованно, взаимодействуя с родственными ему генами SOX3 (из которого SRY, возможно, эволюционировал) и SOX9 (который, видимо, непосредственно связан с дифференцировкой гонад у позвоночных). Предполагается, что у самок ген SOX3 ингибирует функцию SOX9, но у самцов SRY подавляет SOX3 и позволяет гену SOX9 выполнять свою тестис-определяющую роль. Данная гипотеза позволяет понять фенотип индивидов XX и XY с дефицитом или избытком любого из трех генов и позволяет объяснить сложные случаи существования XX (SRY)- самцов и трансдифференцировку в отсутствии SRY (Graves, 1995).
Здесь же следует отметить, что ген DAX1, например, у человека, обусловливает переопределение пола «самец-самка» путем дупликации небольшого района Х-хромосомы р21. В системе определения пола мыши гены Daxl и Sry действуют как антагонисты: увеличение экспрессии первого приводит к развитию самки, а второго - к развитию самца. Белки DAX1 у мыши и человека тоже ведут себя различно. Отсутствие их у человека приводит к врожденной гипоплазии и недостаточности надпочечников; у мышей, однако, уровень кортикотропных и адреналовых гормонов при этом находится в норме. В то же время самцы последних в этих условиях стерильны, а самки - фертильны. Белок DAX1 является также необычным компонентом гормонального рецептора ядра, он может действовать как репрессор транскрипции путем прямого взаимодействия типа белок-белок, путем связывания с ДНК и подавления им генов-мишеней (Graves, 1999).
Касаясь вопроса переопределения пола, необходимо еще раз обратить внимание, что Y-хромосома человека характеризуется тем, что в ее состав
входят дистальные псевдоаутосомальные районы на коротком (pseudoautosomal region - PARI) и длинном плече (PAR2). Последние подвергаются мейотической рекомбинации с Х-хромосомой, тогда как разделяющий их район в такую рекомбинацию никогда не вступает, видимо, благодаря существующему процессу инактивации мейотических половых хромосом. Последний, как предполагается, механистически соотносится с инактивацией Х-хромосомы в соматических клетках самок (Rodriges, Burgoyne, 2001). Как было показано, на участке Y-хромосомы, прилегающем к границе PARI, располагается ген TDF, от которого зависит будущий пол организма. В случае аберрантной мейотической рекомбинации между Х- и Y-хромосомами у полученных в результате особей может наблюдаться инверсия пола: генетические самки могут быть фенотипическими самцами за счет присутствия после рекомбинации в X-хромосоме на границе с участком PARI гена TDF, а генетические самцы могут быть фенотипическими самками за счет отсутствия этого гена в Y-хромосоме (Rodriguez, Burgoyne, 2001). У плацентарных (человек, мышь ) и сумчатых ген TDF гомологичен SRY (Schafer., 1995). В результате использования фенотипического маркера делеции Т (укорочения хвоста) и конгенных линий у мышей выяснилось, что в определении инверсии пола гибридных самцов участвуют по крайней мере еще два гена: Tas (T-associated sterility), локализованный на хромосоме 17, и Tdy (Y-linked determining), находящийся на Y-хромосоме (Gubbay et al.,1990; Washburn, Eicher, 1983). На основании анализа происхождения использованных в эксперименте линий авторы предполагают, что развитие ткани яичников у особей, несущих данную делецию и хромосому Y-линии ACR/J на генетическом фоне линии C57BL/6J, связано с аномальным взаимодействием аллеля Tas, привнесенного в линию C57BL/6J от Mus musculus, с аллелем Tdy, характерным для Mus domesticus (Washburn, Eicher, 1983). Таким образом, по мнению авторов,
данные случаи инверсии пола можно рассматривать как дисгенетические эффекты межвидовой гибридизации.
Кроме специфичного для половых хромосом гена Tdy при гибридизации упоминавшихся линий C57B1/6J и DBA/2J выявлено наличие более чем одного аутосомного гена, определяющего развитие пола. Первоначально такое предположение было выдвинуто Эйкер и Вашбурн (Eicher, Washburn, , 1989) при анализе потомства мышей от скрещивания лабораторной линии C57BL/6J и с мышами дикой популяции Mus poshiavinus (разновидность Mus domesticus, отличающаяся наличием Робертсоновских слияний хромосом). В этих экспериментах у гибридного потомства было обнаружено аномальное развитие различных комбинаций семенников и яичников в том случае, когда данные потомки несли Y-хромосому Mus poshiavinus, а Х-хромосому и большую часть аутосом - от линии C57B1/6J (Washburn, Eicher, 1989). В последующих исследованиях для выяснения возможной роли аутосомных генов в определении пола были сконструированы конгенные линии DBA/2J Y-POS и C57B1/6J Y-POS, несущие Y-хромосому М. poshiavinus, причем в последней линии часто отмечались случаи гонадального гермафродитизма. Анализ реципрокных скрещиваний и бэкроссов мышей этих линий дал возможность сделать вывод о наличии по меньшей мере одного гена определения пола с аутосомной локализацией, взаимодействующего с Y-хромосомой и названного Tda-1 (testis determinatiom autosomal) (Biddle et al., 1994). Кроме того, генетический фон половых хромосом, т.е. их преимущественное сочетание с аутосомами одного из видов при их гибридизации, приводит к появлению гонадальных аномалий.
3. Поведение половых хромосом в течение мейоза
Эухроматиновая конформация и транскрипционная активность половых хромосом в ооцитах представляет собой полную противоположность
гетерохроматиновой конформации и транскрипционной инактивации
половых хромосом в сперматоцитах. Мейотическая инактивация половых
хромосом (MSCI) отличается от более известной соматической X-
инактивации, функционирующей у млекопитающих в качестве
компенсации дозы; если предыдущая широко распространена у животных
с гетерогаметным полом самцов и ограничена зародышевыми клетками, то
последняя известна только у самок млекопитающих и встречается в
соматических клетках и оогониях, но отсутствует в мейоцитах.
Диморфизм в мейотической активности половых хромосом, скорее всего,
связан с различным статусом половых хромосом, обусловленным
спариванием и рекомбинацией. Гомологичные Х- хромосомы
гомогаметных самок должны спариваться и рекомбинировать, чтобы гарантировать сегрегацию Х-хромосом в анафазе 1 и предотвратить появление мутаций, в то время как у гетерогаметных самцов неограниченная мейотическая рекомбинация между гетероморфными X-и Y- хромосомами должна быть предотвращена, поскольку события обмена, инициированные внутри различных районов могут привести к негомологическим кроссоверам или нерепариемому хромосомному повреждению. Конформация эухроматина половых хромосом в ооцитах облегчает спаривание хромосом и рекомбинацию, тогда как конформация гетерохроматина Х- и Y-хромосом в сперматоцитах предотвращает разнородную (негомологичную) рекомбинацию.
3.1. Мейоз у самки
Обе половые Х- хромосомы у самок деконденсированы и транскрипционно активны, как и аутосомы в течение женского мейоза, в то время как гетероморфные половые хромосомы являются транскрипционно неактивными и гетерохроматичными в мейозе самцов. В оогониях млекопитающих, так жк как и в соматических клетках, компенсация дозы
Х-хромосомы достигается тем, что только одна Х-хромосома активна, а другая гетерохроматична и транскрипционно неактивна. Премейотические зародышевые клетки женских (человеческих) гетерозиготных плодов GpdA/GpdB экспрессируют только АА или ВВ формы, проявляя активность только одной Х-хромосомы на клетку (Gartler et al., 1975). Эти данные согласуются с тем, что в мейотической оогонии одна хромосома гетерохроматична (Gartler et al., 1983).
Однако в мейотической профазе гетерохроматиновая Х-хромосома реактивируется, так, что в отличие от всех других клеток тела ооциты имеют две активные Х-хромосомы. Три наблюдения обеспечивают доказательство этого положения. Во-первых, у самок мышей в ооцитах индивидов XX по сравнению с ооцитами индивидов ХО найдены количественные различия в протеинах, кодируемых Х-хромосомой (Epstein, 1969; Andina, 1978; Monk, McLaren, 1981; Gartler, Rivest, 1983). Во-вторых, гетерополимерные формы Х-кодируемых энзимов могут быть обнаружены в ооцитах как тех, так и других гетерозигот мышей (Kratzer, Chapman, 1981; Jonston, 1981) и человека (Gartler et al., 1972, 1975). Наконец, гетерохроматиновая хромосома не наблюдается в ооцитах (Ohno, 1964).
В организме самки для осуществления инактивации Х-хромосомы требуется участие гена Xist, контролирующего этот процесс, тогда как нарушение активности или отсутствие этого гена у самца не оказывает существенного влияния на прохождение сперматогенеза (McGarrey, 1999). Происходящая в мейозе самца инактивация Х-хромосомы обеспечивает защиту непарных ее частей от вредных последствий случайного взаимодействия с какими-либо участками других хромосом, включая негомологичные участки за пределами псевдоаутосомальных районов половых хромосом (Ayoub et al., 1997). У сумчатых инактивация половых хромосом доведена до крайнего своего выражения путем удаления X-хромосомы из некоторых тканей и органов как, например, у коричневой
сумчатой крысы Isoodob macrourus, клетки которой в гемопоэтических тканях и эпителии кишечника обладают конституцией ХО. Отмечается также, что удалению подлежит всегда Х-хромосома отцовского происхождения (Watson et al., 1999).
З .2. . Мейоз у самца
Х- и Y-хромосомы зародышевых клеток самца многих животных являются неактивными в мейотической профазе. Самые ранние наблюдения цитологически документировали присутствие гетерохроматиновых половых хромосом (Mohr, 1916, цитировано по Mittwoch, 1983; Painter, 1924; Ohno, Makino, 1961). Sachs (1954) первым ввел термин «половой пузырек», чтобы описать структуру, образуемую половыми хромосомами. Этот термин может ввести в заблуждение, поскольку подразумевает скорее пузырьковую структуру, чем специфическую хроматиновую конфигурацию, присущую половых хромосомам в сперматоцитах. Для структуры и поведения этой ядерной сферы более подходящим является термин «половое тельце» или « X-Y тельце» (Solari, 1974,1989); оно постоянно демонстрирует различную степень окрашивания и поведения по сравнению с аутосомами. Доказательство траскрипционной инактивации выводится прежде всего из даных ауторадиографии, прослеживающей включение Н3 уридина как у насекомых, так и млекопитающих (Henderson, 1964; Monesi, 1965; Utakoji, 1966; Kierszenbaum, Tres, 1974a, b). Половое тельце не включает уридин, в отличие от аутосом. Точное время мейотической инактивации половых хромосом (MSCI) неизвестно, но, очевидно, она происходит через некоторое время после вхождения в мейоз, поскольку Х-хромосома может поздно реплицироваться в S-фазе прелептотены (Kofrnan-Alfaro, Chandley, 1971; Odartchenko, Pavillard; 1970; Latos-Bielenska, Vogel, 1992), и транскрипционно неактивна в ранней мейотической профазе, где половое
тельце наблюдается впервые. X-Y-тельце, аналогичное тельцу Барра, наблюдаемому при инактивации Х-хромосомы в клетках женского организма, создается РНК половых хромосом самца с помощью того же гена Xist (Ayoub et al., 1997; Richler, Wahrman,1999).
3.3.. Вероятные функции MSCI
Если у гомогаметного пола половые хромосомы являются полностью гомологичными и свободно рекомбинируют, то у гетерогаметного негомологичны, и, следовательно, не способны к полному гомологичному спариванию и рекомбинации. Эти половые различия в конформации половых хромосом и транскрипционной активности в мейотических клетках связаны собственно с диморфизмом половых хромосом и определяют особенности гомологичной рекомбинации. Это положение хорошо сочетается со значением полового тельца, поскольку герохроматин и эухроматин отличаются в их способности рекомбинировать так же хорошо, как и транскрибироваться. Генетические данные, полученные при изучении Drozophila, определяют фактическое отсутствие кроссинговера в районе центрического гетерохроматина (Carpenter, Baker, 1982). Кроме того, цитологические данные по широкому спектру организмов выявляют отсутствие хиазм в больших блоках гетерохроматина (John, 1988). Ошибки Х-Х рекомбинации могут приводить к двум делетирующим последовательностям. Нарушение Х-хромосомного расхождения, вероятно, является результатом этой ошибки X. Наличие нерекомбинирующих хромосомных районов ведет к аккумуляции нефункциональных последовательностей, таких как простые повторы и мобильные элементы. Теоретические построения предполагают, что рекомбинация может вызвать снижение количества мутаций благодаря селекции против делеций и удалению повторов ДНК ((Miklos et al,1988).
Инактивация половых хромосом самок, вероятно, является средством
предотвращать разнородную рекомбинацию. В противоположность, Х- и
Y-хромосомы во многих организмах эволюционно дивергируют, чтобы
сохраниться при возможном хаосе при рекомбинации. Имеются, по-
крайней мере, две причины, почему участие негомологичных половых
хромосом в гомологичной рекомбинации может быть ущербным.
Рекомбинация половых хромосом может привести к негомологичному
обмену между повторяющимися последовательностями на Х- и Y-
хромосомах, ведущему, в свою очередь, к пересторойкам и анеуплоидии. У
дрожжей мейотические обмены происходят между дисперсными
повторяющимися последовательностями на гомологичных или
негомологичных хромосомах при частотах, сравнимых с аллельными
обменами (Haber et al., 1991). Эктопические обмены между дисперсными
повторами также показаны в мейозе у Drosophila (Montgomery et al.,1991).
Частота существенно выше у гетерозигот, чем у гомозиготных
индивидуумов, поддерживающих подавление эктопического обмена при
гомологичном спаривании. Дисперсные повторяющиеся
последовательности в геномах млекопитающих являются множественными, и есть доказательства вовлечения таких последовательностей как в негомологичный, так и в аллельный обмен (Fisher, Lindahl, 1991). Для Х- и Y-хромосом наблюдается значительное число общих семейств повторяющихся последовательностей (Avner et al, 1987). Эти наблюдения позволяют предполгать, что эктопический интра- и интер-хромосомный обмен может иметь место в гетероморфных половых хромосомах при высоких частотах, если нет средства для его подавления. Таким образом, одна из функций MSCI, вероятно, состоит в том, чтобы предотвращать обмены внутри или между Х- и Y-хромосомами.
Вторая возможная функция MSCI (мейотической инактивации половых хромосом) заключается в подавлении инициации процесса рекомбинации
настолько, чтобы предотвратить накопление нерепарированных хромосомных повреждений. Возможность таких повреждений предполагается, исходя из недавнего доказательства того, что двуцепочечные разрывы ДНК сопровождают начало мейотической рекомбинации у дрожжей (Sun et al., 1989; Cao et al., 1990). Очевидно, встречаемость двуцепочечных разрывов не зависит от степени гомологии, поскольку они наблюдаются на уровне сравнимых частот у индивидов гомозиготных и гетерозиготных по 2,5 kb вставок, содержащих сайт инициации рекомбинации (Cao et al., 1990). Судьба мейотических двуцепочечных разрывов, не репарированных с помощью гомологичной рекомбинации, неизвестна. Большинство нарушений будет рекомбинационно репарировано с использованием сестринской хроматиды как лекала. Мейотические сестринские хроматидные обмены (SCE) незначительны у дрозофилы (Gatti,1982) и у других насекомых (John, 1990), но встречаются у дрожжей (Game et al., 1989), где они стимулируются отсутствием гомологии (Wagstaff et al.,1985). Эти данные согласуются с тем предположением, что SCE функционирует в качестве фона репарационной системы. Однако результаты показывают весьма высокую частоту неравного SCE, что позволяет считать, что он не может быть очень точной системой. К тому же не имеется сопоставимых данных, полученных на высших эукариотах.
Альтернативы рекомбинационной репарации посредством SCE эктопической рекомбинации, восстановлению разрыва и ошибке репарации - значительно менее безопасны. Эктопическая рекомбинация ведет к перестройкам и анеуплоидии. Прямое сшивание разорванных концов, вероятно, будет приводить к делециям, поскольку разорванные 5'-концы, генерированные повреждением и резекцией в течение инициации (Sun et al., 1991), не могут быть обработаны посредством какой-либо известной полимеразы. Нерепарированные двуцепочечные разрывы, вероятно, станут причиной либо мейотического ареста, либо зиготической
доминантной летали. Если нерепарированные двухцепочечные разрывы
являются вообще обычными в мейозе, возможно ожидать, что система
"точки отсчета"(спек point) в мейотических клетках должна быть
оперативной, аналогично таковой в митотических (Hartwell, Weiner,1989).
Мейотический арест должен быть относительно мягким - настолько, чтобы
потеря репродуктивной производительности могла быть легко
компенсирована с помощью генерированных добавочных мейоцитов.
Действительно, несколько последних работ, анализирующих
взаимодействие среди мейотических мутантов, показали существование одной или более точек контроля в мейотической профазе (Weber, Byers, 1992; Bishop et al., 1992). Однако такая контрольная система, вероятно, была бы повреждена в результате неограниченной инициации рекомбинации негомолгичных половых хромосом.
Таким образом, предполагается, что MSCI в сперматоцитах
гетерогаметных самцов является приспособлением, предотвращающим мейотический обмен между негомологичными половыми хромосомами. Это предотвращает как эктопический обмен, так и повреждение хромосом за счет двунитчатых разрывов, инициациирующих мейотическую рекомбинацию. С этой точки зрения, мейотическая транскипционная инактивация является вторичным следствием хроматиновой конфигурации, предотвращающей доступ рекомбинаторных энзимов. Наоборот, реактивация Х-хромосом в ооцитах не определяется необходимостью транскрипции, а является следствием хроматиновой конформации, необязательной для рекомбинации.
Из гипотезы, что функция MSCI сводится к предотвращению мейотической рекомбинации гетерологичных половых хромосом следуют три предположения. Первое заключается в том, что район Х-У спаривания, который является гомологичным и рекомбинационно активным, может противодействовать инактивации. Второе состоит в том, что MSCI должна быть ограничена организмами, обладающими гетероморфными половыми
хромосомами. Третье предположение заключается в том, что MSCI должна быть ограничена организмами с мейотическим обменом. Самцы мышей и человека являются доказательством первого предположения, поскольку у обоих видов X-Y спаривание сохраняется только в ограниченном районе гомологии. Псевдоаутосомные районы (PAR), которые локализованы на дистальном конце короткого плеча Х- и Y-хромосомы у человека и дистального длинного плеча двух половых хромосом у мышей ( Elis, Goodfellow, 1989), спариваются регулярно и подвергаются одному или более облигаторному обмену (Hale et al.,1991) , который, по-видимому, содействует X-Y сегрегации. Хотя не имеется прямых доказательств транскрипционной активности в районе спаривания, имеется основанное на энзимной активности доказательство того, что локализованный в PAR ген Sts не является инактивированным в сперматоцитах мыши (Raman, Das, 1991). С другой стороны, не имеется данных, что этот район демонстрирует более открытую хроматиновую конфигурацию, чем остальные участки Х- и Y-хромосомы в течение мейоза самца. При ник-трансляции был обнаружен район чувствительности к ДНК-азе І в Х-У районе спаривания у человека (Chandley, McBeath,1987), но на мышах эта методика дала противоположные результаты (Richler et al,1987, Raman et al, 1988).
3. 3. 1.. Последствия Х-хромосомной инактивации для зародышевых клеток
Согласно Лифшиц и Линдслей (Lifschytz, Lindsley,1972) MSCI является существенным признаком гаметогенеза у гетерогаметного пола. Форейт (Forejt,1982) выдвинул предположение о том, что Х-кодируемые продукты являются ингибиторами сперматогенеза. Однако нет доказательств того, что какой-либо из большого числа известных Х-кодируемых протеинов является вредным для зародышевых клеток. Фактически,
сперматогониальные клетки, видимо, должны использовать несколько
способов, чтобы убедиться в пригодности продуктов, нормально
кодируемых Х-хромосомой. Одна такая копирующая стратегия выражается
в присутствии аутосомальных «фоновых» генов, кодирующих различные
энзимы, специфичные для мейотических или постмейотических
сперматогенных клеток. Эти аутосомальные гены были определены как
PGK и Е1а субъединица пуриватдегидрогеназы. В случае как Pqk-І, так и
Pqk-2 гена, локализованных на 17 хромосоме мыши и 6 хромосоме
человека, активными являются оба функциональных энзима и их
транскрипты направляются в 1 профазу мейоза,. Эти протеины
обнаружены только в мейотических и постмейотических сперматогенных
клетках и кодированы на Х- хромосоме, хотя имеются и их аутосомальные
варианты, экспрессирующие только в семенниках (Takakubo, Dahl,1992).
Однако, некоторые Х-сцепленные гены, такие, как кодирующие HPRT, не
являющихся аутосомными фоновыми геноми, зародышевая клетка
копирует с инактивацией посредством стабилизации продуктов гена.
Исследования Handel М.А. (1992) обнаружили, что уровень HPRT
активности значительно не уменьшается в сперматоцитах и сперматидах,
несмотря на низкий уровень транскриптов в сперматоцитах. Количество
транскриптов увеличивается в начале мейотической профазы,
уменьшается в пахитене сперматоцитов, затем увеличивается в постмейотических клетках.
4. Цитогенетические механизмы возникновения мужской стерильности
4.1 Роль MSCI в гаметогенезе самцов и недостаточность репарации двуцепочечных разрывов
Хотя приведенная выше гипотеза была предложена для объяснения явления MSCI в течение сперматогенеза, она предлагает также объяснение
механизма частичной и полной стерильности, связанной с ошибками
мейотического спаривания хромосомы или ее части. Это явление часто
наблюдается у гетерозигот по хромосомным перестройкам и у гибридов
между близкородственными видами (Gilles,1989). В большинстве случаев
стерильность связана с арестом мейотической профазы, часто в пахитене
или непосредственно перед метафазой. Миклош (Miklos,1974)
постулировал, что стерильность в этом случае есть результат
ненасыщенности мест спаривания, т.е. мест спаривания, которые не
смогли найти партнера в течение ранней профазы. Эта идея формально
обьясняет существенное количество данных, но здесь не было механизма,
связывающего состояние насыщения мест спаривания со стерильностью.
Если рекомбинационные события, инициированные в районах,
блокированных от гомологичного спаривания, могут привести к
нерепарированным двуцепочечным разрывам, как предполагалось выше, то
они могут быть молекулярной основой ненасыщенных мест спаривания по
Миклошу. Недавние исследования дрожжей документировали, что
двуцепочечные разрывы при рекомбинации горячих точек появляются
очень рано в мейотической профазе, перед или совпадают с инициацией
синапсиса Padmore et al., 1991). Таким образом, неудача в достижении
полного гомологичного спаривания, либо из-за частичного недостатка
гомологии, либо из-за топологической конструкции, созданной
геперозиготной перестройкой, может оставлять один или двуцепочечных
разрывов нерепарированными. Следовательно, стерильность,
ассоциированная с мейотическим арестом у гибридов игетерозигот по структурным перестрокам, может, быть результатом двуцепочечных разрывов и блока мейоза .
Итак, диморфизм поведения гетероморфных половых хромосом в гаметоцитах, а именно, Х-хромосомная реактивация у самок млекопитающих и инактивация как X, так и Y-хромосомы в сперматоцитах широкого круга животных, связаны с различным
рекомбинационным статусом половых хромосом у двух полов. Для того, чтобы обеспечить расхождение и избежать накопления мутаций, гомологичные Х-хромосомы у самок должны быть в хроматиновой конформации совместимы со свободной рекомбинацией. У самок млекопитающих это требует реактивации или деконденсации X-хромосомы, инактивированной непосредственно перед или в течение ранней мейотической профазы.
У гетерогаметных самцов гетероморфные половые хромосомы конденсированы или инактивированы в мейотической профазе, для того, чтобы предотвратить рекомбинацию, которые, вероятно, могут привести к перестройкам или повреждениям половых хромосом. Таким образом, с этой точки зрения, транскрипционная активность половых хромосом, в противоположность их инактивации, является вторичным следствием раннего мейотического события, устанавливающего конфигурации хроматина, которые либо позволяют, или не позволяют рекомбинацию. Показано, что эта гипотеза согласуется с большим количеством цитологических и молекулярных данных по взаимотношению между MSCI и другими факторами мейоза, такими как гетероморфность половых хромосом и мейотический обмен.
4. 2. Ассоциации полового бивалента с аутосомами
Ассоциации половых хромосом с аберрантными аутосомами также могут быть названы вероятной причиной мужской стерильности. При стерильности разного происхождения часто наблюдается ассоциация аутосом с половым бивалентом, что нарушает инактивацию X хромосомы. Причины такого негомологичного спаривания не ясны до сих пор, но оно может быть связано с частичным синапсисом аберрантных хромоом. Возможно, этот феномен представляет специальное следствие одного
явления - синаптической подгонки (коррекции) (Moses et al,1975 ; Moses, Poorman,1982).
Рихлер с соавт. (Pvichler et al, 1989) сравнили чувствительность к ДНК-азе Х-хромосомы у мышей нормальной лабораторной линии СВА C/Lac и двух линий с реципрокными транслокациями (Т(2, 11)ЗОН -фертильные и Т(11, 19)43Н - стерильные. У нормально фертильных мышей в Х-хромосоме имеется 4 участка конформационно активного хроматина, чувствительного к ДНК-азе, включая район специфического спаривания Х-У половых хромосом. Как предполагалось авторами, что по изменению конформации Х-хромосомы при контакте с аутосомами, можно определить по чувствительности к ДНК-азе. Однако различий между фертильными и стерильными мышами не было обнаружено. Тем не менее цитогенетическое исследование на стадии средней пахитены показало специфическую структуру половых хромосом - X-Y-тельце или половой пузырек, обособленную от аутосом и более конденсированную по сравнению с ними. В сперматоцитах нормальных мышей формировался нормальный половой пузырек. В то же время у стерильных мышей линии ВпгТ43Н обнаруживалась ассоциация или близость расположения аутосомного квадривалента с X-Y половыми хромосомами и половой пузырек не формировался.Как предполагают авторы, такая ассоциация транслоцированных аутосом с половыми хромосомами препятсятвует обособлению последних, происходит так называемое заякоренивание. Вследствие этого Х-сцепленные гены, находящиеся в конформационно активном хроматине, продолжают транскрибироваться в средней пахитене. Следует отметить, что в норме траскрипция Х-сцепленных генов прекращается благодаря пространственной изоляции половых хромосом,образующих половой пузырек. Такая аномальная структура полового пузырька, которая проявляется в светлой окрашиваемости и диффузности,а также пространственное расположение полового пузырька, вместе с повышенной частотой ассоциации половых хромосом с
аберратными аутосомами характерна для стерильных гибридов (Matsuda et а!Л992). Авторы приходят к заключению, что причиной гибели сперматоцитов в метафазе I, вероятно, является ассоциация половых хромосом с аберрантными аутосомами, и неспаренные теломерные участки аутосом склонны ассоциировать с X-Y половыми бивалентами, что препятствует формированию полового пузырька.
Тот же феномен был отмечен у человека многими авторами (Chandley et al.,1986;Jochanison et al, 1983; Luciani et al, 1984;; 1987;Templado et al., 1981; Navarro et al.,1981; Vidal et al.,1982) последние работы определили два типа ассоциации квадривалентов (71,21) с половыми хромосомами: 5'- терминальная асооциация участка 21 хромосомы и близкая ассоциация, которая особенно часто включает точку разрыва. Арест мейоза наблюдался на разных стадиях профазы мейоза, в том числе часть клеток дегенерировали на стадии зиготены (Z - клетки) (Speed, Chandley, 1990). Также наблюдалась асинхронность поведения X-Y-бивалента и аутосом (задержка синапсиса X-Y). Незначительный процент X-Y-аутосомных ассоциаций отмечен в контроле, невысокая частота и в целом в группе стерильных пациентов. Только у нескольких стерильных и одного фертильного мужчины обнаружена высокая частота ассоциации, хотя те же авторы приводят наблюдения - Х-аутосомную ассоциацию в 20% клеток, однако отметили, что не все ассоциации являются причиной гибели сперматоцитов
По данным Видал (Vidal et al.,1982) в 31 % случаев аномалии синапсиса в мейозе могут быть показаны только при ЭМ анализе СК. Были описаны случаи частичного асинапсиса отдельных бивалентов у пациентов, страдающих бесплодием, и показано повышение количества клеток, у которых половой пузырек не формировался. (Templado et al., 1981;Navarro et al.,1981; Vidal et al.,1982). Наварро с соавт. (Navarro et al.,1981) выявили нарушение синапсиса у нескольких членов одной семьи и предположили существование в генотипе таких пациентов асинаптическои
мейотической мутации, приводящей к утрате части точек инициации синапсиса, что в свою очередь приводит к нарушению синапсиса хромосом на стадии пахитены, появлению асинаптических конфигурации и снижению числа хиазм, а также формированию унивалентов половых хромосом.
ЭМ исследование - анализ СК,проведенный Курило, Коломец с соавт. (1994) на отобранных 5 группах мужчин, пациентов с нормальным кариотипом соматических клеток, обнаружил нарушение полового развития и сперматогенеза неясной этиологии. Параллельно было проведено гистологическое изучение тестикулярных тканей. 1 группа- при анализе спермограмм диагносцирована азоспермия, не обнаружены сперматоциты;2 группа-диагносцирова на азоспермия и олигоспермия, выявлены единичные клетки на стадии пахитены, но лишь с тонкими фрагментами осевых элементов СК ( по писанию подобно Vidal et al., 1982 ), 3 группа - при анализе эяуклята диагносцирована азоспермия и олигоспермия. У всех пациентов этой группы отмечено повышение клеток, в которых наблюдалась ассоциация СК аутосомных бивалентов с осями половых хромосом ( 53,8%), заякоревание полового бивалента и дегенеративные клетки на стадии пахитены - диплотены. В норме количесвто таких клеток по данным Чандли не превышает 4 %. (Chandley et al., 1986). 4 группа -также выявлена азоспермия, у пациентов обнаружен частичный асинапсис боковых элементов СК Частично асинаптирующие биваленты вступали в ассоциацию с половым бивалентом и происходило заякоревание полового биваленьа (17%). Отмечен аутоиммунный процесс в тестикулярнои ткани. 5 группа - при анализе эякулята диагносцирована азоспермия и олигоспермия. На препаратах СК определена высокая частота ассоциированных аутосомных бивалентов с поповым бивалентом (29, 8%). Авторы предполагают, что возможной причиной ареста клеток на стадии пахитены у этих пациентов служило наличие микроаберраций, не выявляемых даже электронно микроскопическим анализом, единственным
проявлением которых служил высокий процент ассоциаций аутосомных СК бивалентов с ХУ хромосомами.
. Неслучайная частота ассоциации X-Y- половыми бивалентами и транслокационными мультивалентами была обнаружена в первичных сперматоцитах в диакинезе (М1/10-45% кл.). ЭМ анализом СК авторы подтверждает эту гипотезу, обнаруживая высокую частоту пахитенных сперматоитов, вступающих в ассоциацию. Мужчины с азоспермией 1/8 имеют делецию (500 kb ) У -хромосомы в районе Yq , в котором, идентифицирован ген DAS . Мужчины с нуль-мутацией ген DAS определяется с разной степенью поражения сперматогенеза:в канальцах семенников обнаруживаются клетки Сертоли, а иногда сперматогонии и сперматоциты 1 на стадии профазы мейоза (Eberhhart et al.,1996) .
Не во всех случаях Х-А-ассоциации проводит к аресту сперматогенеза на стадии пахитены, да и ассоциация наблюдается не во всех клетках. Так, у овец -гетерозигот по Робертсоновским транслокациям обнаружены ассоциации на всех стадиях мейоза и число сперматозоидов нормальное (Dai et al., 1994). Однако следует отметить, что частота Х-А-ассоциации у овец-гетерозигот не превышает 15%, тогда как (Richler et al, 1989. частота ассоциации составляла 80%, у человека же при Робертсоновской транслокации (t(14; 21)(Rosenmann et al., 1985) - 75% клеток.
Если клетки с Х-А-ассоциацией элиминируются, то в гибель клеток больше в последнем случае ( при наличии аутосомной транслокации),. Оказалось, что обособлению X хромосомы не препятствует ни отсутствие синапсиса (у мышей XOSxr) (у видов с асинаптирующими половыми хромосомами X и Y обособляются в виде полового тельца ( Solari, Ashley 1977; Wolf et al., 1988; Ratomponirina et al., 1989), ни Х-аутосомная перестройка. Возможно, что мейоз у носителей X - аутосомных и чисто аутосомных транслокаций в каждом случае имеет свои особенности.
Одно из первых предположений о том, что нарушение плодовитости связано с Х- хромосомой, было высказано Лифшицем и Линдсдеем (Lifschytz, Lindsley, 1972), которые указали на тот факт, что при инактивации Х- хромосомы у самцов -( Dr. melanogaster) сопутствующие этому процессу факторы будут нарушать биохимические механизмы дифференцировки, а это, в свою очередь, может привести к стерильности самцов. Наличие такой X - хромосомной перестройки предполагает, что причина стерильности находится во взаимодействии с изменением температуры хромосомной инактивации. Авторы предположили, что существует постоянная репрессия транскрибирующей активности половых хромосом (Х-хромосомы ) самца, которая, по-видимому, перестроена у стерильных особей.
На основании положений этих авторов Форейт и Грегорова; Forejt, Gregorova(1977; Forejt, 1981) предположили, что Х- хромосомная инактивация является основным контрольным механизмом сперматогенеза. Изменение Х- хромосомной инактивации могло быть результатом появления некоторых «недопустимых» генных продуктов X - хромосомы, убивающие сперматоциты. Эта гипотеза может дать объяснение задержки сперматогенеза, вызванного различными повреждениями аутосом и X-хромосомы. Кроме того, Форейт (1981) указывает на два обстоятельства, которые необходимо учитывать при рассмотрении стерильности. Во-первых, оказалось, что эффект перестройки не является результатом изменений экспрессии части генов в нарушенной хромосоме. Стерилизующий эффект наблюдается только у гетерозигот, но пропадает у гомозигот. Во-вторых, важным свойством всех хромосомных нарушений, вызывающих стерильность, является исключительное ограничение стерилизующего эффекта мужским полом, самки же всегда оказываются фертильными. Автором высказано предположение о неслучайном характере пространственных взаимоотношений между структурными нарушениями, определяющими изменение плодовитости, и X-Y- половыми
хромосомами (Х-A). (Forejt, 1974, 1979, 1981,1996 ; Forejt, Gregorova, 1977). Итак, стерильность самцов может быть обусловлена хромосомными нарушениями. Этот феномен может реализовываться перед диакинезом согласно данным Джонсона (1983) или переходить через диакинез по данным Форейта (1974). Повреждение вызывается продуктами реактивированных генов Х-хромосомы (Hotta, Chandley, 1989, Guenett et al.,1989) Эти продукты, вероятно, могли бы диффундировать через внутриклеточные каналы, соединяющие сперматоциты и таким образом создавать в них повреждения (Rosenmann et al.,1985).
Хотя транскрипционная активность половых хромосом в первой профазе
мейоза почти закончена, но активация хроматиновой конформации
сохраняется. Не во всех случаях арест мейоза, наблюдаемый на разных
стадиях мейоза, сопровождается высокой частотой ассоциации между
половыми хромосомами и аберрантными аутосомами. У нескольких
пациентов было отмечено уменьшение участка спаривания (PAR) района
половых хромосом. Вероятно, что ассоциация между аберрантой
аутосомой и конъюгирующими X-Y-хромосомами в половых пузырьках
пахитенных сперматоцитов представляют собой общий феномен,
сопровождающий различные хромосомные перестройки и аномалии,
вызывающие стерильность у мышей и у человека. (Jochanisson et
al,1989,Vidal et al ,Templado et al 1982). Каким же образом формируется
ассоциация половых хромосом и аберрантных аутосом? Существует два
типа этих ассоциаций. Согласно первому из них, ЯОР-несущие биваленты
близко расположены по отношению к половым хромосомам (X-Y), -
возможно, при активном движении хромосом (Kniebier et al,1981).
Сведения об ассоциации проксимальной части хромосом, несущих ЯОР, и
половых хромосом немногочисленны, но все-таки имеются такие
сообщения.Показано,что акроцентрики-биваленты ассоциируют
посредством коротких плечей с половыми хромосомами в 18% зиготенно-пахитенных iaieTKax(Solari,Tress,1970;Holm, Ramussen, 1977 . Согласно
второго варианта ЯОР-несущие биваленты вовлекаются в плотный
комплекс мейотических половых хромосом и аутосом ( Х-А) аутосомную
ассоциацию, такую, например, которая имеет место у мужчин с
аномальным кариотипом (Holm,Ramussen, 1977; Jochanisson et al.,1989;
Vidal ,Templaado ,1982). У мышей многие хромосомы, принимающие
участие в негомологичном синапсисе, также несут ЯОР.
ЭМ анализ СК показал, что ассоциации X-Y-бивалента наблюдались в
основном асинаптируемых аутосомах или их сегментах. Эти наблюдения
могут объяснить некоторые, но не все, возможные случаи. Оказалось, что
теломерные участки хромосом вступают ассоциацию, синаптируемые
нормальные аутосомные сегменты ассоциируют с половыми
хромосомами, определяющие возможное сродство между несинптируемыми теломерными участками. Такие «конец-в конец» ассоциации имеют место у части нормальных индивидуумов (у носителей), но этот контакт не является синапсисом в строгом смысле, может передоваться через клеточные мембраны, и часто виден между теломерными участками различных сегментов хромосом (Rosenmann,1985). Таким образом, возможна ассоциация теломерных участков коротких плеч хромосом (14-21) - их негомологичных гетерохроматиновых участков, поведение хромосом, носителей хромосомных перестроек, зависит иногда от наличия ЯОР, иногда от теломерных ассоциаций и расположения гетерохроматиновых блоков.
Можно предполагать также особую роль рДНК в процессах образования ассоциаций. Робертсоновские транслокациии также обуславливают несбалансированность. Согласно гипотезе Клайна (1983), активация спирализированных аутосомных сегментов хромосом, которая включает транскрипционную активацию рибосомальных генов, будет иметь более высокий эффект, чем менее активная часть генома. Некоторые X-Y-биваленты показывают спирализацию в средней пахитене в незначительном числе клеток. В соответствии с этими данными
предполагается, что в отдельных случаях стерильность определялась тем, что некоторые из X-Y-бивалентов оказывались блокированными и подвергаются морфологической реверсии. Эти морфологические изменения сопровождаются реактивацией Х-хромосомы, что подтверждается наблюдениями хромосомной деспирализации. Однако, по данным Vidal et al. (1987), ассоциация перестроенных хромосом с половым бивалентом не является главной причиной стерильности носителей аутосомных транслокаций и не обязательно влечет за собой арест мейоза. Тем не менее электронно-микроскопические исследования пахитенных сперматоцитов обнаруживают неполный синапсис поврежденных хромосом (Мозес, 1977), который является характерной чертой нарушения плодовитости самцов. Такие нарушения плодовитости были приведены Сирли(1974) и Миклош (1974), указывая, что неполное спаривание может привести в мейозе к стерильности самцов. Точка зрения на поведение мейотических хромосом у гетерозиготных носителей транслокаций, (Miklos, 1974), кратко уже упоминалась выше. Согласно предлагаемой гипотезе, неполная, частичная конъюгация гомологичных хромосом представляет собой результат взаимодействия «ненасыщенных районов спаривания», вероятно, ответственных за стерильность, и приводит к гибели сперматоцитов в течение мейоза. Согласно этой гипотезе для выживания сперматоцитов необходима "насыщенность" участков конъюгации (то есть отсутствие мест двуцепочечных разрыва) при гомологичном синапсисе в течение пахитены. Ошибка X-Y-синапсиса мешает способности насыщения районов спаривания, результатом двуцепочечных разрывов и потерей сперматоцитов в клеточной популяции. Эта гипотеза предполагает, что самцы всегда подвержены подобным воздействиям в гаметогенезе, в отличие от самок. Предполагается, что негомологичное спаривание между неспаренными хромосомными районами не оказывает повреждающего воздействия на гаметогенез (у самок нет X-Y-ассоциаций). У самцов в мейозе тенденция к
негомологичному спариванию приводит неспаренные аутосомные районы
к X-Y- синапсису и таким образом, к нарушению Х- хромосомной
инактивации, а в дальнейшем - к стерильности. Если исходить из этой
гипотезы, то локальный асинапсис может нарушить целую систему
дифференцировки спермы. Но все же только локальными дефектами
хромосом при спаривании, вероятно, трудно объяснить эффект
стерильности. Вероятно, необходима непосредственная связь аутосомного
нарушения с X-Y-половыми бивалентами. Факторы, определяющие такую
предпочтительную ассоциацию различных негомологичных участков,
остаются пока неизвестными, хотя вариабельность в количестве
ассоциируемых и неассоциируемых случаев, возможно, поможет
определять степень повреждения мейотических хромосом, ведущих к
аресту сперматогенеза.Спотанно возникшие перестройки (аберрации)
нередко нарушают мейоз и приводят к стерильности гетерозигот
(Reed, 1992). Механизмы исчезновения мейотических стркутурных
нарушений оказываются очень похожими, что выражается в
негомологичном спаривании гетероморфних сегментов. В случае робертоновских слияний в прицентромерном районе новообразованного тривалента (метацентрика) у гетерозигот формируется боковое плечо. Инверсии, выпетливания (боковых элементов СК), делециии, амплификации нивелируются при синаптической коррекции ((Moses, 1979). Эти примеры показывают роль негомологичного спаривания, которая заключается в превращении сложной или частично асинаптическои конфигурации в полностью синаптируемую (восстановление линейности боковых элементов СК). Данный феномен обеспечивает перестройкам (аберрациям) прохождение через профазу мейоза и, как следствие этого, нормальное развитие гамет. Другая, существенная функция негомологичного спаривания в профазе мейоза - создание условий для нормальной сегрегации хромосом. Благодаря этому снижается риск
образования анеуплоидных гамет (зигот) и эмбриональной гибели( Баранов, Дыбан,1980).
Кариотипическая дивергенция, возникшая между географически изолированными расами (на примере Sorex murinus) не привели к нарушению мейоза и гаметогенеза у межрасовых гибридов. S. murinus, гетерозиготных по одной или нескольким хромосомным перестройкам (Робертсоновским транслокациям (Rb(8,17), Rb (9,13), Rb(10,12), Rb(14,15)) (Рогачева ,1997). Все это свидетельствует о том, что структурная гетерозиготность в данном случае не вызывает стерильности в данном стоке и обусловлена генетическими, а не хромосомными факторами. У межрасовых гибридов наблюдается негомологичное спаривание гетероморфных бивалентов (сегментов).
Морфологические изменения элементов СК выравниваются при
коррекции или сохраняются в некоторых случаях. Роль негомологичного
спаривания(коррекции)заключается в превращении сложной
асинаптической конфигурации в прямолинейную или полностью синаптируемую,что обеспечивает структурным нарушениями полное прохождение через профазу мейоза и условия для нормального развития гамет и нормальной сегрегации хромосом.
Это хорошо согласуется с данными, полученными из ЭМ анализа СК других видов, которые имеют естественно возникшие перестройки. Мейотический механизм «укрощения» хромосомных перестроек сходен у разных видов и для разных перестроек ящериц (Reed et al.,1992, Рогачева , 1998 ).Согласно приведенным данным, не было отмечено нарушений в сегрегации роберстсоновских транслокаций, даже при отрицательном влиянии на плодовитость (этот эффект был незначителен по сравнению с эффектом генетического фона родительских видов). Согласно этим результатам, структурные нарушения не могут в данных случаях являться механизмом репродуктивной изоляции. Вероятно, на примерах S.mumus нейтральные варианты фиксируются в одних популяциях, но остаются
полиморфными в других. Хотя, если две или одна раса вида отличаются по
каким-либо хромосомным перестройкам и при этом эти гибриды
демонстрируют нарушения мейоза, то причиной этих нарушений совсем не
обязательно должна быть кариотипическая дивергенция. Нарушения могут
быть обусловлены и несовместимостью родительских геномов, вызванной
генетической дивергенцией.( Рогачева , 1998).
Роль гетерохроматина в мейозе в настоящее время обсуждается многими
авторами, но имеющиеся данные достаточно противоречивы в связи с
функциональным состоянием хроматина (Прокофьева-Бельговская, 1971).
Имеются сведения о роли гетерохроматина в мейозе, а именно о его
неоднородности. Как известно, существуют две формы гетерохроматина -
конститутивный и эухроматин, который может содержать различное
количество высоковторяющихся последовательностей ДНК
(Графадатский с соавт.,1995). Причем по сведению некоторых авторов гетерохроматиновые участки хромосом характеризуются более коротким С, чем эухроматиновые, что обнаруживается в неравной длине осей боковых элементов СК в гетерологичных (гетероморфных) бивалентах и частичном асинапсисе (Бородин, 1992; Sharp, 1986; Hale et al., 1993). При неравной длине боковых элементов осей СК сперматоцитов у межвидовых гибридов мышей наблюдается большая частота частичного асинасиса, что, вероятно, связано с различиями в количестве гетерохроматина. Длина образовываемого СК неодинакова для разных последовательностей. Существует предположение, что в районе гетерохроматина невозможна инициация синапсиса, и гетерохроматин инертен при рекомбинации (Gillies et al,1994). Так, последнее обнаружено в гетерохроматиновых участках половых хромосом у песчанок- Gerbilus неравный кроссинговер приводит к полиморфизму по величине X, Y- хромосом (Hale, Greenbaum,1993, 1994).
Лайон (Lyon, 1992), обсуждая вопросы X-Y конъюгации и стерильности, полагает, что сперматогенез зависит не только от наличия или отсутствия
Х-гетерохроматина, но и связи с эухроматином .Важность X-
гетерохроматин-эухроматиновой непрерывности является также
доказательством распространения стерилизующего и нестерилизующего
эффекта на Х- А транслокационные точки разрыва. Х-А транслокации, все
Х,2 и Х,3 транслокации, за исключением тех, у которых Х-точка
повреждения расположена внутри или проксимально (но даже и эти с
термина льным или субтерминальными разрывами на обеих хромосомах),
приводят к стерильности (Lindsley, Tobuyasu, 1980). Эти результаты
приводят к гипотезе, что Х-хромосома является инактивированной в
раннем сперматогенезе посредством влияния цис-действующего
гетерохроматинового регуляторного локуса. Как цитологические, так и
молекулярные данные указывают как Х-сайты спаривания
(гетерохроматиновые локусы), ответственны за стерильность. Все X-гетерохроматиновые недостаточности, могут быть причиной как нерасхождения, так и нарушения конъюгации с нормальной Y-хромосомой, также и причиной стерильности (McKee, Lindsley, 1987). Молекулярная конформация Х-сайтов спаривания и локусов фертильности можно было бы выявить, используя Р-элементы для трансформации клонированных rRNA-генов. Тем не менее, подразумевается, что ошибки X-Y конъюгации оказываются непосредственно ответственными за нерасхождение, мейотический дрейф и, наконец, за одну из форм хромосомной стерильности.Эти результаты предлагают альтернативу гипотезы предварительной Х-инактивации. Хотя имеется молекулярное доказательство транскрипционной инактивации всех хромосом перед или в течение первого мейотического деления, но нет фактического доказательства ранней Х-инактивации. Важность сцепления Х-сайтов спаренного и неспаренного эухроматина предполагает, что инактивация может быть переключена посредством мейотического спаривания. X отличается от аутосом только наличием одного сайта спаривания, и таким образом, инактивация может распространяться от этого места через
неспаренный эухроматин. Аутосомы же имеют множественные участки спаривания и, следовательно, множественные центры инактивации. Таким образом, несовместимость между X и крупными аутосомами может отражать взаимодействие и механизм инактивации скорее, чем различия по времени инактивации.
4.3. Электронно-микроскопический анализ синаптонемных комплексов у самцов-гибридов.
В настоящее время получил применение электронно-микроскопический анализ синаптонемных комплексов, позволяющий изучить хромосомные перестройки на более ранних стадиях мейоза еще в пахитене -диплотене. Цитогенетический анализ мейоза до недавнего времени ограничивался исследованиями хромосом в диакинезе-метафазе 1. В связи с большей чувствительностью этого метода можно выявить микроаберрации, которые не обнаруживаются при световой микроскопии и получить информацию, которую не дает метафазный анализ хромосом. С помощью электронно- микроскопического анализа СК можно изучать поведение мейотических хромосом и, возможно, определять на цитологическом уровне причину стерильности, что представляет особый интерес для изучения гибридной стерильности.
Однако до сих пор остается не ясным, как связан картин морфологической изменчивости, которые выявляются при исследовании СК у гибридов, непосредственно с нарушениями фертильности гибридов. Во всяком случае известно, что многие аберрации хромосом не обязательно приводят к дисфункции сперматозоидов и их неспособности к оплодотворению (стерильности). Часто глубокие нарушения в структуре гибридного генома приводят к гибели зародышей на самых ранних этапах развития. Иногда эта гибель также рассматривается как нарушение
фертильности, особенно в тех случаях, когда развитие эмбрионов не изучалось.
Несмотря на интерес, проявляемый к проблеме гибридной стерильности, для достижения полного понимания основных механизмов, лежащих в основе этого феномена, необходим широкий сравнительный анализ как генетических, так и цитогенетических данных. Структурные и геномные различия между родительскими геномами могут нарушить нормальный синапсис хромосом у первого поколения гибридов в течение профазы 1 мейоза, что, вероятно, приводит к образованию аномальных конфигураций в процессе мейоза и негомологичному синапсису в процессе коррекции. Изучение аномалий поведения мейотических хромосом и морфологических нарушений в формировании синаптонемных комплексов (СК), как одной из причин гибридной стерильности, может пролить свет на решение этой проблемы.
Первое электронно-микроскопическое исследование СК распластанных сперматоцитов на стадии средней пахитены было проведено Мозесом и др., (Moses et al.,1979) на гибридах двух подвидов лемуров (Lemurs), которые различаются по числу Робертсоновских транслокаций. Анализ СК сперматоцитов выявил триваленты, представленные одним метацентриком и двумя акроцентриками. Наблюдаемые конфигурации гетероморфных тривалентов показали нарушения конъюгации между родительскими и гибридными хромосомами, хотя наблюдается за-держка синапсиса в прицетромерных гетерохроматиновых районах (цис- конфигурация акроцентрических кинетохор по отношению к метацентрику). Относительные длины СК эквивалентны соответствующим митотическим хромосомам, что подтверждается механизмами коррекции у этих гибридов. Электронно-микроскопические исследования пахитенных сперматоцитов обнаруживают неполный синапсис поврежденных хромосом, что характерно для самцов с нарушенной плодовитостью. (Moses, 1977) арактеристике первичных сперматоцитов различных
гибридов лабораторных (Mus musculus ) и диких мышей (Mus spretus)
посвящена серия исследований Матсуда с coaBT.(Matsuda et al.,1990,
1992). Обнаружена диссоциация Х-У половых хромосом. ЭМ анализ
распластанных сперматоцитов продемонстрировал отсутствие участка
СК между осями X и У хромосомы, что является признаком нарушения
синапсиса, по-скольку в норме половые хромосомы имеют участок СК
Наблюдались некоторые дополнительные аномалии у гибридов первого
поколения, которые включали повторное самоскладывание, или
аутосинапсис (self-folding) неспаренных осей Х-У половых бивалентов. С
помощью светового и ЭМ анализа СК исследовали синапсис
мейотических хромосом у стерильных гибридов первого поколения
самцов -мышей, а также потомков от возвратного скрещивания Mus
musculusa ( линии C57B1L6J) х Mhs spretus. Было подтверждено наличие
мейотических аномалий у гибридов, как аутосомных, так и половых
бивалентов ( Hale et al.,1993). Обнаружена вариабельность мейотических
нарушений, которые, вероятно, определяют неспособность к
оплодотворению. Аномалии на стадии пахитены характеризовались наличием диссоциации X и У половых хромосом (унивалентностью), а также частично асинаптирующими аутосомными бивалентами. Наблюдали также неравнозначность по длине СК гомологов при негомологичном синапсисе и ассоциацию асинаптических аутосомных участков с X-хромосомой. Эти явления преобладали у первого поколения самцов, которые были стерильны, хотя самки первого поколенияимели пониженную плодовитость.
В этой же работе для изучения сцепленной с полом стерильности было проведено маркирование теломерных участков Х-хромосомы с помощью проб ДНК, где локализован псевдоаутосомный район РА ( участок синапсиса Х-У хромосом). Авторами была отмечена значительная корреляция между стерильностьюсамцов и отсутствием синапсиса в РА районе. Этим данным соответствуют показатели гетерогенного
происхождения X и У хромосом, полученные при блот-гибридизационном анализе.
Эти данные были подтверждены при светомикроскопическом анализе в первой мейотической метафазе (Ml) : высокая частота Х-У - диссоциации (95% ), сравнимая с таковой и у гибридов Mus musculusa лабораторной линии С57В6 х Mus domesticus. (Hale et al,1993). Вероятно, генетическая дивергенция района спаривания Х- и У -хромосом между различными видами является первичной причиной диссоциации и в течение мейоза приводит к нарушению спаривания.
ЭМ анализ синапсиса хромосом был проведен у двух видов мышевидных хомячков (Calamucsus) и гибридов между ними, различающихся по Робертсоновским транслокациям и наличию добавочных гетерохроматиновых плеч на трех акроцентриках и околоцентромерных блоков гетерохроматина в метацентриках. (Бородин, 1992 ). Полный набор из 7 тривалентов с короткими неспаренными прицентромерными районами акроцентриков наблюдается только в клетках на стадии ранней пахитены Но в конце пахитены происходит полный синапсис акроцентиков с гомологичными районами метацентрика, субцентромерные районы акроцентриков редко синаптируют друг с другом. В некотором количестве клеток у гибридов вместо обычных би -и тривалентов наблюдали пента - и гексавалентные цепочки. По мнению автора, можно предполагать, что возникновение таких конфигураций связано с синапсисом добавочных гомологичных гетерохроматиновых блоков, локализованных в разных хромосомах.
Также был проведен ЭМ анализ СК У двух видов оленьих
хомячков(Реготу8СшЬеа1ае), гетерозиготных по интерстициальному
гетерохроматину, имеющих большие блоки гетерохроматина на
хромосомах (Sudman et al.1989). У каждого самца были отмечены
асипнатические конфигурации - гетероморфные биваленты
:интерстициальный асинапсис -терминально расположенные
асинаптирующие сегменты хромосом на стадии ранней пахитены. Эти
конфигурации подвергаются синаптической коррекции в средней пахитене
(Moses etal,1979). Боковые элементы полиморфных бивалентов оказались
типично гомоморфными, а в некоторых случаях обнаружили
терминальный асинапсис. ЭМ анализ СК показал нарушения нормального
мейотического процесса у этих видов хомячков, особенно ясно это
наблюдалось в инвертированном сегменте гетероморфного бивалента 22,
где происходит негомологичный синапсис (гетеро-синапсис). Проведенные
измерения длины СК сперматоцитов хомячков на разных стадиях пахитены
(ранняя, средняя, поздняя) выявили различия в длине СК аутосом,
имеющие асинапти-ческие конфигурации (интеркаллярный и
терминальный асинап-сис). Обнаруженные в ранней пахитене отдельные
асинаптические участки гетероморфных бивалентов корректируются в
конце поздней пахитены, четко демонстрирут синаптическую коррекцию.
В результате гибридизации в лабораторных условиях кариотипически
сходных полевок (Mus. shidlovski (2n=60)x Mus.binomi nnatus (2n=62 )
получены стерильные самцы и самки с пониженной плодовитостью (
Ахвердян, 1989).ЭМ анализ СК показал правильно сформированные
аутосомные биваленты и диссоциирующие Х-У половые хромосомы., т.е.
униваленты (нарушение синапсиса половых хромосом), а также замкнутый
половой бивалент. X -У половые хромосомы располагались по периферии
клетки, что характерно для мышей с пониженной плодовитостью (Richler et
al.1985). Иногда наблюдались наложения или ассоциация аутосом с
половыми хромосомами. Ах-вердяном была проведена также
гибридизация T.daghestanicus : о 38 хромосомная форма X о 42 хромосомная форма (NF = 58) и получены гибриды первого поколения, Также были обнаружены 16 аутосомных бивалентов, две транслокационные конфигурации ( триваленты и асинаптирующие Х-У половые хромосомы).
От двух гибридов песчанок (Meriones shawix х Meriones libycus) (Gerbilidae) для ЭМ анализа СК на стадиях ранней и средней пахитены были отобраны 47 клеток, в которых наблюдали 18 аутосомных бивалентов и 2 тривалента ( Ratomponiriina et al.,1989). У хорошо идентифицируемых тривалентов наблюдалось замедление синапсиса, который завершался в поздней пахитене. В 17 бивалентах полный синапсис был в ранней пахитене, хотя дистальные сегменты одного из бивалентов показали задержку синапсиса в некоторых клетках. Отмечено, что у гетерохроматизированных хромосом, имеющих замедленный синапсис в ранней пахитене, боковые элементы обычно асинаптировали и оказывались более интенсивно окрашенными, подобно унивалентам, либо инициация синапсиса у них начиналась на уровне дистальных сегментов, как у родительских видов.
Иногда, как исключение, синапсис мог начинаться в средней части бивалентов и также наблюдался аутосинапсис у гибридов. Бородин и др., 1992 ). Половые хромосомы представляют различные типы ассоциации (конец - в -конец ) у чистых видов, а у их гибридов Х-У хромосомы часто диссоциируют и имеют различную степень окрашивания осей. Различия в поведении половых хромосом определяли в зависимости от ранней- поздней стадий пахитены. Подковообразная форма конфигурации Х- хромосомы наблюдалась чаще, чем У-хромосомы. Аутосомные биваленты имели необычное мейотическое поведение - неполный или замедленный синапсис. Наблюдаемая инициация синапсиса хромосом более быстрая в одних сегментах, чем в других, что, вероятно, связано с наличием гетерохроматиновых блоков.
Околоцентомерные районы аутосомных бивалентов показывают замедленный синапсис, некоторые из них терминально синаптированы. Проведенный светомикроскопический анализ показал, что митотические хромосомы разных видов песчанок характеризуются вариабельностью в размерах блоков интеркаллярного гетерохроматина, определяемых с
помощью С-окрашивания. В диакинезе все аутосомы формировались в биваленты.
Исследование австралийских крыс показало, что различные виды Rattus могут быть гибридизированы в лабораторных условиях и некоторые гибриды имели ограниченную фертильность ( Baverstock et al.,1983). Однако только в случае скрещивания R.vilosissimus X R.collentti действительно были получены данные, показывающие, что гибриды страдают несколько редуцированной фертильностью. Эти 2 вида крыс обладают хромосомными различиями с моноброхиальной гомологией. У гибридов образуется в мейозе цепь из 5 бивалентов (3, 3/10, 10/6,6/9,9). Гибриды от 2п=38 и 2п=42 кариоформ, полученные при обратных скрещиваниях родительских форм R.rattus имеют значительно редуцированную фертильность, определяемую посредством очень маленького размера потомства (Yosida,1980). Эти формы отличаются двумя Робертсоновскими слияниями, вовлекающими 4 различные хромосомы, которые, следовательно, образуют два тривалента в мейозе. Эти две формы имеют, повидимому, значительные генетически различий родительских геномов.
ЭМ анализ СК продемонстрировал наличие морфологических нарушений структуры половых бивалентов, которые оказываются только у стерильных самцов. Но ряд аномалий синапсиса половых хромосом наблюдали в около 4% таких сперматоцитов у самцов в норме , как, например, у крысы Rattus norvegicus Джозев и Чандли (Joseph and Chandley, 1984), случаи двойной терминальной конъюгации осей X и У хромосом на стадии пахитены. Отмечается, что, как и у мышей, оси X-хромосом крыс интенсивнее окрашиваются нитратом серебра по сравнению с аутосомами, причем оси Х-хромосом значительно толще, чем оси У-хромосомы На концах обеих половых хромосом имеются темно окрашенные кнобы.
ЭМ анализ СК гибридов F1 слепушонок Ellobius, полученных от
свободного скрещивания в природных популяциях гибридов,
разнохромосомных форм, живущих в долине реки Суркоб (2п =44,46,48, 50), между собой и возвратного скрещивания гибридов первого поколения с родительскими формами был проведен Коломиец с соавт. (1986).У всех самцов-гибридов во всех сперматоцитах на стадии пахитены были обнаружены цепочки хромосом, объединяющие от 5 до 12 хромосом. Число хромосом не всегда было кратно трем, следовательно в состав таких цепочек были включены не только триваленты, включавшие один метацентрик и два акроцентрика, но и непарные хромосомы, присутствие которых в кариотипе гибридов второго поколения может быть результатом формирования несбалансированных гамет у гибридных родительских форм. У таких гибридов идентификация элементов в цепочках удается с трудом из-за множественного интерлокинга и брешей в структуре осей хромосом. У гибридов второго поколения в составе цепочек обнаруживались как СК-триваленты, так и СК-тетраваленты. Половой бивалент у самцов этого вида в отличие от самцов других видов млекопитающих формирует в 1 профазе мейоза закрытый половой бивалент. У гибридов Fl, F2 всегда обнаруживается открытый (с одного конца) половой бивалент.
Однако ассоциация полового бивалента с аутосомами обнаруживается в единичных клетках гибридов. Также были исследованы гибриды F1 (2п=33 и 2п=51) от скрещивания кариоформ, отличающихся по одной паре хромосом - Е. tancrei (2п=34 и 32), Е. alaicus (2п=52) и Е. tancrei (2п=50). На препаратах у гибридов 2п=33 обнаружено 14 аутосомных бивалентов, половой бивалент и один тривалент (Ляпунова с соавт 1990). Рогачевой (1998) были исследованы две географически изолированные хромосомные расы белозубок - Suncus murnus (Insectivora, Soricidae), населяющие Непал и Шри-Ланку, и была подтверждена гипотеза гибридного происхождения Малайской популяции Suncus murnus. Показано, что у этих двух рас,
происходящих от видов, различающихся по 5 робертсоновским траснлокациям (Rb(8,17), Rb(9,13), Rb(10,12), Rb(14,15), не происходит нарушения мейоза и гаметогенеза у межрасовых гибридов. Но при скрещивании аутбредных линий белозубок КАТ и гибридной SK (виварий Нагойского университета) были получены гибридные стерильные самцы, подразделенные на две группы по признаку веса семенника, (признаком стерильности служила степень редукции массы семенников). При массе менее 100 мг семенные канальцы были узкими и почти запустевшими. Из клеток сперматогенного эпителия в них присутствовали только сперматоциты первого порядка; но ни сперматид, ни зрелых сперматозоидов не было обнаружено, что свидетельствовало о блокировке сперматогенеза на стадии профазы мейоза. Однако среди самцов гибридного стока SK в гибридной популяции у S. murinus были обнаружены случаи мужской гибридной стерильности. Всего было проанализировано 59 взрослых самцов стока SK Электронно-микроскопический анализ СК распластанных сперматоцитов, проведенный у 4 стерильных самцов, подтвердил этот вывод. Большинство хромосом не синаптировали или не были спарены полностью, причем не только гетероморфные, но и гомоморфные хромосомы; количество аберрантных синаптонемных комплексов на клетку было выше, чем количество гетерозиготных комбинаций. Мейотические клетки по некоторым признакам были похожи на дегенерирующие клетки, так, например, в них отмечено наличие электронно - плотного материала. Это означает, что мейоз у стерильных гибридов был серьезно нарушен и блокирован на стадии пахитены. Стерильные самцы имели все возможные комбинации половых хромосом. В результате проведенного анализа не было обнаружено нарушений сегрегации робертсоновских транслокаций и влияния гетерозиготности на плодовитость по сравнению с эффектом генетического фона родительских линий. По-видимому, генные факторы оказались более важными, чем хромосомные. Представленные данные свидетельствуют о том, что становление репродуктивной изоляции между
географическими расами (гибридная стерильность в стоке SK) обусловлена генетическими, а не хромосомными факторами.
Была исследована хромосомная конъюгация и рекомбинация у
самцов ящериц (Sceloporus grammicus), гетерозиготных по большой
перицентрическои инверсии 4-ой хромосомы. ( Reed et al.,1992 ). ЭМ
анализ СК обнаружил, что гомологично спаренные петли не были
образованы там, где синапсис инвертированных сегментов прямо
предшествовал негомологичному спариванию. В некоторых клетках в
результате этого наблюдаются конфигурации, которые не отличимы от
гомозиготного бивалента подобного размера. Два цитотипа были
представлены FM2 (2 п =43-45) , F5 ( 2п = 31). ЭМ анализ зигтены и
пахитены показал, что синапсис тривалента был синхронным с
гомологичными аутосомными бивалентами, поэтому завершение
синапсиса было замедлено в триваленте. Ассоциации между тривалентом
и другими аутосомными или половыми хромосомами наблюдаются
приблизительно у одной трети исследованных пахитен. Эти данные могут
показывать, что изученное поведение гетероморфных бивалентов по 4
инверсии подтверждает гипотезу о потенциальных потерях в течение
мейотического процесса, протекающего в условиях такого
гетероморфизма.
У гибридов-самцов серебряного и голубого песцов были обнаружены нарушения в первой профазе мейоза на стадии пахитены: интенсивная дегенерация клеток и отсутствие более поздних стадий, включая диакинез (Gustavsson et al.,1988 ). С помощью светового ЭМ анализ СК изучены кариотипы лисиц, содержащие Робертсоновские метацентрики, которые образуют цепочки мультивалентов с теломерным асинапсисом, но только у части мультивалентов. Половые хромосомы представлены унивалентами.Аутосомы имели электронно-плотные участки ("бусинки") на концах (теломерах) синаптирующих осей боковых элементов. Обнаруженная стерильность гибридов есть следствие
нарушения синапсиса хромосом, обусловленного значительной
кариотипическими различиями двух видов. Эти различия проявляются в
синапсисе гомологичных хромосом в наличии большого числа
неспаренных хромосом. Описанные нарушения синапсиса хромосом, вероятно, являются достаточной причиной дегенерации сперматоцитов и арестом сперматогенеза на ранних стадиях мейоза.
В первых исследованиях по межвиовой гибридизации домашних животных Патак и Киффер ( Pathak, Kiefer,1981) были показаны нарушения структуры СК впахитене у гибридного самца от бантенга и домашней коровы (Bos javariicus X Bos taurus) с завершением сперматогенеза на стадии пахитены (пахитенный арест), что наблюдается также и у других межвидовых гибридов млекопитающих.
Установлено, что гибридное потомство первого по-коления от межпородных скрещиваний бантенга с домашней коровой абсолютно бесплодно у самцов, но плодовито для самок (Стекленев, Елистратова,1992). При скрещивании гибридных самок с самцами исходных видов плодовитость гибридных самцов дальнейших поколений постепенно восстанавливается. Отмечается гибель зародышей и плодов на различных стадиях эмбриогенеза. В результате исследований синаптонемных комплексов гибридных самцов с различной степенью стерильности было отмечено, что у особей со сниженной плодовитостью количество клеток в пахитене значительно меньше, чем у плодовитых. Изменяется морфология самих клеток, имеется достаточное число дегенеративных пикнотично окрашенных, клеток.
Начиная с поздней зиготены, у гибридов обнаруживаются нарушения структуры СК: фрагментация, распад структуры СК, появление глыбок электронно-плотного деструктивного материала, интенсивно окрашенного азотнокислым серебром. Можно считать, что причиной этого явления, приводящего к стерильности бантенговых гибридов, является нарушение
синапсиса гомологов на начальных этапах сперматогенеза, хотя точные причины пока не известны.
Изучение фертильности копытных у гибридов первоио поколения и потомства крупного рогатого скота от возвратного скрещивания (Bos taurus) (2 n= 60) с яком (B.grunnniens) (2 n = 60) проводилось в Монголии (Tumennasan et al, 1997). В результате скрещиваний были получены стерильные гибриды первого поколения (хайнак), которые имели редуцированное число сперматогоний в семенных канальцах, характерное для .хайнаков.
Несмотря на цитологическое сходство двух родительских кариотипов, синаптические аномалии обнаружены в первичных сперматоцитахв в 1 мейотической профазе. ЭМ анализ СК от семенников быков показал нормально синаптиру-мые биваленты среди 10 анализированных клеток на стадии пахитены. В противоположность этому, среди 10 клеток от двух хайнаков только три клетки характеризовались нормальным синапсисом, в то время как у других наблюдали синаптические аномалии (частичный синапсис, оси боковых элементов были полностью друг от друга отделены), подобно унивалентам, некоторые СК были фрагментированы или разрушены. Гибриды, участвующие в скрещиваниях, были сексуально незрелыми по сравнению с яками и гибридами от возвратного скрещивания.
Повреждения сперматогенеза на стадии ранней профазы мейоза каждого животного могут быть объяснены структурными различиями между родительскими хромосомами, как было показано ранее у гибридов Chenese munjасе х Indian munjасе (Shi and Phathak,1981) у мула и хинни ( Chandley et al, 1974). Хотя аномалии синапсиса были в первой профазе мейоза, но пока не ясно, является ли это причиной некоторых нарушений зародышевых клеток. В случае гибридной стерильности физиологические нарушения возможно имеют место, как и различия между родительскими хромосомами. Данные исследования еще раз подтверждают правило
Холдейна относительно стерильности гибридов первого поколения.
Основной вывод: если родительские виды у гибридов являются сходными,
или идентичными, то, следовательно, имеется больше шансов для
нормального синапсиса по сравнению с видами, имеющими в кариотипе
структурные перестройки. Серией исследований гибридов быков (сем
Bovinae) Доллин и др.(БоШп et al,1985,1989 ,1991) с помощью ЭМ анализа
СК изучены мейотические механизмы асинапсиса хромосом. Так, при
скрещивании (Brachman х Hereford) были получены 9 гибридных быков
первого поколения, которые характеризовались тестикулярной
гипоплазией (Dollin et al.,1985). Это проявление в свою очередь может быть связано с увеличением частоты хромосомных нарушений, не выявляемых с помощью рутинной техники кариологического ( метафазного ) анализ. Для определения таких нарушений применили ЭМ анализ СК от сперматоцитов 7 гибридных быков. На двух стадиях зиготены-пахитены были обнаружены различные асинаптические конфигурации: квадриваленты (типа крестов), образующие цепочки и "открытые" биваленты. Кроме того, были обнаружены трехслойные СК. Эти данные свидетельствуют о наличии реципрокной транслокации, возможно, снижающей плодовитость данного гибридного скота в последующих поколениях.При исследований субфертильных быков ( Brown Swiss), несущих 3 транслокации. I,8,9)(q43;ql3;q26), в 23 клетках на стадии диакинезе-М1 показаны 28 конфигураций, включающих один большой гексавалент. Гистология из клеток семенников и размеры самих семенников и канальцев были нормальным (Dollin et al.,1989). ЭМ анализ СК обнаружил структурные нарушения хромосом: гексавалентную конфигурацию в 52 ив 53 пахитенных клетках. 27 клеток (51%) имели полностью синаптируемые гексавалентные конфигурации, показывающие явно негомологичный синапсис между нормальными и транслоцируемыми хромосомами, вовлеченными в обмен. Тридцать клеток показали гексавалентную конфигурацию с определенно неспаренными
гексавалентную конфигурацию с определенно неспаренными хромосомными сегментами, но с полностью спаренными терминальными участками хромосом. В 13 клетках, включая одну зиготену, транслокационные хромосомы образовали открытый гексавалент, и в одной клетке имелись два полностью синаптирующих тривалента. В дальнейших исследованиях Доллин с соавт. (Dollin et al.,1991) показали с помощью ЭМ анализа СК мейотические механизмы асинапсиса хромосом у гибридов первого поколения (Brachman х Hereford). Общие аномалии СК связаны с ошибками конъюгации (участки асинапсиса метацентических хромосом и интерлокинг). В течение зиготены - пахитены наблюдались аномальные аутосомные онфигурации:"открытые" биваленты с утолщенными осями боковых элементов, которые сочетались с интерлокингом, причем последний отмечен только на стадии пахитены. Подобные асинаптические конфигурации рассматриваются авторами как возможная средняя стадия при переходе от открытого бивалента к конфигурации интерлокинга. Наблюдались два типа интерлокинга по классификации Расмуссена и Холма ( Rasmussen, Holm, 1980) :бивалентный интерло кин, когда асинапптируемый бивалент переплетается с СК другого бивалента и хромосомный интерлокинг, когда асинаптирующий боковой элемент переплетается сСК бивалентом.
По мнению авторов, наблюдаемый интерлокинг у межвидовых гибридов представляет собой сплетение несинаптируемых боковых элементов СК двух открытых бивалентов на стадии средней пахитены с последующим завершением синапсиса в этих бивалентах на стадии поздней пахитены. Если на стадии поздней пахитены происходит завершение синапсиса между боковыми элементами разных бивалентов, то в результате образуется конфигурация с негомологичным синапсисом. С интнрлокингом к поздней пахитене. Примеры этих аномалий показывают, что генетические различия между видами в некоторых случаях, возможно, являются детерминирующими и вовлеченными в процесс синапсиса
полиморфизм по гетерохроматину, коррелирующий с районами
интерстициального асинапсиса ибридов. Сопоставляя размер
полиморфизма по количеству гетерохроматина у родительских видов с
протяженностью участков асинапсиса гомологов у гибридов на стадии
пахитены, авторы заключили, что различия по количеству
гетерохроматина являются не единственной причиной, поскольку асинапсис может быть результатом также генного дисбаланса, что согласуется с высказываниями других авторов ( Mitwoch, Mahadeviah, 1992).
Электронно-микроскопический анализ синаптонемного комплекса болотного и речного буйволов (Bubalus bubaluis) гибридов первого и второго поколений, а также бэкроссов показали наличие унивалентов половых хромосом, а также мультивалентные аутосомные конфигурации в Fl( Dai et al, 1994). Установлен уровень мейотических аномалий: *29 % сперматоцитов речных буйволов и 46 % - болотных буйволов имели аномалии синапсиса. Значительно более высокая частота аномалий (48 %-72%) была обнаружена у особей F1,F2 и бэккроссов с кариотипами (2 п=48 , 49 или 50.), а также высокая частота оказалась у 2 п=49. Аномальные синаптические конфигурации часто являются результатом взаимодействия неспаренных осей бивалентов или сегментов, которые не всегда вовлекались в синапсис. Оказалось, что в течение зиготены -пахитены замедлены мейотические процессы у гибридов-буйволов , частота аномалий уменьшается от типа подстадий. Кроме того, учитывался уровень аномалий спермотозоидов - нарушения конъюгации в течение мейоза могут отражать некоторую несовместимость между гомологами от различных скрещиваний. Большая часть нормальных спариваний в поздней пахитене определяет, что большинство клеток переходит эту стадию инициации спаривания с трудностями.
Проведен сравнительный анализ кариотипов близ кородственных видов гупий Poecilia reticulatus ( Rodionova et al, 1996 ). Используя ЭМ
анализ синаптонемных комплексов, были исследованы в первой мейотической профазе самцы гупий черного Р sphenops и P. velifera и гибридов между этими видами. Мейотические хромосомы чистых видов и вышеуказанных гибридов показали полное спаривание мейотических хромосом, в пахитене. Гетероморфизм не был обнаружен по каким либо хромосомам. Другие гибриды P.velifera х P. reticulatus имели в большинстве пахитен различные признаки ошибок синапсиса хромосом : униваленты, интерлокинги, множественное негомологичное спаривание, ассоциации конец - в -конец. Однако в небольшом количестве клеток обнаружено полное спаривание гомоморфных бивалентов. Эти данные говорят в пользу того, что генетическая дивергенция между видами не сопровождается хромосомными перестройками; ошибки синапсиса хромосом у этих гибридов, по-видимому, определяются различием видоспецифических механизмов, контролирующих мейотическую профазу, а не хромосомную дивергенцию.
Таким образом, с помощью анализа СК исследуют характер поведения мейотических хромосом, определяют на цитологическом уровне причины стерильности различных видов млекопитающих При гибридизации выявляются особенности поведения мейотических хромосом, характерные для первого поколения гибридов -самцов., которые,вероятно. определяют неспособность к оплодотворению. Нарушения синапсиса в течение мейоза могут отражать некоторую несовместимость между гомологами от различных родительских геномов при гибридизации.
У+
Vt«
+
V-
Рис. 1. Мыши разных генотипов (t -комплексные мыши) по Т-локусу ( разные формы хвоста).
ТсіеЗ
Дикий тип
Tctexl
Tcte2
Тер 10
TcplI
Pgk2
т Т
Тср\
Н2
f-гаплотип
Tctexl
Тер 11 Тер 10 Tcte3
Pgk2
Tcdl
Tcr Tcd3 Tcdl
Рис.2,
Схема расположения r-комплекса на проксимальной части 17-й хромосомы мыши . . Обозначения: Tcdl, Tcd2, Tcd3 - гены-дистортеры, Tcr- ген-респондер, Т- Brachyury, rf- tufted - маркерные мутации, Tcpl, Tctexl, Tcptel, Tcte3 -кандидаты в дистортерные гены, Н2 - главный комплекс гистосовместимости мыши. Pgk2 - фосфоглицераткиназы, Inv 1, 2, 3, 4 - инверсии обозначены бпокамяС frater, Dydeet,).
/08
Рис. 3. Схема раннего эмбрионального развития мышеи
/—нарушения, которые проявляются у гомозигот по летальным гаплотппам T/t-локуса. Пунктирные стрелки — стадия летального эффекта, характерная для данной группы комплементации. / — морула; /->-2 — развитие трофобласта, энтодерма; 2 — бластоциста; 2->3—имплантация, рост внутренней клеточной массы; 3 — ранний яйцевой цилиндр; 3-+4— возникновение экстраэмбриональной эктодермы; 4 — яйцевой цилиндр; 4-+5 — рост яйцевого цилиндра; 5 — поздний яйцевой цилиндр; 5-+б — образование первичной полосы; б — эмбриональный щит; 6->7—формирование по-тохорды, нервной трубки, сомитов; 7 — дефинитивный эмбрион // — схема топкой структуры: аномальной мезодермы (Л) от 8-днсвного 1:9/19-эмбриона, нормальной мезодермы (), аксиальных районов от 9-дневной гомозиготы Т/Т (В) и нормального эмбриона (Г). А — Г — см. также на / [по Bennett, 1975)
/09
Последующие X
инверсии X
X-
Первичная
проксимальная
инверсия
Структура хромосом 17 f-комплекс
Ф Ф
Ш Ш
D17Leh66-элементы
с-
из
Rattus
Dl 7ейб6-последовательностьГ
Рис. 4.Предполагаемая схема эволюции ДНК-элементов 77/>А66-семейства в связи с формированием инверсий f-комплекса. Инверсии показаны прямоугольными блоками, элементы Dl7Leh66 обозначены буквами А, В, С, D, Е,
( но/птёг, /Э2Э)
s О
+....0*
з—рпг>-
Hst4
Tcd/Ti
Hsi6
,1,,,
Ш5
In(17)l In(17)2 In(17)3
LrK17)4
ЗисДДиаграмма трех t-комплекс гомологов . Верхняя линия представляет М/ m domesticus (+) дикого типа гомолог, средняя линия - t-гаплотип (t) гомолог и нижняя линия- М. Spretrtis (S)) гомолог Inv( 17)1- Inv( 17)1-4. Pim 1 изогнутость и дефект развития ресничек, локус гнутость ^гибридной стерильности 6 (Hst 6 ) между маркерами Pim 1 and Cryal ( Ccua) гена изогнутости, Различия в цвете двух боксов иллюстрируют ориентацию инверсий.
t-специфические факторы дистортеров- нарушителей -
стерильности генетически взаимодействующие картируются r Tcsl,Tcd/Tcs2, - Tcd/ТсЗ показаны выше инверсий t-гаплотипа
гомологов, картированы положения Hst 4, 5, 6, и 7. Tcd/tsc2 Tcte2, Тер 11, Tctex 1 и Tctex 2 (а также аксонемных "py4eK"(Samanth, S.A., et al., 1999),
//'
Таблица 4. Основные гены, принимающие участие в определении, становлении пола и прохождении процессов сперматогенеза,а также их локализация и функция у некоторых плацентарных(человека и мыши).
TaS. і (Продол жени$)'
//
t
M
Лабораторные грызуны других родов
Генетическими анализ
Выявление животных-носителей t -гаплотипов в выборках мышей из природных популяций.
Метод выявления носителей /-гаплотипов природного роисхождения основан на взаимодействии мутаций tct {t-complex tail), входящих в состав проксимальной части /-комплекса, с маркерной микроделецией Т (Brachyuri) в транс-положении. Гетерозиготы Т/ t (tct,) не имеют хвоста (Dobrovolskaia-Zavadsaia, Kobczieff,1932; Dunn, Morgan,1932), что тестируется сразу же после рождения. Тестируемые мыши из природных популяций скрещивались с короткохвостыми особями 77+ или представителями стоков T/t. Появление в пометах у тестируемых животных бесхвостых потомков свидетельствует о носительстве ими t-гаплотипов. (.Табл.3) Комплементационный анализ
Для определения комплементационной принадлежности t-гаплотипа используется ряд анализирующих скрещиваний. Два различных летальных гаплотипа tx и ty считаются принадлежащими к одной комплементационной группе, если при скрещивании особей T/tx и T/ty рождается исключительно бесхвостое потомство, что обусловлено эмбриональной гибелью зигот tx/ty и Т/Т. Если в потомстве при данном типе скрещивания отмечается еще один фенотипический класс -длиннохвостые мыши, то это свидетельствует о комплементарности данных гаплотипов (Табл .4).
Для оценки мужской фертильности было предложено понятие "единицы скрещивания" (Dunn,Bennett,1967,1971). Фертильность самцов при этом оценивается как количество потомков на единицу скрещивания.(е.с), где условной считается пара (1 самец х 1 самку), содержащиеся совместно в течение одного месяца. Стандартное сочетание (5 самок х 1 самец) х 2 месяца = Юе.с. Число детенышей, рожденных от изолированных самок, сравнивается с контрольной величиной, за которую принимается количество потомства, полученного за 2 месяца от 5 самок из используемого в опыте стока и одного самца того же стока при аналогичных условиях содержания. Самец, не давший потомства за 10 единиц скрещивания, считается стерильным. Если число потомков, полученных за 10 единиц скрещивания, составляет менее 20% контрольной величины, то самец признается псевдостерильным. Относительная фертильность самца от 20 до 40 % считается низкой, от 40 до 60% -пониженной.(Вшт,Веппеп., 1967,1971).
В наших опытах данный тест модифицирован. Испытуемого самца содержали с двумя самками, сроки совместного содержания составляли от 1 мес. до 1 года. Учитывали общее число потомков, полученных от одного самца, и вычисляли среднее число молодых, приходящихся на одну самку в единицу времени (1 месяц). Самца признавали стерильным, если от него не было получено потомства в течение 2 мес.
В качестве показателей плодовитости учитывали не только среднее число потомков, приходящееся на 1 самку в единицу времени (1 месяц), но и среднюю величину помета (Табл. 5 )
За стандарт были приняты средняя величина помета и число потомков от самца, не несущего ґ-гаплотипов (линии СВА C/lac,C57 В16 ). Плодовитость самцов оценивалась относительно стандарта, за который было принято количество потомков, приходящееся в среднем в течение месяца на одну самку в скрещивании с самцом линии С57В1/6, согласно методу Демина и Сафроновой (1980).
В связи с вариабильностью данного признака в зависимости от генотипа самки ( Демин, Сафронова, 1981) учитывался генотип самок, использованных в качестве контрольных в каждом из опытов. Для определения величины соотношения передачи (TRD) + и t- несущих хромосом гетерозиготные самцы Т/ t скрещивались с самками из стандартных линий лабораторных мышей СВА/С LAC, С57В1/6 и межлинейными гибридами F1. Величина соотношения передачи + и t-несущих хромосом (TRD) вычислялась как отношение длиннохвостых потомков +/t к общему количеству потомков (короткохвостых Т/+ и длиннохвостых, +/f), полученных при данном типе скрещиваний. ( (Табл. 6 )
Препараты митотических хромосом из костного мозга готовили по методу Форда (Ford, Hamerton, 1956). Для кариотипирования просчитывали не менее 50 метафазных пластинок от каждого животного. Для идентификации хромосом использовали стандартную дифференциальную G- и С-окраску по Саммеру с соавт. (Summer et al., 1972).
Препараты меиотических хроомосом готовили по методу Эванса (Evans et al.,1964) и Уильяме (Williams et al.,1962). Клеточную суспензию, полученную из семенников, разделяли на две порции для световой и электронной микроскопии. Каждую порцию просматривали в световой микроскоп для определения количества и подвижности сперматозоидов (X 16). Окрашивание препаратов проводилось раствором Гимза и их анализ проводился на разных стадиях мейоза:зиготена, пахитена, диплотена и диакинез (метафазаі). Анализ синаптонемных комплексов (СК)
Синаптонемный комплекс- специфическая белковая структура (тяж), расположенная между двумя коньгирующимися хромосомами (бивалентами) в профазе 1 мейоза. (Богданов, 1971,1975).Число СК в клетке равно диплоидному набору хромосом. С помощью СК уже изучен синапсис хромосом в клетках многих млекопитающих: домовой мыши, крысы, хомячков, лемуров, слепушонок, собаки, домашней кошки и др. СК-это древнейшая морфофизиологическая структура, что подтверждается биохимическими и иммуноцито химическими исследованиями.
Для анализа синаптонемных комплексов (СК) препараты мейоцитов готовили по модифицированной нами методике получения пахитенных клеток, распластанных на поверхности капли 0,2 М раствора сахарозы (Fletcher (1979). Фиксатор готовили в смеси сахарозы и параформальдегида при рН 8,5, окрашивали 50-70% азотнокислого серебра ( при температуре 37-60 в термостате)
Определение нарушения соотношения передачи потомству гетерозиготных самцов мышей
Анализ ґ-гаплотипов, выявленных из свободно живущей популяции московской популяции домовой мыши, отловленных в течение двух лет в семи удаленных друг от друга точках Москвы, обнаружил при тестировании (выборка из 79 животных) 13 носителей /-гаплотипов, распределенных между двумя популяциями. Обнаруженные 7 самцов-носителей продемонстрировали преимущественное наследование, типичное для полных гаплотипов. Было проанализировано пять гаплотипов, которые дали 60, 54, 81, 66 и 26 потомков соответственно. Комплементационный анализ, проведенный с помощью коллекции /-гаплотипов, выявил отсутствие комплементации лишь в скрещиваниях T/tx х T/tw73. Эти данные позволяют отнести /-гаплотипы, выделенные из генофонда московской популяции, к группе комплементации tw73. В исследовании, проведенном в природных популяциях домовой мыши, таксономический анализ показал, что животные из московских популяций относятся к виду Mus musculus. Кроме того, в силу специфики антропологических воздействий (применение ядохимикатов, ловушек в городских популяциях) частоты и закономерности динамики t-гаплотипов могут иметь свои особенности (Мазин, Сафронова, 1986). С помощью генетического анализа в тестерных скрещиваниях с лабораторной мышью генотипа 77+ t-гаплотип был обнаружен у 1 из 4 тестированных особей домовой мыши вида Mus domesticus из
Хвостатого потомства twMPl/twMPl следует предполагать, что этот гаплотип содержит как tcf-факторы, влияющие на развитие хвоста, так и фактор летальности. На протяжении первых пяти поколений в формирующейся линии наблюдалось появление особей, сохраняющих несколько хвостовых позвонков (15 потомков из 77). Такой эффект, ранее описанный в ряде работ, мог быть объяснен как модификаторным воздействием со стороны генов, локализованных вне -комплекса, так и наличием структурной перестройки в области расположения 1:сґ-факторов и изменением их активности. По первоначальным данным комплементационного анализа, летальная мутация внутри гаплотипа twMPl была отнесена к группе tw5, так как при скрещивании мышей линии T/tw5 и несущих вновь выделенный гаплотип twMPl в форме Т/и не было зарегистрировано выжившего хвостатого потомства при выборке в 39 особей. Были отмечены лишь два случая мертворожденности хвостатых детенышей. Однако при последующих аналогичных реципрокных скрещиваниях, проведенных уже с использованием животных из сформированной линии T/twMPl, было обнаружено появление хвостатых потомков в соотношении 46 бесхвостых : 6 хвостатых. Хвостатое потомство появлялось и при всех вариантах скрещиваний носителей нового гаплотипа с представителями линий T/tl2, T/twl2, T/twl8, T/tw73, T/twPa-1 и T/t6. Таким образом, летальный фактор нового гаплотипа нельзя отнести ни к одной из проверенных нами комплементационных групп (tl2, tw5, twl2, t9, tw73, twPa-1, Ю), среди которых 3 первые являются наиболее распространенными в популяциях мышей Южной Америки (Silver, 1981, Ardlie, Silver, 1996).
Плодовитости, нарушения менделевского соотношения в потомстве (TRD -преимущественной передачи) и соотношения полов в разных вариантах скрещиваний, и включает результаты экспериментальных наблюдений в период с 1975 по 1998 гг. Представлены результаты количественных оценок динамики плодовитости в зависимости от степени вариабельности нарушения менделевского соотношения в потомстве и соотношения полов t-гаплотипов в стоках.
База данных реализована в терминах реалистических таблиц, состоящих из одной и двух соподчиненных таблиц.
Главная таблица представляет данные по каждому семейству мышей («гнездо») с характеристикой количества и даты рождения пометов, количества потомков в каждом помете, соотношения полов в потомстве, расщепление по фено- и генотипу (в случае экспериментальных скрещиваний). Исследование плодовитости представлено на соответствующих графиках, на которых наглядно прослеживается динамика данного показателя. В частности, для одного из стоков (T/twJ2) просматривается довольно слабая сезонная зависимость плодовитости (как величина помета и число молодняка, приходящихся на одну самку в месяц). Эти же показатели оценены для 6 стоков. Вариабельность показателей плодовитости за один и тот же период между представителями различных стоков довольно значительна. Приведены оценки корреляции между этими показателями и данными о величине преимущественной передачи (TRD) и протяженностью /-гаплотипов (Петросян, с соавт., 2003).
Поведение мейотических хромосом у самцов мышей, несущих t-гаплотипы
На основе результатов анализа показателей фертильности полученных гетерозигот была отобрана исходная комбинация стерильных компаундов (FI), на основе нашей коллекции. ( Табл.12) Стерильные самцы-компаунды tl2/twl8, tPa-l/twl8, tw5/twl8, получены на основе ранее проведенных скрещиванийСтерильные самцы-компаунды tl2/twl8, tPa-l/twl8, tw5/tw!8, получены на основе ранее проведенных скрещиваний,
Стерильность определялась по единицам скрещивания (5 самок х 1 самца х 2 месяца =10 ед. скрещивания (гл.11), которые не давали потомства в течение 24-28 единиц скрещивания, те в течение 5-5,5 месяцев Семенники маленькие по сравнению с контрольными самцами Анализ мейоза у них показал резкое уменьшение количества клеток на послепахитенных стадиях по сравнению с контролем. В качестве контроля были использованы самцы стока T/twl8 и линии СЗН /N
Среди гетерогенной популяции сперматоцитов, на микроскопических препаратах легко идентифицировались клетки на стадиях профазы 1 мейоза от поздней стадии зиготены до диплотены. Стадии профазы мейоза определяли по Мозесу (Moses, 1981), те классификацию субстадий проводили основываясь на морфологию СК, полового бивалента и протяженности участка синапсиса Х- и У- хромосом.В соответствии с дифференцированным анализом разделяли по стадиям: ранняя, средняя и поздняя пахитена
Известно, что исследование кариотипов дикоживущих мышей Mus musculus, несущих f-комплекс, выявило отсутствие цитогенетических отличий между ними и особями «дикого типа».(Демин с соавт.1983). Это объясняется тем, что светомикроскопический анализ по своей разрешающей способности не позволяет выявить в 17 хромосоме, несущей /-комплекс, существующие структурные нарушения в виде 4-х неперекрывающихся инверсий (Hermann et al, 1984).(Рис.2 )
Для выявления 17 хромосомы, несущей /-гаплотип, на основе ЭМ анализа СК было проведено кариотипирование тотальных препаратов сперматоцитов у 3 стерильных компаундов ( Рис.10) и измерение длин СК 19 пар аутосом и половых бивалентов. Всего было исследовано 113 клеток, из них для кариотипирования было отобрано 15. Известно, что относительные длины метафазных хромосом равны относительным длинам СК мейотических хромосом на стадии средней пахитены (Moses et al., 1979). Принимая во внимание это положение, а так же то обстоятельство, что хромосома 17является одной из самых маленьких в кариотипе мыши Mus musculus (Nesbitt, Francke, 1973), мы использовали измерения длины СК в сочетании со статистическим анализом для идентификации хромосомы 17.(см.гл.11)
По промерам наиболее соответствующим ее длине, был определен тот СК, который, с определенной вероятностью, может быть отнесен к хромосоме 17 (Табл.8,13).Как видно из Рис.11 и Табл.13, размеры хромосомы 17 в метафазе соматических клеток мало отличаются от размеров хромосомы 16, что затрудняло наш анализ.
Методика обработки экспериментальных данных включала, как важную составляющую часть, математический анализ результатов с использованием теории вероятности и математической статистики. Так, при изучении на фотографиях СК мышей гетерозигота (tx/ ty) была сформулирована и решалась задача по определению вероятностей различных видов взаимодействия (АС, БР, Д Р) СК, входящих в общий набор от № Ідо №19 с Х-У бивалентом. Для большого количества опытов (фотографий) проводилось сопоставление числа ожидаемых по теории вероятности случаев с обнаруженными в опытах. По формулам для нормального закона отклонений показано, что у СК хромосомы 17 контакт( ассоциация) с ХУ-бивалентом имеет четко выраженный неслучайный характер, и наоборот, для других хромосом такие контакты происходят с вероятностью случайных событий.
Область, которую занимает на фотографии весь набор хромосом кариотипа для простоты принимали за круг с диаметром D. Каждый из 19 СК имеет свою характерную длину и в виде вытянутой ( или искривленной) линии расположен внутри указанного круга. Половые биваленты чаще всего представляют в кариотипе сложную фигуру и, как предполагается в анализе, занимают некоторую область, также близкую по форме к кругу с некоторым эквивалентным диаметром. Назовем « событием» наложение (НА-ПБ) или касание (КА-ПБ) XY- бивалента с любым другим СК кариотипа. Считаем, что событие происходит как бы при внесении («вбрасывании») XY-бивалента в область круга диаметром D, где расположены остальные СК. Тогда, если предположить случайный характер расположения каждого СК в области, занимаемой набором всех СК, то вероятность рі того, что («событие») произойдет для какой-то i—ой хромосомы, приближенно может быть определено, как отношение площади Si фигуры Ai к площади Sd круга диаметром D. Здесь фигура Ai образована огибающей окружностей диаметра dxy, касающихся линии і-ой хромосомы. В результате pi оказывается зависящей от длины (и, следовательно, номера) СК хромосомы, и ее средние значения представлены в таблице 14. Для хромосомы 17 значение р 17=S17/SD=0,05. При большом количестве п «опытов» (фотографий) число реализаций М случайного «события» для любой хромосомы должно составлять: М і =рі х п(математическое ожидание). С учетом замечания относительно длин СК хромосом 16-17 для нашего числа фотографий (п =44) имеем: М=0,05 х 2 х 44, т.е. в предположении случайного характера связи с XY- бивалентом среднестатистическое количество ассоциаций для СК- хромосомы 17 при нашем числе исследованных клеток должно составить цифру 4.
Согласно оценке по формулам для нормального закона отклонений (Борель,1972) вероятность того, что случайное «событие» для 17 хромосомы произойдет более, чем в 15 случаях, составляет р 0 ,0000001,т.е. имеет ничтожно малую величину. Число произошедших «событий» в нашем случае состовляет 18, и вероятность реализации такого количества при случайном характере «событий « еще меньше и практически для равна нулю. Это подтверждает неслучайность наблюдаемой в наших опытах ассоциативной связи (контакта) СК хромосомы 17 с XY- бивалентом. С другой стороны, аналогичные оценки подтверждают случайный характер контакта других СК хромосом с XY- бивалентом и количественно объясняют число таких событий (Табл. 14 )
Параметры развития репродуктивной системы
Для сравнительного анализа поведение мейотических хромосом родитель ских видов и гибридных особей с целью изучения возможных цитогенети ческих механизмов стерильности был получен широкий спектр гибридных форм ( Рис.43).Гибридные самки от известных межвидовых скрещиваний Сибирских хомячков Ph.sungorus и Ph.campbell полностью стерильны Гибридные самки имеют значительно редуцированную плодовитость по сравнению с самками от родительских видов ( Васильева, Соколов, 1993). Параметры развития репродуктивной системы
Исходные виды отличаются по массе семенников достоверно у Ph.campbelli и было в 2 раза выше. Масса репродуктивных органов у гибридов от двух вариантов реципрокного скрещивания, F1D и F1R, в целом, значительно ниже таковой Ph.campbelli и Ph.sungorus (Табл.26 ). Так масса семенников и эпидидимиса у F1D соответственно составила: 348.8 + 14.6 и 23.3 + 1.7 мг (отличия от Ph.campbelli: t=14.58, t=l 1.05, Р«0.001; отличия от Ph.sungorus: t=2.46, Р 0.05 и t=4.08, Р 0.001 соответственно). Еще более низкие значения массы репродуктивных органов отмечены у гибридов F1R. Для семенников и эпидидимиса у F1R они соответственно составляют: 92.31 + 16.2 и 10.9 + 2.0 мг (отличия от Ph.campbelli: t=23.66, t=12.64, Р«0.001; отличия от Ph.sungorus: t=l 1.33 и t=8.41, Р«0.001 соответственно). При этом масса репродуктивных органов гибридов F1R значительно ниже таковой и самцов FID (t=11.36 и t=4.72, соответственно для семенников и эпидидимиса, Р«0.001). Интересно отметить, что масса семенников у гибридов ниже при том варианте скрещивания, при котором гибрид получает У-хромосому от Fl Ph.sungorus х Ph.Cambelli. В клеточной суспензии из тканей семенников у гибридов F1D, хотя сперматогонии, сперматоциты и сперматиды заполняли поле зрения микроскопа (как и у самцов исходных видов), встречались лишь единичные сперматозоиды. При просмотре клеточной суспензии из тканей семенников гибридов F1R были обнаружены различия у особей с разной массой семенников. Так, у особей F1R с массой 10-20 мг семенные канальцы были пустыми. У самцов, масса семенников которых находилась в пределах 25-120 мг, в суспензии встречались сперматогонии, сперматоциты, но сперматозоиды полностью отсутствовали. У особей, у которых масса этих органов превышала 120 мг в суспензии присутствовали делящиеся клетки и единичные сперматозоиды, как и у гибридов F1D. На основании полученных данных все самцы F1R были разделены на три класса: "СО" - масса семенников не превышает 25 мг, герминативные клетки полностью отсутствуют; "О" - масса семенников до 120 мг, присутствуют герминативные клетки; и "СП " -масса семенников выше 120 мг, присутствуют единичные сперматозоиды. Все гибриды F1D по этой классификации были отнесены к классу СП (Черепанова, 2001).
При всех вариантах возвратных скрещиваний гибридов первого поколния примерно половина самцов оказывалась стерильной, вторая половина имела показатели репродуктивной системы, сопоставимые с таковыми у родитель-ских видов ( Табл.28) . 3.5.2. Кариотипы исходных видов и гибридов Phodopus Впервые кариологические различия между Pkcampbelli и Ph.sungorus по аутосомам 12-й и 13-й пар и половым хромосомам, были обнаружены Н.Н.Воронцовым с соавторами в 1967 году (Воронцов и др., 1967). Кариотипы родительских видов и гибридного самца F1 (самка Ph.sungorus х самец Ph.campbelli) представлены на (Рис.44,а,б,в). Кариотипы хомячков Ph.campbelli и Ph.sungorus состоят из 13 пар аутосом и половых хромосом, причем хромосомы 1 - 11-й пар у них одинаковы по морфологии (Рис.44. а,б). У обоих видов аутосомы 1 - 5-й пар - крупные метацентрики, 6 - 10-й пары - средние, и аутосомы 11-й пары - мелкие метацентрики. В то же время самые мелкие элементы кариотипа - аутосомы 12-й и 13-й пар -различаются по морфологии. Они представлены акроцентриками у Ph.campbelli( Рис44.а) и метацентриками у Ph.sungorus (Рис44.б).
Впоследствии анализ хромосом Ph.campbelli и Ph.sungorus с использованием методов дифференциальной G-и С-окраски показал, что различия между ними касаются также размеров и локализации гетерохроматовых районов хромосом (Графодатский, Раджабли, 1984).
Различия между Ph.campbelli и Ph.sungorus обнаружены также и в морфологии половых хромосом (Рис.44). X хромосома, шестая по величине в кариотипах обоих видов, представляет собой почти строгий метацентрик у Ph.campbelli и субметацентрик у Ph.sungorus. Y хромосома, являющаяся крупным телоцентриком у обоих видов, у Ph.campbelli превышает по величине длинное, q-плечо, X хромосомы примерно на 10 %, а у Ph.sungorus - на 10 % короче одноименного плеча X хромосомы (Рис.44).
Гибриды F1 Результаты анализа хромосом гибридов F1 (Рис.45 а,б) подтвердили сходство хомячков Ph.campbelli и Ph.sungorus по морфологии и расположению G-полос на аутосомах 1-11-й пар. При изучении кариотипов гибридных самок F1 отчетливо видно различие между метацентрической, происходящей от Ph.campbelli, и субметацентрической, унаследованной от Ph.sungorus, (Рис.45в) X хромосомами: р-плечо метацентрика превосходит по длине таковое субметацентрика, тогда как q-плечи обеих X хромосом одинаковы .(Черепанова, Козловский, 1999)
