Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Процесс культивирования микроорганизмов 9
1.2. Микробиологическое производство белка а2-интерферона 14
1.2.1. Пути развития и современное состояние производства 14
1.2.2. Фармакологические свойства 17
1.3. Моделирование кинетики процессов периодической ферментации, протекающих в биохимических реакторах 23
1.4. Массообмен в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией 29
1.5. Масштабирование биохимических реакторов 35
1.6. CFD-моделирование гидродинамики биохимических реакторов 40
Постановка задачи 48
2. Экспериментальные исследования 49
2.1. Материалы и методы 52,
2.1.1. Характеристика микроорганизмов 52
2.1.2. Аналитические методы измерения параметров культивирования 53
2.1.3. Эксперименты в колбах 55
2.1.4. Культивирование в лабораторном ферментёре Electrolux объёмом 15 литров 56
2.1.5. Исследование потребления компонентов питательной среды. 60
2.2. Результаты и их обсуждение 63
2.2.1 Эксперименты в колбах 64
2.2.2. Культивирование в лабораторном ферментёре Electrolux объёмом 15 литров 68
2.2.3. Результаты аминокислотного анализа питательной среды 73
3. Анализ экспериментальных данных методами статистики и методика масштабирования 80
3.1. Методика масштабного перехода и моделирования 80
3.2. Статистическая обработка полученных результатов 82
3.2.1. Расчет коэффициентов уравнения регрессии 84
3.2.2. Дисперсия воспроизводимости процесса 85
3.2.3. Определение значимости коэффициентов регрессии 86
3.2.4. Проверка адекватности математической модели 88
3.2.5. Поверхность отклика 88
3.3. Определение дыхательного коэффициента (RQ) с помощью газового масс-спектрометра ProLine 2000(E) 89
3.4. Расчёт коэффициента массопередачи (kLa) 96
3.5. Оценка оптимальных условий проведения процесса культивирования в 70 и 300 литровом биохимических реакторах 98
3.6. Масштабирование с использованием коэффициента массопередачи по кислороду 103
3.7. Культивирование в аппарате объёмом 70 литров Ю5
4. Математическое моделирование процессов гидродинамики в биохимическом реакторе и создание кинетической модели процесса ИЗ
4.1. Моделирование гидродинамики процесса ИЗ
4.1.1. Моделирование гидродинамики исследуемых биохимических реакторов с использованием программного пакета Fluent 113
4.1.2. Результаты расчёта уравнений модели 124
4.2. Разработка математической модели процесса культивирования... 126
Выводы по работе 135
Библиографический список
- Микробиологическое производство белка а2-интерферона
- Аналитические методы измерения параметров культивирования
- Статистическая обработка полученных результатов
- Моделирование гидродинамики исследуемых биохимических реакторов с использованием программного пакета Fluent
Введение к работе
В настоящее время биотехнология всё активнее замещает химическое производство: это получение химических соединений, лекарственных веществ, новых видов топлив, решение экологических проблем. Биотехнологические процессы составляют 40% химико-фармацевтического производства, и этот процент растёт за счёт создания последнего поколения лекарственных препаратов на основе белков. Таким образом, представляется актуальным развитие и дополнение существующих методик расчёта и масштабирования биохимических реакторов с учётом возможностей нового аналитического оборудования и вычислительных мощностей компьютеров.
Развитие биотехнологии в области производства препаратов медицинского назначения на сегодняшний день достигло больших успехов. Получение большинства антибиотиков, ферментов, гормонов для химико-фармацевтической промышленности осуществляется биотехнологическим способом. Переход от химического синтеза к биологическому позволил сократить количество вредных веществ, выделяемых в атмосферу, снизил энерго- и ресурсозатраты, уменьшил общий цикл производства. Всё это позволило биотехнологии выделиться в отдельное направление в химико-фармацевтической отрасли и занять лидирующее место.
В связи с бурным развитием таких наук как генетика, молекулярная биологии и биотехнология, человек смог больше узнать о структуре и внутреннем устройстве живых клеток. Создание нового направления в фармацевтической промышленности - генетической инженерии стало возможным благодаря разработке методов изменения генетического аппарата клеток, позволяющих вводить в них чужеродные гены, клонировать их, экспрессировать и получать биосинтетические белки в необходимом количестве. Результатом развития учений об изменении генетической информации организмов стало обеспечение здравоохранения современными терапевтическими вакцинами, интерферонами, колониестимулирующими факторами и многими другими лекарственными препаратами.
В качестве объекта для исследования механизмов накопления белков в клетках, а также для осуществления масштабного перехода был выбран процесс синтеза рекомбинантного человеческого а2-интерферона клетками, получаемый методами генной инженерии из бактериальных клеток Escherichia coli. Для изучения процесса культивирования, оптимизации параметров ведения процесса и последующего переноса технологии в промышленность был использован системный подход, позволивший связать разработку новой технологии с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов в различных объёмах и определить пути активного воздействия на процесс с развитием методики масштабирования, т.е. определить связи между явлениями, происходящими на разных уровнях иерархии.
Спектр заболеваний, при которых назначают препараты интерферонов, достаточно большой. Универсальность и безопасность данных лекарственных средств обеспечили интерферонам прочное место на рынке фармацевтических препаратов. В России большое количество таких лекарственных средств представлено исключительно образцами иностранного производства, что, зачастую, делает эти препараты недоступными для широкого круга пациентов, поэтому разработка и создание более дешёвых и доступных отечественных генно-инженерных препаратов на основе интерферонов носит не только научно-прикладной, но и стратегический характер в масштабах всей страны. Осуществление масштабного перехода технологии культивирования с лабораторных установок на аппараты промышленных объёмов позволит в кратчайшие сроки наладить производство собственных препаратов на основе рекомбинантных белков. Использование методов математического моделирования не только ускорит решение задачи проектирования производства, но и позволит оптимизировать работу действующих установок.
Диссертационная работа представлена в четырёх главах и посвящена моделированию и разработке промышленной технологии культивирования прокариотических штаммов-продуцентов на примере культивирования бактерии Escherichia coli, синтезирующей рекомбинантный человеческий а2-интерферон.
В первой главе - литературном обзоре - приведены общие сведения о процессах культивирования микроорганизмов, продуцирующих белки. Рассмотрены основные компоненты, участвующие в процессе культивирования клеток в биохимических реакторах. Дан обзор современных подходов к изучению процессов, протекающих внутри биореактора, а также химических реакций, происходящих внутри клеток, созданных на основе рекомбинантных ДНК.
Рассмотрена история и современное состояние производства интерферонов. Приведены примеры применения интерферонов в лечении заболеваний человека. Рассмотрены вопросы роста микроорганизмов, продуцирующих белки, на различных субстратах. Освещены вопросы математического моделирования кинетики процессов, происходящих внутри биохимических реакторов. Описаны основные подходы, применяемые при масштабном переходе от лабораторных аппаратов меньшего объёма к промышленным установкам.
В соответствии с целью работы и на основании выводов, сделанных в результате анализа литературы, была сформулирована постановка задачи исследования и намечены этапы ее решения.
Вторая глава работы посвящена системному анализу процесса производства белка бактериальными клетками. Приведены результаты экспериментальных исследований, которые проводились по нескольким направлениям: исследование метаболизма штамма-продуцента; исследования процесса культивирования в качалочных колбах и лабораторном ферментёре (объёмом 15литров), дан комплексный анализ свойств получаемой биомассы и состава культуральной среды. В качестве объекта исследований использовали штамм E.coli SGK25/pIF TREN с конститутивным типом экспрессии рекомбинантного альфа-2 интерферона, созданного в ЗАО «Биокад» на основе штамма SG20050, рекомбинантной плазмидой pIF TREN. Экспериментальные и аналитические исследования позволили выявить взаимосвязь между физиологией микроорганизмов и условиями культивирования, благодаря чему удалось подобрать диапазон работы промышленного аппарата (объёмом 300 литров).
Третья глава посвящена разработке методики масштабного перехода от лабораторных установок (объёмом 15 литров) к аппаратам полупромышленного (70 литров) и промышленного (300 литров)типов. Использование современного аналитического оборудования такого как газовый масс-спектрометр для определения состава паровоздушной смеси в ферментёре в режиме реального времени, позволило исследовать: 1) динамику потребление клетками кислорода; 2) скорость выделения углекислого газа; 3) вычислить дыхательный коэффициент биореактора (RQ) и коэффициент массопередачи кислорода. Полученные данные были использованы при проверке адекватности математической модели.
В основу математического описания легли основные принципы и стратегия системного анализа к математическому моделированию химико-технологических систем и процессов, разработанных академиком В.В. Кафаровым. Адекватность математической модели была определена сопоставлением расчетных и экспериментальных данных при культивировании исследуемого штамма на установке промышленного масштаба (объёмом 300 литров).
Четвертая глава посвящена описанию процесса моделирования гидродинамики в биохимических реакторах в программном пакете Fluent и разработке математической модели кинетики процесса.
Автор выражает глубокую благодарность руководителям работы: д.т.н., профессору Н.В. Меныпутиной; д.м.н., зам. Генерального директора ОП ЗАО «Биокад» Денисову Л.А.; Генеральному директору ЗАО «Биокад» Морозову Д.В.; заведующему опытно-промышленной биотехнологической лабораторией ОП ЗАО «Биокад», к.т.н. Чугунову A.M., заведующей лабораторией физиологии микроорганизмов к.б.н. Гончаровой О.В., с.н.с. Ефанову Ю.Г., сотрудникам ОП ЗАО «Биокад» за консультации и помощь в проведении экспериментальных исследований, а также сотрудникам и аспирантам научной группы, принимавших участие в обсуждении данной работы.
Микробиологическое производство белка а2-интерферона
Существует два поколения медицинских препаратов интерферонов. Препараты первого поколения получали из донорской крови, однако дефицитность сырья, дороговизна конечного продукта и невозможность обеспечения растущих потребностей медицины не могли решить проблемы широкого использования интерферонов. Как пример, можно привести результат проделанной работы в 1976 году группы финских специалистов во главе с К. Кантелл. Использовав кровь от 65 000 доноров, получили 100-109 млрд. ед. интерферона. Для этого потребовалось около 30 тонн донорской крови. Наиболее часто употребляемая однократно вводимая доза человеческого L-интерферона составляет 2-10 ед. Для получения одной такой дозы необходимо было 600 мл периферической донорской крови. Таким образом, выполненная в 1976 году в Финляндии программа дала в целом 50 000 разовых доз интерферона. При этом содержание интерферона 106 ед/мг белка достигалось при сравнительно низкой степени очистки, при которой собственно интерферон в препарате составлял 0,1 - 1% [45]. Современное развитие вирусных заболеваний человека наложило дополнительные ограничения на использование препаратов, получаемых из крови доноров - всевозможные вирусы (ВИЧ, гепатиты), которые не всегда можно чётко идентифицировать [46, 47].
Выход из этой ситуации был найден в середине 80-х годов, когда с помощью генной инженерии удалось наладить широкомасштабное производство интерферонов и создать рекомбинантные препараты нового поколения. Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одна из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, расщепляют из ДНК хромосом человека с помощью рестриктазы, поэтому его «липкие» концы являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмид. Ферментом лигазой «склеивают» оба куска ДНК, в результате чего получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию Е. соїі. Все потомки этой бактерии (клоны) содержат в плазмидах чужеродный ген. Весь этот процесс называют клонированием [48 - 53]. На рис. 1.2 схематично отражен путь конструирования рекомбинантной плазмиды с последующим введением в клетку реципиента.
Поскольку белок а2-интерферон используется в медицинских целях, то требования к процессу его микробиологического производства достаточно высоки:
не допускается наличие посторонних микроорганизмов в микробной массе (высокая стерильность микробной биомассы);
важно то, что клетки E.coli синтезируют данный белок в виде нерастворимых гранул (тела включения), которые накапливаются внутри клеток, поэтому большое внимание уделяется структурной целостности клеток в результате их механического перемешивания [54, 55].
Всё это создает определенные трудности в крупномасштабном производстве данного белка и часто приводит к удорожанию конечного продукта, поэтому успешное моделирование процесса, а также масштабный переход технологии культивирования позволят сохранить высокий выход продукта, что, в конечном счёте, должно повлиять на цену лекарственного средства.
Следует обратить внимание, что конструирование плазмиды, а также выбор клетки-реципиента являются материалоёмким процессом, требующим большого опыта и знаний микробиологии и физиологии микроорганизмов [56, 57].
Интерфероны представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой от 15 000 до 21 000 дальтон. Выделяют три основные группы интерферонов: альфа, бета и гамма. Интерфероны оказывают действие на клетки за счет связывания со специфическими рецепторами на их поверхности [58, 59]. Функционирование системы интерферонов носит характер своеобразной цепной реакции, которая развивается в ответ на самые различные сигналы тревоги, будь то начинающаяся инфекция, другие формы патологии, стрессы и т.д. [60]. Таким образом, можно сказать, что интерфероны являются универсальным противовирусным препаратом, среди всех эффектов которого главными принято считать следующие:
Антивирусная активность, т.к. связана с подавлением трансляции вирусных РНК в клетках. Это обстоятельство определяет универсально широкий спектр антивирусного действия интерферонов или их индукторов.
Аналитические методы измерения параметров культивирования
Для контроля текущего процесса каждый час производился отбор проб, и определялись концентрации клеток. Рост оценивали по значению оптической плотности культуры (ОП) при длине волны 560 нм, экспрессию - по процентному содержанию рчИФН-а2 относительно суммарного белка клеток методом электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим сканированием геля и математической обработкой полученных результатов с помощью программного пакета GelPro 3.1.
Определение концентрации клеток по оптической плотности образца Оптическую плотность суспензии культуры E.coli определяли при помощи спектрофотометра Shimadzu (рис. 2.3) при длине волны 560 нм с использованием кювет с расстоянием между гранями 1.0 см.
Концентрацию биомассы рассчитывали по следующей корреляционной зависимости: концентрация клеток (4-Н?)#107, выраженная в кл/мл, соответствует значениям оптической плотности 0,2 Ю4 при длине волны 560 нм[151]. Определение содержания целевого белка методом электрофоретического разделения белков с применением вертикального электрофореза
В настоящее время электрофорез в (ПААГ) в присутствии (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE)] является общепринятым методом определения количеств бактериальных белков. Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля. Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда, поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфатом натрия [ДСН (SDS)] (C HksOSOsNa), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами. Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики. Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида. После завершения электрофореза зоны белков выявляют с помощью красителя Кумасси R-250 [152].
Первым шагом в исследовании процесса культивирования стал выбор условий для выращивания бактерий в колбах. Эксперимент проводили в колбах Эрленмейера (750 мл), содержащих различные объемы среды с ампициллином, на качалке при температуре +32С в течение 12-13 часов.
Влияние температуры
Температурой роста E.coli является широкий интервал +22...+ 40С, оптимальной является +37С 128, 143]. Проведённые ранее исследования показали, что для исследуемого рекомбинантного штамма наиболее подходящей является температура в +32 С.
Время проведения процесса
Время роста микроорганизмов зависит от многих факторов [151]. Результаты экспериментов, проведенные ранее с исследуемым штаммом-продуцентом, показали, что оптимальным временем окончания процесса является 12- 13 часов, т.к. к этому моменту наблюдается максимальное количество синтезируемого целевого белка в клетках, а также отсутствуют клетки, подвергшиеся лизису.
Влияние аэрации
Из-за того, что в колбах невозможно создать условий проточного режима прохождения воздуха, используют так называемую «аэрацию плёнки». Аэрирование среды происходит за счет того, что на стенках колбы при встряхивании на качалке образуется тонкая пленка жидкости. Следовательно, чтобы оценить влияние степени аэрации, необходимо исследовать культивирование при разных объёмах питательной среды в колбах. В работе были использованы следующие объёмы питательной среды 50, 200 и 400 мл. Культивирование проводили на качалке при интенсивности перемешивания 150 об/мин и температуре 32,0±0,5С.
Статистическая обработка полученных результатов
В биологических процессах, как нигде, результат процесса обычно неоднозначен. Существует какой-то уровень колебаний, возникающих по случайным причинам. Природа этих колебаний (источников неоднородности) может быть различной. Это и ошибки при определении результата, и различия в значении факторов при проведении эксперимента, и неточности приготовления сред, и, вообще, присущая биологическим объектом неоднородность.
А поскольку коэффициенты регрессии определяют по значениям выходного показателя, то и для них есть какой-то уровень случайных изменений, который и следует найти с помощью статистической обработки [98].
Уровень воспроизводимости процесса характеризуется дисперсией. Проведем расчет дисперсии процесса по данным повторных экспериментов матрицы. Если у - число повторений в каждом варианте среды, а N — общее число вариантов сред в матрице, то дисперсию воспроизводимости единичного значения находят по формуле: сг2 = "- . . (3.7) {y-\)-N
Надежность вычисления дисперсии воспроизводимости определяется количеством «лишних» опытов, необходимых для нахождения дисперсии (если у = 1, то дисперсию воспроизводимости по любой из формул найти невозможно). Это количество «лишних» опытов называют числом степеней свободы f. Для первого способа оно равно (у - 1), для второго - N(y - 1). Эта величина является важным статистическим показателем и будет использована в дальнейшем.
Уровень возможных случайных колебаний коэффициентов регрессии называется доверительным интервалом, обозначается буквой є и его вычисляют по формуле: ..jzjzzfc- ,Ny "У (y-\).N2-y (3 8) в этой формуле появляется новый коэффициент t - критерий Стьюдента, определяемый по таблицам [98]. Для надежности оценки до 95% критерий Стьюдента зависит только от числа степеней свободы f, при которых находили дисперсию воспроизводимости.
В таблице 3.4 представлены значения критерия Стьюдента для наиболее часто встречающихся значений f при Р=0,95.
Доверительный интервал є имеет одно и то же значение для всех коэффициентов. Сравнение коэффициента регрессии с доверительным интервалом и позволяет сделать вывод о его значимости. Все коэффициенты, значения которых ниже доверительного интервала, незначимы. Их можно считать нулевыми. Наоборот, если величина коэффициента больше є, он значим. При этом, имеется в виду модуль коэффициента: отрицательные коэффициенты регрессии тоже значимы, если они по модулю превосходят Є. Незначимость коэффициентов может быть вызвана различными причинами: взяты слишком малые интервалы варьирования фактора; плохая воспроизводимость процесса — все различия в выходе нивелируются ошибкой опыта; данный фактор находится на уровне, близком к оптимальному;
данный фактор не влияет на процесс вообще, по крайней мере в изученной области.
При незначимости каких-то коэффициентов можно увеличить интервалы варьирования по незначимым факторам и повторить эксперимент при новых условиях. Рассчитав в данном случае значение критерия Стьюдента, было получено, что в нашем уравнении регрессии нет незначимых коэффициентов.
Кроме оценки значимости коэффициентов в процедуре статистического анализа предусмотрена оценка адекватности полученного математического описания в целом. Для этого сначала находят дисперсию адекватности, которая характеризует отклонение рассчитанных по уравнению значений выходного показателя от найденного в эксперименте. Дисперсия адекватности определяется по формуле: 2= N-n-1 . (3.9) Степень адекватности математического описания оценивают по критерию Фишера F, который вычисляют по формуле: , (3-Ю) в этом уравнении множитель у в числителе связан с тем, что дисперсия воспроизводимости а определяется не для единичного измерения, а для среднего из у повторений.
Чтобы найти адекватность уравнения, необходимо критерий Фишера сравнить с табличным, имеющимся в справочниках по статистике, также для надежности оценки 95%. Рассчитанное значение критерия Фишера меньше табличного, следовательно, модель адекватна.
Моделирование гидродинамики исследуемых биохимических реакторов с использованием программного пакета Fluent
В связи с тем, что уравнения гидродинамики в сложных системах представляют собой в основном нелинейные уравнения, то для их решения используют программное обеспечение Fluent. В программном пакете Fluent заложены математические уравнения, и в зависимости от поставленной задачи необходимо выбирать те из них, которые наиболее точно описывают рассматриваемый процесс.
В рассматриваемом процессе поведение диспергированных частиц наиболее достоверно описывает уравнения Навье-Стокса. Уравнение Навье-Стокса - нелинейно, и решить его аналитическими методами не удается. При использовании численных методов решения, которые зашиты во FLUENT, задача разделяется на 2 подзадачи: 2-х мерная, которая основана на экспериментальных данных, и 3-х мерная, где моделируется физическое устройство аппарата и решается уравнение гидродинамики с учётом поведения мешалки. Само по себе данное уравнение сложное, потому что присутствуют неизбежные, в таких случаях, срывы ламинарных потоков с краёв мешалки.
Выбор моделей во Fluent
Поскольку в биохимическом реакторе сильно турбулентный режим, то процессы гидродинамики описываются моделью к-є. Это полуэмпирическая модель, основанная на сохранении энергии. Она основывается на экспериментальных данных. Данная модель проверена на множестве задач и является адекватной для полностью турбулентных потоков. В связи с тем, что в работе использовали биохимический реактор, который содержал гетерогенную среду (диспергированная фаза + сплошная среда), то необходимо в расчёты ввести дополнительную модель - модель Эйлера, которая была разработана для гетерогенных систем.
Так как исследуемая среда, находящаяся в биохимическом реакторе, гетерогенна, то на этапе создания сетки необходимо разделить аппарат на 2 области: начальное положение клеток при выключенной мешалке; вся оставшаяся область с культуральной жидкостью.
Поскольку невозможно задать модели, учитывающих твердые тела, для решения данной задачи применяем метод, основанный на предположении, что мешалка неподвижна, но весь остальной объём вращается вокруг оси симметрии аппарата (в рассматриваемом эксперименте - вала мешалки).
Таким образом, определяя граничные условия во Fluent, можно сказать, что мешалка - это граничное условие типа стенки (WALL), при этом абсолютная скорость движения данной сетки равна 0, а абсолютные скорости внутреннего объёма аппарата и стенок аппарата равны соответственно (10, 20, 50 и т.д. оборотов/мин).
Построение геометрии виртуального аппарата
Так как реактор объёмом 15литров представляет собой колонну и имеет ось симметрии 1 рода, то можно рассматривать задачу в двумерном пространстве. Для решения поставленной задачи аппарат можно представить в виде прямоугольника длинной 400 мм и шириной 200 мм. То есть, имеется половина продольного сечения аппарата. Это сделано для того, чтобы уменьшить число расчётных ячеек, что позволит сократить общее количество вычислений, и, таким образом, уменьшить время сходимости решения. Для того чтобы в процессе расчёта левая кромка не рассматривалась как стенка аппарата, необходимо обозначить её как ось симметрии (Symmetry axis).
Фактически, в данном случае определяется одно из граничных условий, показывающее то, что в обеих частях аппарата соблюдаются одни и те же расчётные уравнения и рабочие условия.
Следующим этапом становится определение вектора ускорения свободного падения, который ориентирован вдоль отрицательного направления оси Oz. При этом сама ось Oz - является осью симметрии аппарата и направлена снизу вверх (к крышке аппарата). Определив вектор ускорения свободного падения, тем самым в модель добавляется ещё одно уравнение, которое описывает силу тяжести, действующую на частицу диспергированного материала.
Также необходимо определить физические свойства материалов, участвующих в процессе (культуральной жидкости и самих клеток). Эти значения берём из экспериментальных и литературных данных: Плотность культуральной жидкости (g) - 1000 кг/м ; Плотность клеток 1050 кг/м3; Частицы материала - идеальные сферические частицы с геометрическими размерами - диаметр 2«10"4 м;
