Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
1. История изучения полихет Белого моря 10
2. Морфологический очерк спионид 11
3. Краткий обзор по биологии спионид 15
Материал и методы 20
1. Сбор материала 20
2. Промыв и разбор проб 21
3. Фиксация 26
4. Методы морфологических исследований 26
5. Методы молекулярных исследований 30
Результаты 33
1. Местообитание и плотность популяции 33
2. Результаты молекулярных исследований и филогенетический анализ 40
3. Описание внешней морфологии самца и самки , 44
4. Расположение самца на самке, описание зоны контакта 56
5. Описание внутренней морфологии самца и самки
5.1. Кутикула и эпителий 65
5.2. Строение полости тела 72
5.3. Строение мышечной системы 82
5.4. Описание нервной системы и органов чувств самца и самки 96
5.5. Описание кровеносной системы самца и самки 111
5.6. Описание пищеварительной системы самца и самки 111
5.7. Описание половой системы 118
Обсуждение 129
1. Обсуждение таксономического положения Asetocalamyzas laonicola по морфологическим и молекулярным данным 129
3. Особенности биологии карликовых самцов 136
Расположение самцов на самке 136
Зона контакта, 136
Гомология части тела самца, погруженного в самку с другими органами у спионид 136
Положение тела самца 137
Предположения о способе питания карликового самца 141
Первый случай прикрепления и срастания с самкой карликовых самцов у аннелид 141
4.0 неотеническом происхождении карликового паразитического самца 142
Сравнение нервной системы самца и самки 142
Стадия на которой самец прикрепляется к самке 144
5. Жизненный цикл 145
Тип оплодотворения и развитие , 145
Определение пола 147
Местообитание Asetocalamyzas laonicola , 149
6. Первый случай облигатного эктопаразитического образа жизни самца у аннелид 150
Выводы 152
Список цитируемой литературы
- История изучения полихет Белого моря
- Промыв и разбор проб
- Результаты молекулярных исследований и филогенетический анализ
- Обсуждение таксономического положения Asetocalamyzas laonicola по морфологическим и молекулярным данным
Введение к работе
Половой диморфизм - широко распространенное явление в животном мире. В разных группах оно варьирует от различий в цвете и размерах тела до карликовости самцов. У аннелид половой диморфизм в основном выражается в отличие пропорций и размеров тела самца от самки, как у эктопапазитической полихеты Calamyzas amphictenicola из семейства Calamyzidae (Adwidsson, 1932), или отличиях в морфологии. Так в роде Ophryotrocha (Dorvilleidae) самец и самка отличаются по форме и размерам челюстей (Akesson, 1975; Цетлин, 1980; Tzetlin and Purschke, 2005). О. cosmetandra отличается от всех остальных видов сильным половым диморфизмом, который выражен в разнличной форме и степени развития щетинок у самца и самки (Ouge, 1990). У самцов Autolitus могут развиваться головные придатки (Nigren, 2003), как и у глубоководных альвинеллид (Paralvinelta grasslei (Zal et al, 1994; McHuge, 1995; Zhadan et al.,2000)). У глубоководных полипоид отличия самца и самки заключаются в наличии придатков на брюшной стороне и строении пигидия (Jolivet et al., 2000). У Harmotoe imbricata половой диморфизм проявляется только в период размножения и заключается в разном строении нефридиальной папиллы (Daly, 1972; Бритаев и Иванова, 1985). В семействе Spionidae самец и самка, насколько это известно, могут отличаться по расположению жабр, при сохранении примерно одинаковых размеров (Prionospio) (Maciolek, 1984) и строению нухального органа (Pygospio) (McHuge, 1987).
Случаи паразитирования самцов на самках относительно редки. Еще реже встречаются виды, у которых карликовые самцы не только паразитируют, но и неподвижно закреплены на самках. Подобные примеры известны для рыб (10 родов из 5 семейств у глубоководных удильщиков (Sheldlock at al., 2004)), у которых самец срастается с самкой на тканевом уровне так, что невозможно отделить одну особь от другой. (Munk, 2000). Среди беспозвоночных известен единственный случай настоящего срастания тканей у моногенеи Diplozoon paradoxum (Monogenoidea), паразитирующих на жабрах пресноводных карповых рыб (Догель, 1981). Однако в этом случае имеет место срастание двух гермафродитных особей. Карликовые самцы, как крайний случай проявления полового диморфизма, редко встречаются у аннелид, известны для некоторых мизостомид, сибоглинид, динофилид и эхиурид. Большинство Myzostomida являются протерандрическими гермафродитами. Жизненный цикл проходит сначала через функциональную мужскую стадию, потом гермафродитную, далее у некоторых видов женскую стадию. Оплодотворение происходит через перенос сперматофора от одной особи к другой (Grygier, 2000). В некоторых семействах развивается половой диморфизм. Виды рода Myzostoma имеют довольно крупную самку с небольшим хоботком и мелкого самца без маргинальных цирр. В семействе Pulvinomyzostomatidae, с одним видом Pulvinomyzostomum pulvinar, паразитом криноид, небольшой самец обитает на самке или около рта хозяина, если нет поблизости самки. Переход от стадии самца к самке происходит при отсутствии самки. При этом модифицируется вентральная часть тела, ротовое отверстие передвигается на дорсальную сторону. Хоботок формируется, как возвышение стенки тела, дающей начало ротовой полости, становится вытянутой как папилла (Craff, 1877; Eeckhaut and Jangoux, 1992).
У мелких Siboglinidae (Polychaeta, Annelida) из рода Osedax образующих плотные популяции на костях скелетов китов, лежащих на дне, в трубке свободноживущей самки может быть до 111 карликовых (паразитических или симбиотических) самцов. Самцы гораздо мельче самки, устроены как типичная трохофора Siboglinidae, они забиты развивающимися спермиями и довольно часто имеют капли желтка (Rouse et al., 2004).
Интерстициальные Dinophilus gyrociliatus (Polychaeta, Dinophilidae) также имеют карликового самца. Самка D. gyrociliatus откладывает в яйцевой кокон 4 ооцита. Три, из которых крупные и являются будущими самками, а один мелкий, из которого вылупляется карликовый самец. Он представляет собой трохофору с совокупительным органом и семенным мешком, забитым сперматозоидами. Этот самец оплодотворяет эмбрионы самок, после чего погибает, не выходя из кладки (Westheide,1990).
Самцы Bonellidae (Annelida, Echiurida) являются полу паразитическими или полностью паразитическими, с частично редуцированными органами. Турбеляриеподобные с ресничной эктодермой, с одним, за редким исключением двумя нефридиями, которые являются семенными мешками (Schuchert, Rieger, 1990). Как правило, самцы живут на самке или внутри самки, в кишке, в нефридиях, на задней части хобота, в специальном слепом выросте или андроцее, открывающемся между двумя нефридиями. Самцы бонеллии полностью покрыты ресничками, что является неотенической чертой (Fisher 1946).
Таким образом, у Osedax, Dinophilus и у Bonellidae, паразитические самцы имеют упрощенную организацию с сохранением неотенических признаков. Карликовые самцы представляют собой несегментированные формы, по уровню организации соответствующие трохофорной личинке, типичной для полихет, не питающейся самостоятельно.
Однако ни один случай наличия карликовых, облигатно - эктопаразитических самцов не описан для полихет и для каких-либо близких таксонов аннелид. Среди беспозвоночных не обнаруживается тесного взаимодействия между разнополыми особями.
Поскольку срастание самца с самкой и облигатный эктопаразитизм карликового самца явления неизвестные не только для аннелид, но и для беспозвоночных животных в целом, то случай Asetocalamyzas laonicola вызывает особый интерес и определяет актуальность работы.
A. laonicola Tzetlin 1985, облигатная эктопаразитическая полихета была описана по единственному экземпляру, найденному на крупной спиониде, идентифицированной как Laonice cirrata в сублиторали Кандалакшского залива Белого моря. Род Asetocalamyzas Tzetlin, 1985 в первоописании относится к семейству Calamyzidae (Hartman-Schroder 1971). Помимо Asetocalamyzas к этому семейству относится еще один представитель монотипического рода Calamyzas — С amphictenicola Arwidsson, 1932. Это полихета, паразитирующая на жабрах Amphicteus gunneri fArwidsson, 1932) В связи с недостатком ярко выраженных внешних морфологических признаков A. laonicola существовала вероятность того, что эта форма является представителем другого, возможно, еще не описанного таксона аннелид.
С 2001 года по 2006 годы в окрестностях Беломорской биостанции МГУ (типовая местность) было поймано 36 экземпляров A. laonicola.
Предварительные исследования и наблюдения показали что: 1) Степень заражения паразитами хозяев составляет 100 % 2) Все хозяева являются самками и все паразиты - самцами.
Эти исследования позволили предположить альтернативную гипотезу о том, что A. laonicola представляют собой карликовых паразитических самцов, обитающих на теле самок - спионид.
Цели и задачи
Целью данной работы является исследование морфологии и биологии А. laonicola, а также определение таксономического положения в системе аннелид. В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:
• Проведение молекулярно-филогенетических исследований и анализ их данных: исследование последовательности гена цитохромоксидазы (COI), ITS1 участка, 18 sRN А.
• Изучение внутренней и внешней морфологии и ультратонкого строения различных систем органов паразитических особей и хозяев: кутикулы и покровного эпителия, выстилки целомической полости, анатомии и ультратонкого строения мышечной системы, анатомии и ультратонкого строения пищеварительной системы, морфологии нервной систем.
• Изучение зоны контакта и места срастания для определения характера взаимоотношений паразитов и хозяев и способа питания паразита.
• Определение таксономического положения A. laonicola.
• Изучение местообитания и биологии A. laonicola. Научная новизна
• Основываясь на данных сравнительного анализа расшифрованных последовательностей генома A. laonicola (цитохром оксидаза (COI), ITS1 участка и 18 sRNA) показано, что облигатный эктопаразит A. laonicola, описанный ранее как представитель семейства Calamyzidae, относится к тому же виду, что и хозяин и является карликовым самцом.
• Анализ 18 sRNA у A. laonicola подтверждает принадлежность этого вида к сем. Spionidae и его близость к роду Scolelepis.
• Изучена внешняя морфология самки Asetocalamyzas. Основываясь на этих исследованиях определено таксономическое положение A, laonicola в сем. Spionidae. Род Asetocalamyzas перенесен из семейства Calamyzidae в семейство Spionidae.
• На основании данных о внутренней морфологии подтверждена принадлежность карликового паразитического самеца A. laonicola (имеет целый ряд признаков, которые подтверждают его принадлежность) к сем. Spionidae.
• Впервые исследованы нервная и мышечная системы A. laonicola. В результате созданы полные трехмерные реконструкции строения этих систем карликового паразитического самца.
• Дан анализ организации карликовых паразитических самцов A. laonicola, который позволил высказать гипотезу о неотенической природе самца и характере жизненного цикла.
• Впервые, не только для аннелид, но и для всех беспозвоночных животных, описан облигатный эктопаразитический карликовый самец, срастающийся с телом самки. Анализ электронно-микроскопических данных о строении зоны контакта позволил высказать гипотезы о механизме питания паразитической особи.
Апробация результатов диссертации
Результаты работы были представлены на VIII международной конференции по Polychaeta (Испания, 2004), на VIII научной конференции Беломорской Биологической станции 2003, на всероссийской конференции «Проблемы эволюционной морфологии» памяти академика А.В.Иванова (Санкт-Петербург, 2006), на заседании кафедры зоологии беспозвоночных, МГУ, Биологический факультет (2006).
Публикации
По теме диссертации подготовлено пять работ, опубликовано 2 тезисов и 1 статья, 1 статья и 1 тезисы в печати.
Благодарности
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю профессору А. Б. Цетлину за моральную поддержку и помощь на всех этапах выполнения работы. Автор признателен кафедре Зоологии беспозвоночных за возможность проведения настоящей работы заботу и внимание на всех этапах обучения в аспирантуре. Заведующему лабораторией электронной микроскопии Биологического факультета Г.Н. Давидовичу и всем сотрудникам этой лаборатории за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований, заведующему лаборатории электронной микроскопии в ИБР РАН Д. В. Гуляеву и сотруднику этой же лаборатории Е. Цитрину за предоставление рабочего места и необходимых реактивов, а также помощь при исследовании нервной и мышечной систем с помощью лазерного сканирующего микроскопа. Заведующему лабораторией ИБР РАН Н. С. Мюге за руководство и участие в проведении и анализе данных по сиквенированию COI и 18 s RNA. Сотруднику ВНИРО А. Волкову за поддержку и подготовку детального проекта проведения молекулярных исследований. Автор благодарен профессору Г. Пуршке (G. Purschke, г. Оснабрюкк, Германия) за участие в проведении молекулярно-филогенетического анализа ITS1 участка. В. О. Мокиевскому за помощь в анализе количественных данных по описанию местообитания. Автор выражает благодарность коллегам, которые помогали на разных этапах. А. Э. Жадан за помощь в ультраструктурных и морфологических исследованиях. А. Б. Цетлину, А. Э. Жадан, П. В. Рыбникову, И. А. Косевичу, Г. А. Колбасову, К. А. Соловьеву, И. Кронбергу, О. Савинкину, Т. А. Бритаеву, А. Д. Дмитриеву за помощь в поиске Asetocalamyzas и добыче проб Asetocalamyzas. Н. Будаевой, С. Пятаевой, Е. Синевой, В. Мариночевой, Т. Лощининой, В. Бритаевой, М. Плющевой за помощь при разборке проб. Автор благодарен команде судна Картеш за моральную поддержку и помощь в водолазных работах. Исследования были поддержаны Российским Фондом Фундаментальных Исследований, грант № 040448785.
История изучения полихет Белого моря
Изучение фауны полихет в Белом море началось 130 лет назад (Цетлин, 1981). Начало было положено в 1870 году в работе В. Иверсена, в течение последующих 50 лет список видов вырос с 47 до 108 (Загс, 1923; Дерюгин, 1928). В дальнейшем изучение полихет Белого моря сосредоточилось на исследовании фауны отдельных районов. К 1963 году видовой список полихет увеличился до 135 (Цетлин, 1981). В 1981 году сведения о полихетах Белого моря содержались более чем в 40 работах. В период с 1972 до 1976 на судне СЧС 2032 была выполнена обширная качественная и количественная бентосная съемка Двинского и Кандалакшского заливов, а также бассейна Белого моря. Результаты исследования видового разнообразия и распределения полихет этих районов представлены в работе Цеглина (1981). Всего было обработано 291 качественных и 405 количественных проб с 272 станций. Начиная с 1982 года и по настоящее время, были подробно изучены полихеты окрестностей ББС МГУ - сбор качественных проб проводился на литорали и сублиторали в Ругозерской губе, Великой Салме, Кислой, Чернореченской губах и Нильма-губе. Общее число видов полихет к 1981 году составляло 152 вида (Цетлин, 1981). С 1987 по 1996 год в рамках программы по исследованию интерстициальной фауны белого моря, был проведен сбор проб в окрестностях ББС, в результате чего видовой состав полихет пополнился еще на 4 вида (Цетлин, Сафонов, 2002). В течение последних 10 лет продолжалось изучение разнообразия и распределения полихет в районе Великой Салмы. В рамках ежегодной студенческой практики студентов 4 курса кафедры зоологии беспозвоночных, начиная с 1998, проводилась бентосная съемка в районе Великой Салмы и окрестностей беломорской биостанции МГУ, включая пролив напротив биостанции, пролив Черная Салма, между материком и островом Оленевский, в районе Крестовых островов до Киндо - мыса и Лобанихи. В общей сложности было обработано более 100 качественных проб и 107 количественных проб с 27 станций (отчеты о практике 4-го курса, кафедры Зоология беспозвоночных Биологического факультета МГУ). Количество видов полихет в окрестностях ББС в результате этих исследований достигло 124 видов (синопсис окрестностей биостанции МГУ, неопубликованные данные).
Первая находка A. laonicola была отмечена в 1985 году в районе Беломорской Биологической станции - в заиленной сублиторали (Цеглин, 1985). Не смотря на проведение масштабных работ по изучению донных биотопов в районе Великой Салмы, за последние десятилетия поселения Л, laonicola не были обнаружены в ближайших окрестностях ББС МГУ.
Spionidae Белого моря
В Белом море спиониды распространены повсеместно на смешанных грунтах, всего известно 8 видов из 6 родов {Laonice Malmgren 1867, Microspio Mesnil 1896, Polydora Bosc 1802, Prionospio Malmgren 1867, Pygospio Claparede 1863, Spio Fabricius 1785) (синопсис окрестностей биостанции МГУ, неопубликованные данные).
Основной признак полихет, объединенных в группу спиониды - это наличие пары головных придатков - пальп. Головная лопасть сформирована из простомиума и перистомиума, форма простомиума, как правило, вытянутая, располагается над перистомиумом. Окончание простомиума может быть округлым или заостренным, задняя часть заканчиватся свободной частью - карункулом, который во многих таксонах несет затылочную папиллу. На средней части простомиума обнаружено от одной до двух пар глаз. Удлиненные нухальные органы берут начало от задней части простомиума (Fauchald and Rouse, 1997).
Тело отчетливо не разделено на отделы, может маркироваться только разной формой параподий, содержанием щетинок и распределением жабр. Граница между первым сегментом и простомиумом часто плохо различима. Первая параподия двуветвистая, однако, в некоторых родах может отсутствовать пучок нотоподиальных щетинок. Обычно параподий имеют послещитинковую ното - и невроподиальные лопасти. Жабры есть у всех спионид за исключением Spiophanes, обычно начинаются со 2 сегмента, редко с первого, при этом жабра отделена от параподий, иногда срастается с нотоподиальной послещетинковой лопастью. Жабры имеют разную форму, от уплощенной до пальцевидной. Жабры могут располагаться на протяжении всего тела, как у Scoletepis и Malacoceros или присутствовать в первой половине тела, как у Prionispio. У спионид обнаружено большое разнообразие щетинок. Нотохеты и неврохеты могут нести как простые, так и составные капиллярные щетинки, также присутствуют крючковидные капюшонированные щетинки. Капиллярные щетинки найдены на протяжении всего тела, в то время как кргочковидные не были обнаружены в передних сегментах (Rouse and Plijel, 2000). Между нотоподией и невроподией располагается латеральный ресничный орган, характерный для всех спионид. Анальная лопасть может нести придатки или лишена таковых (Fauchald and Rouse, 1997).
Обзор некоторых черт внутренней морфологии Данных по внутренней морфологии спионид довольно много. Первые работы по анатомии спионид были сделаны в конце 19 столетия (Rouse and Plijel, 2001). Хорошо изучены пищедобывательный аппарат, строение центральной нервной системы и строение мускулатуры некоторых представителей семейства. Детально изучено строение гамет и оплодотворение.
Промыв и разбор проб
Для предотвращения гибели животных промыв проб производили в день взятия проб в морской воде с помощью промывалки с мельничным газом с ячеей 500 мкм. При разборе количественных проб, изымали всех животных. Разбор проб и определение животных до уровня семейства проводили на месте с помощью бинокуляра (МБС 10). Использовали определители: Гаевская, 1964; Жирков, 2001; Ушаков, 1955; Цетлин, 1980; Моллюски Белого моря, 1984; Гурьянова, 1951.
Дальнейшая обработка количественных проб проходила в лабораториях Биологического факультета МГУ, где животные были определены до вида, подсчитано количество особей, а также измерена биомасса с помощью электронных весов MW 120 точностью до 0,01 г.
В сезоны 2004 - 2005 годов пробы промывали другим способом. Ящик с грунтом помещался в емкость со свежей морской водой гораздо большего объема. После чего в емкость нагнетали воду, образуя тем самым постоянный поток чистой морской воды. По мере вымывания мелкой фракции осадка, вручную выбирали крупные камни, тем самым, уменьшая вероятность перетирания животных. После чего животных, оставшихся в средней фракции (песке) выбирали на кювете.
Прижизненные наблюдения
Прижизненные наблюдения проводили в небольшом морском аквариуме. При этом червей помещали в специальный узкий аквариум и наблюдали в течение 3 дней. Фото и видеосъемку проводили с помощью стереомикроскопа МБС-10 с фото или видео-приставкой.
Для гистологических работ животных фиксировали 4% формалином на морской воде в течение суток, затем после промывки пресной водой переводили в 70 % этанол.
Для исследований с помощью трансмиссионного электронной микроскопии самцов и самок фиксировали 2,5%-ным раствором глутарового альдегида на какодилатном буфере с добавлением хлористого натрия, с последующей постфиксацией 1.0 % раствором Os04 на том же буфере.
Для проведения молекулярных исследований особи Asetocalamyzas laonicola фиксировали в 96 % спирте. С одной сменой через пять - шесть часов.
Для исследования мышечной и нервной систем паразита Asetocalamyzas laonicola с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа необходимо сначала отделить паразита от хозяина. Перед этим живых расслабляли в растворе 7, 12 % MgC12 в течение 20 - 30 минут. После этого самцов отделяли от самок с частью тела хозяина, в котором располагалась глотка паразита. Фиксация проводилась в растворе 4% параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере (PBS) (рН= 7,4) в течение 12 часов при 4 С.
После фиксации Asetocalamyzas laonicola промывали 0,1 М PBS с добавлением NaN3 (0,05%) и Тритон Х100 (0,5 %) в 3 смены по 10- 20 мин. Хранили особей в 0,1 М PBS с добавлением NaN3 (1%) и Тритон Х100 (0,5 %).
4. Методы морфологических исследований Исследования морфологии проводилось с помощью ТЭМ, СЭМ, LSM технологий, изучение внутренней морфологии с помощью гистологических методов.
Каждая особь была исследована с помощью стереомикроскопа МБС 10, измерена и сфотографирована, снята с помощью фото- и видеоаппаратуры Olympus SZX 9. Данные по изучению паразитов и хозяев представлены в таблице 3.
Для исследования внешней анатомии паразитов и их хозяев изучали и фотографировали под бинокуляром (Olympus SZX 9 с фотоприставкой Olympus СЗО-30). Для выяснения таксономического положения хозяина было исследовано 256 особей Laonice cirrata, предоставленные Зоологическим музеем (пробы из Кольского залива 1995, НТС «Помор» 1983), а также Биологическим факультетом МГУ (пробы из бассейна Белого моря, рейсы Э/С Профессор Зенкевич, 1974 и 1975 годов). Кроме того, под бинокуляром были исследованы голотип и паратип Seolelepis matsugae, любезно предоставленные А. В. Сикорским. Для сравнения фарингеальных структур хозяина с другими особями было исследовано 2 особи Spio armata с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Для изучения деталей внешнего строения, покровов паразита и хозяина и других полихет, часть экземпляров были проведены по восходящему ряду спиртов до ацетона, высушены методом критической точки, размещены на предметном столике и после напыления платино-палладиевым сплавом изучены с помощью сканирующего электронного микроскопа Hitachi 400 А.
Для изучения гистологического строения паразита и хозяина, зафиксированные 70 % этанолом экземпляры были проведены по восходящему ряду спиртов до бутанола 80%- 82%+бутанол (3:1)- 96%+бутанол (1:1)- 100%+ бутанол (1:3)-бутанол- бутанол, в каждый раствор объект помещался на 10-15 минут. После проводки обезвоженные экземпляры помещались в парапласт. Пропитка проводилась в термостате при 60 градусах в двух сменах парапласта по 30 минут, после чего объект помещали в заливочный парапласт.
Срезы толщиной 8 мкм были сделаны при помощи микротома МРТУ42. В дальнейшем срезы наклеивались на стекла при помощи белка и были окрашены гематоксилином Караччи. Для этого срезы проводились через ксилол и по нисходящей концентрации спиртов до воды, содержались в красителе около 5- 7 минут. Интенсивность окраски контролировалась под микроскопом. Затем срезы промывались в воде и обезвоживались по восходящей проводке. Восходящая проводка состояла из 70% спирта, 96% спирта, смеси 96% спирта и бутанола (1:1), бутанола, смеси бутанола и ксилола (1:1), смеси карбола и ксилола (1:1), ксилола. В каждом веществе стекло с наклеенными срезами, держалось по 2 минуты. Затем срез заключали в канадский бальзам и накрывали покровным стеклом.
Всего было сделано 4 серии поперечных и 6 серий сагиттальных серий гистологических срезов паразита и свободноживущей особи, 2 серии сагиттальных и 1 серия поперечных полутонких срезов паразита, одна серия полутонких поперечных и одна сагиттальных срезов свободноживущей особи в районе ооцитов.
Гистологические срезы изучали на световом уровне при помощи микроскопа.
Для получения серий полутонких и ультратонких срезов объекты, зафиксированные глутаральдегидом и постфиксированные осмием, проведены по восходящему ряду спиртов до ацетона и залиты в смолу Ероп 812. С объектов, залитых в эпон, были сделаны серии полутонких срезов толщиной 2 мкм - на ультрамикротоме DUPONT МТ-5000 - стеклянными ножами и ультратонкие срезы на ультрамикротоме LKB V алмазным ножом. Полутонкие срезы были окрашены толуидиновым синим, ультратонкие - уранилацетатом и цитратом свинца по стандартной методике.
Результаты молекулярных исследований и филогенетический анализ
Было исследовано три участка генома паразитической и свободноживущей особи. Ген цитохромоксидазы (COI), участок ITS1 и 18S РНК. Внешняя морфология паразитической и свободноживущей форм сильно разнятся, поэтому изначально предполагалось, что червь-хозяин и находящаяся на ней паразитическая особь относятся к разным семействам полихет, свободноживущая к Spionidae, паразитическая к Calamyzidae. Для выяснения степени родства паразитической и свободноживущей особи были проведены молекулярные исследования митохондриального гена цитохромоксидазы (COI).
Результаты исследования COI
Был проанализирован фрагмент гена COI у одной пары паразит-хозяин (особи female 1 и malel). Поскольку этот ген имеет высокую степень мутаций, то он наиболее подходит для выяснения близкородственных связей. Последовательность у обоих экземпляров оказалась идентичной. Это означает, что хозяин и паразит относятся к одному виду, исходя их этого факта, можно высказать две гипотезы о природе карликовых паразитических самцов:
1. Паразит - это карликовый самец, прикрепляющийся к самке на каком-то из этапов жизненного цикла;
2. Паразит является «генеративной почкой», и образуется как вырост тела хозяина.
В первом случае следовало ожидать различия в последовательностях ДНК между обеими особями. Если же окажется верным второе предположение, то самец и самка будут всегда генетически идентичными (как результат вегетативного происхождения паразита), а отличия в последовательностях будут наблюдаться между различными парами.
Дополнительный анализ гена COI у пяти особей (три хозяина и два паразита) позволил выявить пару (female 2, male 2), в которой самец и самка отличались на одну замену из 650 п.н. (приложение 1 (приложения)), последовательность у остальных особей оказалась идентичной (рис 5).
Результаты исследований ITS
Дополнительно был проанализирован участок ITS1 ядерного генома у одной пары, и были также выявлена одна замена нуклеотида в проанализированных последовательностях паразита и хозяина (приложение 2 (приложения)).
Поскольку последовательности ДНК у обеих особей отличается, то можно однозначно отвергнуть гипотезу о происхождении паразита как «генеративной почки» хозяина. Таким образом, на основании молекулярных данных нами показано, что паразит является карликовым самцом, и у этого вида наблюдается нормальное половое размножение, типичное для большинства полихет. Крайне низкий уровень генетического полиморфизма (у шести из семи изученных особей последовательность участка гена COI оказалась идентичной) может указывать на низкий эффективный размер популяции и высокую степень инбридинга.
Результаты молекулярных исследований 18S РНК
Выяснения филогенетических взаимоотношений на уровне семейства производится по данным 18S РНК. По результатам молекулярных исследований 18S РНК обе особи (паразит - хозяин) совпадают полностью, что подтверждает гипотезу о близком родстве. На основании полученных нами молекулярных данных и данных по другим видам полихет, взятых из ген банка, было построено филогенетическое дерево (рис 6). В данном дереве Asetocalamyzas laonicola однозначно попадает в семейство спионид и является близким родственником Scolelepis squamata.
Таким образом, описанный как паразит, Asetocalamyzas laonicola является карликовым самцом, при этом самец и самка относятся к семейству спиониды и близки к роду Scolelepis.
3. Описание внешней морфологии самца и самки Поскольку молекулярные данные подтвердили гипотезу о эктопаразитическом самце, то возникла необходимость подготовки нового диагноза вида и более точного описании внешней морфологии самца и самки. Диагноз Род Asetocalamyzas Tzetlin, 1985
Простомиум округлый, трехдольчатый, вытянутый в карункул. Затылочная папилла присутствует. Перистомиум хорошо развит, латеральные крылья присутствуют. Жабры развиты со 2 сегмента и заканчиваются на середине тела. Жабра полностью срастается с нотоподиальнои лопастью. Щетинки на передних сегментах капиллярные, в нотоподиях и в невроподиях присутствуют капюшонированные крючковидные щетинки, которые имеют один основной зуб и два апикальных. Пигидий дисковидный, лишенный придатков.
Есть сильный половой диморфизм. Самка крупная, свободноживущая, эктопаразитический самец олигомерный, прикрепленный с дорсальной стороны самки.
Род представлен одним видом Asetocalamyzas laonicola Tzetlin, 1985. Поскольку голотип этого вида хранится в виде серии срезов в Зоологическом музее, то мы выделили неотип Дифференциальный диагноз рода
Asetocalamyzas обнаруживает сходство с родом Scolelepis, в отличае от этого рода Asetocalamyzas имеет округлый простомиум, хорошо развитую затылочную папиллу, жабры полностью срастаются с нотоподиальнои лопастью, на пигидии нет придатков. Asetocalamyzas laonicola Tzetlin, 1985 Исследованный материал. 28 особей самки и 36 самцов, Белое море, Кандалакшский залив, 66 34 N, 33 08 Е , 20 м, неотип в Зоолог. Музей, 96 спирт.
Обсуждение таксономического положения Asetocalamyzas laonicola по морфологическим и молекулярным данным
По результатам молекулярных исследований COI, ITS участков генома показано (см глава 2 результаты), что паразитические особи принадлежат к тому же виду что и хозяева и являются карликовыми самцами этого вида. Внешняя морфология самок и самцов очень сильно отличается, поэтому неудивительно, что изначально их описали как животных из разных семейств (Цетлин, 1985). По внешней морфологии самка, несомненно, является представителем сем. Spionidae. Внешняя морфология самца столь бедна признаками, что отнести этих животных к какому либо определенному таксону полихет весьма затруднительно (у самцов отсутствуют какие-либо придатки на головном конце, а также жабры, щетинки, подиальные усики и пр.). Поэтому возник вопрос: насколько близки внутренняя морфология самца и самки?
Наши исследования показали, что на микроанатомическом и ультраструктурном уровнях самцы и самки A.laonicola демонстрируют целый ряд сходных признаков, что подтверждает данные молекулярно-генетического анализа. Кутикула и покровный эпителий
Кутикула самца и самки обнаруживает несомненное сходство. У обеих особей в кутикуле можно выделить эпикутикулу, которая образована электронно-плотными гранулами, и хорошо развитую базикутикулу, в которой в свою очередь можно выделить два слоя. Также у обеих особей всю кутикулу пронизывают микровилли. Однако слои кутикулы самца выражены более четко, чем у самки. У самца иногда неотчетливо проявляется третий слой, лишенный коллагеновых волокон, что не отмечено для самки. Не смотря на некоторые отличия, строение кутикулы подтверждает видовое родство паразитического самца и самки. Особенно ярко это сходство проявляется в месте перехода кутикулы самца в кутикулу самки (рис 15 G).
Небольшое количество данных по ультратонкому строению покровного эпителия самки не позволяет детально сравнить его с покровным эпителием самца. Можно отметить лишь, что у самца не было обнаружено железистых клеток в эпителии, в то время как у самок с вентральной стороны имеется довольно крупные железистые клетки, которые играют большую роль при построении стенок трубки. Мышечная система
Сегментарные мышцы
Мускулатура самца и самки в полной мере отвечает общему плану строения мышечной системы полихет. Несмотря на неподвижный образ жизни, мышечная система паразитического самца хорошо развита и имеет ряд схожих черт с другими спионидами (Filippowa et all, 2005). Так же как и у Prionospio cirrifera хорошо развиты четыре продольных валика, кроме того, имеется парамедиальные продольные и косые одиночные мышечные тяжи. Нет полной кольцевой мускулатуры (Филиппова, 2004).
Отличия между двумя видами коснулись строения параподиального комплекса мышц, очевидно, что параподии P. cirrifera развиты лучше, чем у самца A. laonicola.
Сильные отличия в образе жизни самки и самца отражаются на развитии мускулатуры. Не смотря на это, в строении мышечной системы обнаруживается довольно много общих черт. Как у самца, так и у самки хорошо развиты и одинаково расположены валики продольной мускулатуры. Трансверсальные элементы подстилают продольную мускулатуру с вентральной стороны. Также имеются косые элементы, которые соединяют продольные дорсальный и вентральный валики. Также как у самца, так и у самки развит целомический миоэпителий, покрывающий кишку с поперечно расположенными филаментами, также отмечены мышечные волокна в брюшном мезентерии.
Наибольшие отличия коснулись строения параподиального комплекса мышц и передней части тела (глава 4 результаты). Параподиальный комплекс развит лучше у самки за счет подвижного образа жизни, так для самки характерно два пучка мышц, идущие к ното- и невроподии. Для самца характерно два пучка мышц, отходящих от вентральной стороны к вершине параподии.
У самки наблюдается явное разделение на переднюю и заднюю части тела, чего нет у самца. Отсутствие разделения может быть связано с паразитическим образом жизни и олигомерностью самца.
Ультраструктура. В ультратонком строении продольных мышечных валиков самца и самки также можно отметить некоторое сходство. Так продольные валики у обеих особей состоят из одного ряда миоцитов. У косоисчерченных миоцитов как у самца так и самки циркомиарное расположение филаментов. Однако у самца отмечено два типа строения валиков. Миоциты своей базальной частью прикрепляются, либо непосредственно к базальной мембране, либо к поперечным элементам мускулатуры. При этом обширная саркоплазматическая часть вдается в полость тела, образуя выстилку целома самца. В другом случае эиптелий имеет более стратифицированную структуру, саркоплазматическая часть миоцитов не так хорошо развита, а выстилку полости образуют клетки, лишенные миофиламентов, в определенной части, которые также прикрепляются к базальной мембране, а своей апикальной частью покрывают валик. У самки валик продольной мускулатуры имеет похожее строение, что и у самца, при этом отмечен второй тип строения миоэпителия. Оба типа миоэпителия также отмечены для некоторых спионид (Bartoelomeus, 1994).
Полость тела самца и самки устроена сходно: имеются полости сегментов, разделенные диссепиментами и мезентериями. Между базальной мембраной мезентерия проходят крупные брюшной и спинной кровеносные сосуды, а в диссепиментах сегментарные кольцевые кровеносные сосуды.
План строения кровеносной системы самца и самки одинаков, но есть некоторые отличия, так у самца лучше развит околокишечный синус, в то время как у самки можно отметить кровеносные сосуды лишь в некоторых участках. Кровяных элементов не обнаружено ни у самца, ни у самки.
