Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 7
Глава 2 Материалы и методы исследования 23
2.1 Характеристика клинического материала 23
2.2 Методика исследования материала 27
Глава 3 Морфологическая характеристика венозных ангиодис-плазий 30
3.1 Гистологическая характеристика венозных ангиодис-плазий 30
3.2 Ультраструктурная характеристика венозных ангиодис-плазий 44
3.3 Иммуногистохимическая и биохимическая характеристика венозных ангиодисплазий 47
Глава 4 Морфологическая характеристика артериовенозных ан гиодисплазий 54
4.1 Гистологическая характеристика артериовенозных ангиодисплазий 54
4.2 Ультраструктурная характеристика артериовенозных ангиодисплазий 64
4.3 Иммуногистохимическая и биохимическая характеристика артериовенозных ангиодисплазий 67
Глава 5 Сравнительная морфологическая характеристика ангио дисплазий и гемангиом 74
Глава 6 Обсуждение полученных результатов 80
Выводы 98
Практические рекомендации 100
Список литературы 101
- Методика исследования материала
- Ультраструктурная характеристика венозных ангиодис-плазий
- Ультраструктурная характеристика артериовенозных ангиодисплазий
- Сравнительная морфологическая характеристика ангио дисплазий и гемангиом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ангиодисплазии (сосудистые мальфор-мации, врожденные пороки развития сосудов) являются результатом нарушения формирования сосудов в эмбриогенезе. Частота их колеблется от 0,3% до 5,4% (в среднем 2,6%) среди пациентов с заболеваниями периферических сосудов, госпитализированных в специализированные отделения [Garzon М.С., 2007а; Liapis С. D. et al., 2007; Дан В.Н., 2008]. При этом реальная заболеваемость сосудистыми мальформациями, видимо, несколько выше, так как в части наблюдений они ошибочно диагностируются как сосудистые опухоли, в частности, гемангиомы [Sangueza О.Р., 2003].
Ангиодисплазии представляют один из наиболее сложных видов сосудистой патологии, характеризующиеся большим разнообразием морфологических и клинических проявлений, и нередко приводящие к развитию серьезных осложнений [Милованов А.П., 1978; Мишнёв О.Д. и др., 2008; Sangueza О.Р. et al., 2003; Garzon М.С. et al., 20076].
В последнее время среди специалистов, занимающихся вопросами диагностики и лечения ангиодисплазии, заметно возрос интерес к данной патологии, что обусловлено необходимостью выяснения патогенетических основ заболевания на молекулярно-генетическом уровне для разработки стратегии диагностики и лечебной тактики [Ферзаули А.Н., 2002; ТШе J.C. et al., 2004; Дан В.Н., 2008; Limaye N. et al., 2009].
В настоящее время разработаны и используются различные классификации сосудистых мальформаций, прежде всего прикладные и узкоспециальные [Enjolras О. et al., 2007, Lee В.В. et al., 2007], критерии их лучевой диагностики [Ситников А.В., 2002; Галактионова Л.А., 2007], а также методы хирургического и консервативного лечения заболеваний данной группы [Куликов СВ., 2001; Дан В.Н., 2008; Garzon М.С, 2007; Liapis С. D. et al., 2007]. При этом лечение больных с врожденными пороками развития сосудов до сих пор считается одним из самых сложных разделов сосудистой хирургии [Mattassi R. et al., 2009].
Важно отметить, что, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в изучении ангиодисплазии, отсутствует единое мнение специалистов по вопросам выбора тактики и рациональных сроков оперативного вмешательства, причинах их возникновения и патогенезе, терминологии, не создана единая универсальная классификация, отсутствуют четкие и общепринятые критерии их дифференциальной диагностики, в том числе и с новообразованиями [Дан В.Н., 2008; Мишнёв О.Д. и др., 2008; Mattassi R. et al., 2009]. Не выяснены до настоящего времени морфологические особенности сосудистых мальформаций разных типов, недостаточно изучена роль различных ангиогенных медиаторов и их взаимодействие в патогенезе ангиодисплазии, а также отсутствуют четкие и детальные описания особенностей морфологической картины сосудистых мальформаций в зависимости от применяемых методов лечения.
Цель исследования: при помощи комплексного морфологического исследования изучить патологическую анатомию венозных и артериове-нозных ангиодисплазии мягких тканей.
Задачи исследования:
При помощи гистологических методов исследования провести сравнительное изучение артериовенозных и венозных форм ангиодисплазии.
Изучить ультраструктурные особенности строения артериовенозных и венозных ангиодисплазии.
При помощи иммуногистохимических методов исследования изучить особенности эндотелиальных клеток ангиодисплазии и гемангиом, а также выявить возможные молекулярные нарушения в клетках этих образований.
Провести сопоставление морфологических данных с результатами иммуноферментного анализа гомогенатов ангиодисплазии.
Изучить возможности иммуногистохимических методов для дифференциальной диагностики ангиодисплазии и гемангиом.
Научная новизна
Впервые на большом объеме операционного материала изучены гистологические характеристики артериовенозных и венозных мальформаций мягких тканей.
Впервые детально исследованы ультраструктурные особенности различных видов ангиодисплазий мягких тканей.
Впервые изучены особенности экспрессия основных ангиогенных факторов роста: сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), трансформирующего фактора роста р (TGF-P) и его рецептора, и маркеров пролиферации (Кі-67, не-стин) в эндотелиоцитах сосудистых мальформаций мягких тканей.
Проведено сравнительное гистологическое и иммуногистохимическое изучение ангиодисплазий и гемангиом мягких тканей.
Практическая значимость
Установленные морфологические (гистологические, иммуногистохи-мические, ультраструктурные) особенности строения ангиодисплазий подчеркивают значимость и необходимость комплексного изучения биопсий-ного и операционного материала больных.
Предложены морфологические, в том числе иммуногистохимические, критерии для дифференциальной диагностики ангиодисплазий и гемангиом.
Результаты исследований могут быть использованы для разработки таргетной терапии сосудистых мальформаций мягких тканей.
Внедрение результатов работы
Результаты исследования используются в практической работе отдела патологической анатомии Института хирургии имени А.В. Вишневского Росмедтехнологий. Полученные данные о морфологических особенностях сосудистых мальформаций используются в материалах лекций и практических занятий со студентами и ординаторами на кафедре патологической
анатомии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета.
Апробация работы
Основные положения работы доложены и обсуждены на XII ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2008); 20-ом Международном конгрессе по изучению тромбоза International Congress on Thrombosis (Афины, Греция, 2008); Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию кафедры патологической анатомии ВМА им. С.М.Кирова (Санкт-Петербург, 2009); XIII ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2009); III съезде Российского общества патологоанатомов (Самара, 2009), 22-ом Европейском конгрессе патологов (Флоренция, Италия, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Опубликованные работы содержат полный объем информации, касающийся темы диссертации.
Объем и структура работы
Методика исследования материала
Полученные кусочки тканей фиксировали в 10% нейтральном формалине. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили по общепринятым методикам на депарафинированных срезах толщиной 3 мкм, расположенных на стеклах, покрытых L-полилизином. Предварительную демаскировку антигена проводили путем кипячения образцов в растворе цитратного буфера с рН 6.0. Блокирование эндогенной пероксидазы - путем обработки срезов 0,3% раствора перекиси водорода в течение 15 минут. В качестве фонового красителя использовали гематоксилин. Перечень использованных антител представлен в таблице 5.
Характер иммуногистохимических реакций оценивали визуально в баллах с учетом интенсивности окраски и процента окрашенных клеток (таблица 6). Оценку числа Ki-67-позитивных клеток проводили при помощи телевизионного анализатора изображений «МЕКОС-Ц1».
Для проведения электронно-микроскопического исследования из операционного материала вырезали кусочки объемом 1 мм3, которые фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида и 1% растворе четырехокиси осмия. Затем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50%, 70%, 96% и 100%), после чего пропитывали в смеси окись пропилена - эпона-ралдитовая смола. После пропитки материал помещали в капсулы и заливали эпонаралдитовой смолой, затем помещали в термостат при температуре 60 С на 2 суток, готовили срезы толщиной 1,5-2 мкм и окрашивали толуидино-вым синим. После предварительного светомикроскопического изучения полутонких срезов вырезали пирамидки с таким расчетом, чтобы поверхность среза приходилась на интересующий нас участок. Ультратонкие срезы толщиной 100-120 нм получали на ультратоме фирмы LKB (Швеция), ультраструктурное изучение препаратов проводили при помощи электронного микроскопа Philips СМ10 (Нидерланды).
Содержание VEGF и VEGFR2 в гомогенатах ткани ангиодисплазий определяли с помощью стандартных наборов для иммуноферментного анализа -«Quantikine Human VEGF Immunoassay» и «Quantikine Human VEGFR2 Immunoassay» (R&D systems, США) в соответствии с инструкциями производителя (исследование проведено совместно с член-корр. РАМН Н.Е.Куш-линским в отделении клинической биохимии НИИ клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН). Концентрацию этих факторов в тканях выражали в пг/мг белка, определенного по методу Лоури.
Статистическую оценку количественных данных проводили при помощи ЭВМ с использованием программного пакета Statistica.
Ультраструктурная характеристика венозных ангиодис-плазий
Нами было проведено электронно-микроскопическое изучение кусочков тканей 9 больных с венозными сосудистыми мальформациями, из которых 5 относились к первому типу и 4 - ко второму. В результате проведенного исследования нами было установлено, что вены и каверны среднего и малого диаметра были выстланы округлыми эндотелиальными клетками, имеющими множество средней длины и длинных отростков и ядра неправильной формы с изрезанной ядерной мембраной (рис. 16). Вены и каверны крупного диаметра были выстланы преимущественно уплощенными эндотелиоцитами с малым числом коротких и широких отростков и ядрами овальной формы.
Признаки функциональной активности (большое число вакуолей в цитоплазме, множество выростов цитоплазматической мембраны, множество рибосом, мелкодисперсный хроматин) были более выражены в эндотелиоци-тах, выстилавших сосуды и каверны малого диаметра. Стенки этих сосудов были представлены одним слоем эндотелиальных клеток и единичными перицитами. Функциональная активность эндотелиоцитов, выстилающих вены и каверны среднего и крупного диаметра, была значительно ниже или минимальна.
Базальная мембрана в кавернах крупного диаметра местами имела многослойную структуру, прерывистый характер и локальные утолщения (рис. 17). Плотные контакты между эндотелиоцитами были единичными, однако количество их было несколько выше в кавернах крупного диаметра. При этом в одном наблюдении в некоторых кавернах крупного диаметра отмечалось отсутствие эндотелиальной выстилки с явлениями экстравазации эритроцитов (рис. 18).
Стенка каверн среднего и крупного диаметра была утолщена и представлена волокнами зрелого коллагена с расположенными между ними фиб-робластами овальной и веретеновидной формы. Стенка каверн малого диа метра была тонкой и также представлена волокнами зрелого коллагена с наличием фибробластов преимущественно веретеновидной формы. Часть фиб-робластов находилась в функционально активном состоянии. Во всех препаратах в структуре сосудистой стенки выявлялись единичные перициты (рис. 19).
При иммуногистохимическом исследовании препаратов у 52 пациентов (66,7% наблюдений) с венозными сосудистыми мальформациями нами была выявлена умеренная положительная реакция b-FGF в эндотелиоцитах каверн и вен, входящих в состав образования (рис. 20). Примечательно, что в эндотелии вен малого диаметра и капилляров, расположенных преимущественно в периферических отделах образования отмечался высокий уровень экспрессия данного фактора роста (рис. 21). В остальных (26) наблюдениях нами было выявлена низкая экспрессия b-FGF эндотелиоцитами.
Наряду с этим только у 6 больных с венозными мальформациями нами . была отмечена высокая экспрессия VEGF в эндотелиальных клетках (рис. 22). В 65 наблюдениях (65,4%) венозных сосудистых мальформаций имелась низкая экспрессия сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF) в эндотелии каверн и вен, входящих в состав образования. В 7 наблюдениях данный фактор вообще не экспрессировался эндотелиоцитами каверн и вен образования. Однако в эндотелиоцитах сосудов малого диаметра, расположенных преимущественно в периферических отделах образования, отмечалась высокая экспрессия VEGF. Кроме того, экспрессия VEGF определялась и в плазме
В. 61 наблюдении венозных сосудистых мальформаций (78,2%), нами также была выявлена умеренная экспрессия трансформирующего фактора роста (3 (TGF-p) в эндотелии каверн и вен. В 9 наблюдениях экспрессия данного фактора в эндотелии практически отсутствовала (имелись единичные экспрессирующие TGF-P клетки), и лишь у 8 больных отмечалась высокая экспрессия указанного фактора (рис. 23). По периферии образования в сосудах малого диаметра также наблюдалась высокая экспрессия TGF-p. Незначительная экспрессия рецептора трансформирующего фактора роста 1 и 3 типов (TGF-p 1 и TGF-рЗ), т. н. CD 105, была отмечена нами в 43 наблюдениях (55,1%). В 23 наблюдениях нами было выявлено отсутствие экспрессии CD 105 в эндотелии каверн и вен образования и лишь у 12 пациентов - экспрессия CD 105 была умеренной. И опять, в мелких сосудах по периферии ан-гиодисплазии имелась высокая экспрессия CD 105 (рис. 24).
Пролиферативную активность клеток мы оценивали путем иммуноги-стохимического выявления Ki-67. За низкое его значение мы приняли цифры от 0 до 1%, за умеренное - от 2 до 4% и за высокое - более 4%. Индекс проли-феративной активности эндотелиоцитов во всех наблюдениях венозных сосудистых мальформаций был низким, что соответствовало единичным экспрес-сирующим Ki-67 клеткам. При этом в 7 наблюдениях нами была выявлена умеренная пролиферативная активность эндотелиоцитов вен малого диаметра и капилляров, расположенных преимущественно в периферических отделах образования. Во всех указанных наблюдениях имели место длительный анамнез заболевания (более 9 лет), предшествующие хирургические вмешательства и рецидивы заболевания. Так, индекс пролиферативной активности эндотелиоцитов в венах малого диаметра и капиллярах, расположенных по периферии, на препаратах пациентки П. 30 лет, с рождения страдающей венозно-кавернозным ангиоматозом левой верхней конечности и перенесшей в возрасте 21 г операцию иссечения ангиоматозных тканей, составил 5% (рис. 25). Следует отметить, что после указанного оперативного вмешательства было отмечено прогрессирование заболевания: увеличение образования в объеме, появление болевого синдрома.
При анализе гомогенатов тканей ангиодисплазий во всех образцах первичных венозных сосудистых мальформаций нами было установлено умеренное содержание сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, кото рое варьировало от 0,7 до 21,8 пг/мг (средние значения ростовых факторов приведены в таблице 7). В ткани рецидивных образований его концентрация была несколько выше: от 0,6 до 28 пг/мг.
При этом содержание в ткани венозных мальформаций рецептора VEGFR 2 типа (VEGFR2) практически не отличалось в ткани как первичных (от 50,2 до 177,5 пк/мг), так и рецидивных образований (от 38,9 до 147,8 пк/мг).
Полученные нами данные коррелируют с результатами иммуногисто-химического исследования, согласно которым венозные мальформаций характеризуются низким уровнем экспрессии VEGF. Практически одинаковые концентрации VEGFR2 как в ткани первичных, так и рецидивных венозных мальформаций подтверждают факт того, что система сосудисто-эндотелиального фактора роста играет незначительную роль в патогенезе данного типа ангиодисплазий.
Ультраструктурная характеристика артериовенозных ангиодисплазий
При электронно-микроскопическом исследовании операционного материала 5 артериовенозных сосудистых мальформации нами было установлено, что артерии и вены малого диаметра были выстланы эндотелием неправильной и округлой формы с множеством средней длины, и длинных отростков. Ядра таких эндотелиоцитов имели овальную форму и изрезанную ядерную мембрану (рис. 36). Артерии и вены крупного диаметра были выстланы преимущественно уплощенными эндотелиоцитами с малым числом коротких отростков.
Стенка сосудов малого диаметра была представлена одним слоем эндо-телиальных клеток и единичными перицитами. При этом в эндотелиоцитах отмечались признаки выраженной функциональной активности в виде большого числа рибосом и вакуолей в цитоплазме, а также множества выростов цитоплазматической мембраны. Функциональная активность эндотелиоцитов, выстилающих артерии и вены среднего и крупного диаметра, была значительно ниже или минимальна. Количество плотных контатков между эндотелио-цитами в артериях любого диаметра было минимальным (рис. 37). В стенке артерий и вен любого диаметра выявлялись единичные перициты. Кроме того, вокруг артерий и вен малого диаметра, а также артериол и венул нами были выявлены единичные тучные клетки (рис. 38).
Сосудистая стенка была значительно утолщена в венах крупного диаметра и умеренно утолщена в артериях и венах среднего диаметра, преимущественно за счет волокон зрелого коллагена и фибробластов, имевших чаще овальную и веретеновидную, реже - неправильную форму (рис. 39).
Часть фибробластов находилась в функционально активном состоянии. Во всех случаях отмечались участки хаотичного и беспорядочного расположения волокон коллагена в сосудистой стенке артерий крупного диаметра.
Во всех наблюдениях артериовенозных сосудистых мальформации нами была выявлена выраженная экспрессия эластина в области наружной и внутренней эластических мембран, а также в окружающей образование соединительной ткани. Внутренняя и наружная эластичные мембраны артериальной стенки во всех наблюдениях имели прерывистый характер с разрывами, локальными утолщениями, многослойностью и расщеплениями (рис. 40). Описанные изменения структуры эластических мембран являются, на наш взгляд, важным дифференциально-диагностическим критерием артериовенозных мальформации.
Сравнительная морфологическая характеристика ангио дисплазий и гемангиом
Для выявления дифференциально-диагностических признаков ангио-дисплазий и гемангиом нами было проведено комплексное морфологическое (гистологическое и иммуногистохимическое) изучение операционного материала 8 гемангиом.
При изучении гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в 8 наблюдениях нами были выявлены гемангиомы, из них капиллярные - в 5 наблюдениях, а кавернозные - в 3.
Капиллярные гемангиомы представляли собой скопление тонкостенных капилляров одинакового размера, между которыми располагались островки жировой ткани. Кавернозные (венозные) гемангиомы были представлены сосудами среднего диаметра венозного типа с тонкой стенкой, бедной мышечными волокнами, выстланными округлыми эндотелиоцитами. Размер сосудов, составляющих гемангиому, был практически одинаковым. При этом, в отличие от венозной сосудистой мальформации, между кавернами гемангиомы не выявлялась соединительная и жировая ткань.
Все гемангиомы характеризовались четкой ограниченностью от прилежащих тканей за счет окружавшей образование рыхлой волокнистой соединительной ткани. В 6 изученных нами наблюдениях гемангиомы находились в инволютивной фазе развития и эндотелиоциты, выстилающие их сосуды, имели уплощенную форму, ядро малых размеров с дисперсным хроматином. В 2 наблюдениях гемангиомы находились в пролиферативной фазе, при этом выстилающие их сосуды эндотелиоциты были крупными, округлыми и содержали крупные ядра с частично конденсированным хроматином и ядрышками.
Характерным отличительным признаком сосудистых мальформации от гемангиом является наличие нервных волоков в структуре мальформации. Так пучки нервных волокон нами были выявлены в 19 из 23 артериовенозных и в 70 наблюдениях венозных мальформаций. В то же время во всех наблюдениях гемангиом они отсутствовали.
Поскольку нервные волокна характеризуются положительной иммуно-гистохимической реакцией с S-100 белком, нами было проведено сравнительное иммуногистохимическое исследование ангиодисплазией и гемангиом. Во всех наблюдениях артериовенозных и венозных мальформаций (рис. 46) нами была выявлена положительная экспрессия белка S-100 в одиночных нервных волокнах и их пучках (преимущественно малого диаметра), расположенных в структуре ангиодисплазии. Во всех наблюдениях гемангиом экспрессия S-100 белка отмечалась лишь в немногочисленных одиночных нервных волокнах, расположенных в структуре опухоли (рис. 47) Во всех наблюдениях артериовенозных сосудистых мальформаций нами была выявлена выраженная экспрессия эластина в области внутренней и наружной эластической мембран, которые имели неравномерный прерывистый вид с локальными утолщениями и истончениями (рис. 48). Во всех наблюдениях венозных сосудистых мальформаций нами была выявлена незначительная экспрессия эластина в стенке входящих в структуру образования вен и каверн. Во всех препаратах гемангиом экспрессия эластина в стенке опухолевых сосудов была минимальной (рис. 49). Для характеристики эндотелиальных клеток мы использовали иммуногистохимическое выявление нестина. Последний является представителем семейства промежуточных филаментов IV класса, содержится преимущественно в нейроэпителиальных стволовых клетках и клетках предшественниках, а также в делещихся клетках других тканей и органов.
Во всех наблюдениях венозных и артериовенозных ангиодисплазии отсутствовала экспрессия нестина в эндотелии сосудов и сосудистых полостей образования. Умеренная экспрессия нестина была отмечена только в эндотелии сосудов малого диаметра, расположенных в периферических отделах образования. Во всех наблюдениях гемангиом нами была отмечена умеренная (рис. 50), а в 1 наблюдении - высокая экспрессия нестина эндотелиоцитами опухолевых сосудов. сосудов гемангиомы, ув. 400.
Наиболее часто используемым параметром, позволяющим провести дифференциальную диагностику доброкачественных, пограничных и злокачественных опухолей, является индекс пролиферации клеток. Выявление про-лиферирующих клеток было проведено нами путем иммуногистохимического выявления Ki-67. На основании проведенных исследований нами установлено, что пролиферативный индекс эндотелиоцитов сосудов крупного и среднего диаметра артериовенозных и венозных мальформаций был низким (единичные экспрессирующие Ki-67 клетки), однако пролиферативная активность сосудов мелкого диаметра, расположенных в периферических отделах мальформаций, была умеренно повышена. В 3 наблюдениях пролиферативный индекс эндотелия гемангиом был низким (индекс Ki-67 0-1%), в 2 наблюдениях -высоким (индекс Ki-67 4 - 5%) (рис. 51) и в 3 - умеренным.
Таким образом, основными критериями, позволяющими провести дифференциальную диагностику сосудистых образований, являются наличие в структуре образования артерий и артериол, характерных для артериовенозных мальформаций, что определялось по характерному строению их стенки и наличию в ее структуре внутренней и наружной эластических мембран; наличие в структуре образования пучков нервных волокон, что является типичным для ангиодисплазий и различия в величине пролиферативного индекса гемангиом и сосудистых мальформаций.
