Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Вирус гепатита С 18
1.1.Организация генома вируса 18
1.2. Строение вириона 25
1.3. Вирус гепатита С как представитель семейства Flaviviridae 29
Глава 2. Основные антигены вируса гепатита С 36
2.1. Структура и эпитопы оболочечных белков вируса 38
2.2. Нуклеокапсидный антиген и его детерминанты 56
2.3. Биологическая роль и эпитопы белка NS3 59
2.4. Полипептиды NS4a и NS4b и их детерминанты 64
2.5. Биологическое значение и эпитопы белков NS5a и NS5b 66
Глава 3. Роль иммунной системы в ограничении ВГС-инфекции 69
3.1. Основные факторы иммунной системы, влияющие на элиминацию вируса в острой фазе инфекции 69
3.2. Специфический Т-клеточный ответ при гепатите С 73
3.3. Гуморальный ответ на антигены вируса 81
Глава 4. Материалы и методы 88
4.1. Материалы исследований 88
4.2. Сорбция антигенов для твердофазного ИФА 90
4.3. Ориентированная посадка пептидов для ИФА 91
4.4. Синтез пептидных антигенов 91
4.5. Определение концентрации белков 93
4.6. Твердофазный иммуноферментный анализ 94
4.7. Выявление и титрование специфических иммуноглобулинов М...95
4.8. Определение и титрование специфических иммуноглобулинов G к антигенам -капсидный, NS3,NS4ab и NS5a 96
4.9. Выявление анти-капсидных иммуноглобулинов методом оптического биосенсора 98
4.10. Определение фрагментов генома вируса 100
4.11. Анализ активности аланин- и аспартат-аминотрансфераз 101
4.12. Статистическая обработка данных 101
Глава 5. Специфический гуморальный иммунитет при естественном течении острого гепатита С 105
5.1. Вирусспецифические антитела класса М 105
5.2. Иммуноглобулины G к оболочечным антигенам 109
5.3. Появление антител класса G к капсидному белку и неструктурным антигенам и изменение их содержания при развитии хронической инфекции 115
5.4. Изменение титров иммуноглобулинов G к капсидному и неструктурным антигенам при элиминации вируса 121
Глава 6. Специфический гуморальный иммунитет при естественном течении хронического гепатита С 125
6.1. Частота выявления и титры вирусспецифических иммуноглобулинов М 125
6.2. В-клеточный ответ на оболочечные антигены вируса 126
6.3. Титры антител класса G к нуклеокапсидному белку 130
6.4. Частота обнаружения и уровень иммуноглобулинов G к неструктурным антигенам 133
Глава 7. Динамика показателей специфического гуморального иммунитета при этиотропной терапии больных хроническим гепатитом С 136
7.1. Изменение титров ВГС-специфических антител класса М 136
7.2. Динамика содержания иммуноглобулинов G к оболочечным белкам вируса 143
7.3. Изменение титров антител класса G к капсидному антигену 145
7.4. Динамика содержания иммуноглобулинов G к неструктурным антигенам вируса 147
Глава 8. ВГС-специфический гуморальный иммунитет у людей, перенесших острую инфекцию с выздоровлением 152
8.1. Результаты обнаружения специфических иммуноглобулинов М и антител класса G к оболочечным и неструктурным белкам 152
8.2. Обнаружение иммуноглобулинов G к капсидному антигену 153
Глава 9. Вирусспецифический гуморальный иммунитет у детей с маркерами ВГС-инфекции 154
9.1. Частота выявления специфических иммуноглобулинов М у детей старше 2-х лет больных хроническим гепатитом С 154
9.2. Антитела класса G к капсидному антигену у детей старше 2-х лет больных хроническим гепатитом С 155
9.3. Иммуноглобулины G к неструктурным антигенам у детей старше 2-х лет больных хроническим гепатитом С 156
9.4. Изменения титров антител класса G к капсидному и неструктурным антигенам у детей до 2-х лет, рожденных матерями с маркерами ВГС-инфекции 160
Обсуяедение 166
Заключение 192
Выводы 197
Практические рекомендации 200
Список литературы 201
Приложение 258
- Вирус гепатита С как представитель семейства Flaviviridae
- Биологическое значение и эпитопы белков NS5a и NS5b
- Специфический Т-клеточный ответ при гепатите С
- Определение и титрование специфических иммуноглобулинов G к антигенам -капсидный, NS3,NS4ab и NS5a
Введение к работе
В настоящее время в Российской Федерации, как и в большинстве стран, отмечается неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по парентеральным вирусным гепатитам: к 2015-2020 годам ожидается удвоение количества инфицированных людей на нашей планете [Официальная информация, 2003; Armstrong G.L. et al., 2000; Tanaka Y. et al., 2002]. Начиная с 2001 года, в РФ отмечается тенденция к снижению показателей заболеваемости острыми парентеральными вирусными гепатитами, тем не менее ежемесячно за последние три года регистрируется около 5,7-6,1 тыс. впервые выявленных людей с хроническими вирусными гепатитами [Официальная информация, 2003; Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь-сентябрь 2004 г., 2005; Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь-февраль 2005 г.; 2005]. До настоящего времени в нашей стране продолжается рост выявления детей больных гепатитом С. Около 1,4-2,4% граждан Российской Федерации инфицированы вирусом гепатита С (ВГС) [Селиванов Е.А. и др., 2003; Шляхтенко Л.И., 2003]. Подавляющее большинство этих людей имеет хронический гепатит С. Для персистентной ВГС-инфекции характерно прогрессирующее течение, приводящее к формированию цирроза печени в 20-30% случаев, к первичной гепатоклеточной карциноме - в 8-15%, к терминальному поражению печени - в 0,5-1%, к внепеченочным проявлениям - в 11-62% [Alter M.J. et al., 1999; Memon M.I. et al., 2002; Hadziyannis S. J., 1997; Игнатова E. M. и др., 1998].
Несмотря на интенсивное изучение ВГС-инфекции в течение последних 16 лет до сих пор не удалось установить механизм развития персистентной инфекции, особенности успешного иммунного ответа при естественной элиминации вируса в острой фазе, роль неспецифического иммунитета в ограничении инфекции, значение специфического гуморального и Т-клеточного ответа, создать профилактическую вакцину против гепатита С.
Антигены ВГС способны индуцировать В- и Т-клеточный ответ, который в 15-25% случаев острого гепатита С достаточен для естественной элиминации вируса [Giuberti Т. et al., 1992; Villano S.A. et al., 1999; Armstrong G.L. et al., 2000]. Но в подавляющем большинстве случаев острая инфекция заканчивается развитием хронического гепатита С на фоне более или менее выраженного адаптивного В- и Т-клеточного ответа [Cramp М.Е. et al., 1999; Bowen D.G., Walker СМ., 2005, (Nature)]. Несомненно, вирус гепатита С -уникальный патоген, который способен ускользать от иммунного контроля, создавая новые генетические и антигенные варианты, задерживать формирование Т-хелперного и Т-киллерного ответа при остром гепатите С, вызывать повторную реинфекцию у выздоровевших людей. Изучение ВГС-инфекции и специфического иммунитета началось после идентификации вируса в 1989 г. и в первую очередь преследовало главную цель - создание профилактической вакцины [Choo Q.-L. et al., 1989; Choo Q.-L. et al., 1994]. К концу 90-х годов прошлого века после неудачных попыток создания протективной вакцины на основе рекомбинантных оболочечных белков вируса основной акцент в изучении специфического иммунитета при гепатите С был смещен в область анализа антивирусного Т-клеточного ответа [Раре G.R. et al, 1999; Lechner F. et al, 2000].
Изучение специфического иммунитета при ВГС-инфекции во многом сдерживается отсутствием доступной лабораторной модели инфекции, вирус поражает только людей и шимпанзе. Как показали A. Basset и соавторы, у ВГС-инфицированных шимпанзе течение инфекции легче и выздоровление происходит чаще, чем у людей [Basset S.E. et al., 1998]. Поэтому анализ специфического иммунитета у людей больных гепатитом С или перенесших его с выздоровлением - актуальная задача, решение которой позволит понять механизм успешного иммунного ответа, обеспечивающего естественную элиминацию вируса, разработать подходы к созданию профилактической вакцины, а также расшифровать клинико-диагностическую значимость В- и Т-клеточного ответа на каждый (индивидуальный) антиген вируса.
К моменту начала данного исследования были установлены отдельные качественные параметры противовирусного гуморального иммунитета, не выявлены различия в направленности и количественных характеристиках специфических антител при острой и хронической ВГС-инфекции, не изучены количественные изменения антивирусных иммуноглобулинов при естественно текущей острой и хронической инфекции и при проведении противовирусной терапии. Эти сведения необходимы для разработки профилактических и терапевтических вакцин против гепатита С, для ранней диагностики инфицирования, для определения острой и хронической фазы инфекции и для выбора оптимального курса противовирусной терапии.
Цель исследования
Изучить специфический гуморальный иммунитет при вирусном гепатите С и установить закономерности В-клеточного ответа, характерные для основных фаз инфекции и представляющие диагностическую значимость.
Задачи исследования:
1. Определить прогностическое значение специфических иммуноглобулинов М в острую и хроническую фазы ВГС-инфекции, исследовать корреляционную зависимость между величинами титра этих антител, активностями аланин- и аспартат-аминотрансфераз и наличием вирусной РНК в крови.
2. Изучить гуморальный ответ на участки оболочечных белков ВГС, содержащие линейные В-эпитопы, при остром и хроническом гепатите С, при элиминации вируса и проведении специфической терапии интерфероном-альфа.
Исследовать динамику уровня иммуноглобулинов G на отдельные антигены ВГС в острую фазу инфекции и выявить их прогностически значимые изменения.
Установить титры иммуноглобулинов G к капсидному антигену и неструктурным белкам при острой и хронической инфекции, определить их значение для установления фазы инфекции, выявить взаимосвязь с активностями аланин- и аспартат-аминотрансфераз и наличием вирусной РНК в крови.
Определить направленность и уровень ВГС-специфических антител при элиминации вируса, произошедшей более 3-х лет назад.
Изучить изменения специфического гуморального иммунитета при проведении терапии интерфероном-альфа у людей с хроническим гепатитом С и оценить прогностическое значение этих изменений.
Исследовать специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом Сиу новорожденных детей, матери которых имеют маркеры ВГС-инфекции.
Установить критерии специфического гуморального ответа, которые можно использовать при определении исхода острого гепатита С, оценке эффективности противовирусной терапии, инфицированности новорожденных детей, матери которых имеют маркеры ВГС-инфекции, и при дифференцировании острой и хронической фазы инфекции.
Научная новизна работы
Впервые обнаружено, что для хронической ВГС-инфекции характерно более частое выявление специфических антител класса М (вторичных), чем для острой инфекции. Частота определения и титры специфических иммуноглобулинов М у больных с разными исходами острого гепатита С в первые два месяца инфекции были одинаковыми. Впервые установлена позитивная корреляция между величинами титра ВГС-специфических иммуноглобулинов М и наличием вирусной РНК в крови.
Показано, что как при остром, так и при хроническом гепатите С вырабатывают антитела к восьми линейным В-эпитопам оболочечных белков ВГС. Впервые обнаружено, что исход острого гепатита С не зависит от наличия антител на анализируемые эпитопы, хотя на три из них образуются вируснейтрализующие антитела. Впервые установлено, что при хроническом гепатите С достоверно чаще определяются иммуноглобулины G к СООН-концевому В-эпитопу первого гипервариабельного региона (ГВР) белка Е2, которые считаются вируснейтрализующими. Показано, что при остром и хроническом гепатите С формируются антитела, способные взаимодействовать с консенсусной последовательностью первого ГВР. Установлена динамика уровня антител, направленных на восемь линейных В-эпитопов оболочечных белков, при разных исходах острого гепатита С, при хроническом гепатите С и при проведении терапии интефероном-альфа.
Определена последовательность как появления иммуноглобулинов G ко всем вирусным антигенам при остром гепатите С, так и их исчезновения в случае при элиминации вируса. Впервые выявлены количественные различия между уровнем иммуноглобулинов G к капсидному антигену при остром и хроническом гепатите С. Установлен диапазон титров иммуноглобулинов G к неструктурным антигенам вируса при остром и хроническом гепатите С, показана динамика уровня этих антител при естественном и индуцированном интерфероном-альфа ограничении виремии.
Впервые установлены титры специфических антител у людей, перенесших острый гепатит С с элиминацией вируса более трех лет назад, наступившей либо самопроизвольно, либо вследствие терапии интефероном-альфа в острой фазе инфекции.
Исследован специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом С, обнаружены его особенности по сравнению с гуморальным ответом у взрослых больных. Впервые установлены два варианта динамики уровня анти-капсидных иммуноглобулинов G у новорожденных детей, матери которых имели маркеры ВГС-инфекции, и показано диагностическое значение контроля уровня этих антител.
Научно-практическая значимость работы
Полученные данные о гуморальном ответе на линейных В-эпитопы оболочечных белков свидетельствуют о раннем появлении антител на NH2-концевые детерминанты антигенов Е1 и Е2 при ОГС и о частом выявлении иммуноглобулинов G к вируснейтрализующему СООН-концевому эпитопу первого гипервариабельного региона. Как при острой, так и при хронической инфекции у большинства больных обнаружены антитела, взаимодействующие с консенсусной аминокислотной последовательностью 1-ого гипервариабельного региона. Эти данные актуальны для разработки вакцин против гепатита С с учетом вируснейтрализующих В-эпитопов оболочечных белков.
Определены последовательности появления и исчезновения иммуноглобулинов G против всех структурных и неструктурных антигенов вируса при разных исходах острого гепатита С, а также показана динамика уровня этих антител, что позволило разработать прогностические критерии развития персистентной инфекции или элиминации вируса.
Показана высокая иммуногенность вирусных белков, особенно капсидного антигена и сериновой протеазы/геликазы. Установлено, что титры иммуноглобулинов G к капсидному белку при острой и хронической инфекции имеют разный диапазон значений. Предложен иммуноглобулиновый критерий, облегчающий и уточняющий дифференциальную диагностику острого и хронического гепатита С, что особенно актуально при выборе оптимального курса терапии интерфероном-альфа.
Обнаружена позитивная корреляция между уровнем ВГС-специфических иммуноглобулинов М и наличием вирусной РНК в крови, между величинами титров антител класса G к капсидному антигену и к неструктурным белкам, определением вирусной РНК в крови и повышенным уровнем аланин-аминотрансферазы.
Мониторинг уровня ВГС-специфических иммуноглобулинов М и G в процессе противовирусной терапии, а также после ее окончания позволяет проводить контроль (более дешевый и более информативный, чем диагностика по вирусной нагрузке) за эффективностью лечения и длительностью позитивного результата.
Специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом С характеризуется меньшими титрами антител, чем у взрослых больных. У новорожденных детей, матери которых имели маркеры ВГС-инфекции, обнаружены два варианта динамики уровня антител класса G к капсидному белку. Динамические изменения титров этих антител можно использовать как дополнительный иммуноглобулиновый критерий при выявлении инфицированных вирусом гепатита С новорожденных детей.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты работы были частично включены в пособие для врачей «Диагностика и лечение хронических гепатитов В, С и D у детей», выпущенное Министерством здравоохранения Российской Федерации (Москва, 2003), и представлены на общедоступном ресурсе Интернет «Гепатит С: молекулярно-биологические и медико-социальные аспекты проблемы» (http: // ).
Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций и на практических занятиях для студентов 5-ых и 6-ых курсов кафедры детских инфекционных болезней с курсом вакцинопрофилактики ФУВ Российского государственного медицинского университета.
Результаты диссертации используются врачами 2-ой Клинической инфекционной больницы г. Москва в комплексе диагностических и прогностических критериев при ведении больных гепатитом С.
По данным, полученным при исследовании гуморального ответа на оболочечные белки, капсидный и неструктурные антигены, сконструирован лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы. Оформляется патент «Нанодиагностическая система для выявления вирусов гепатита».
Основные положения, выносимые на защиту
Специфические антитела класса М (вторичные) при гепатите С определяются как в острую, так и в хроническую фазу инфекции, но с разной частотой. В течение первых двух месяцев острого гепатита С не обнаружены различия в частоте выявления и титрах специфических иммуноглобулинов М при разных исходах острой фазы. Установлена позитивная корреляция между величинами титра этих антител и обнаружением вирусной РНК в крови.
Антитела класса G к восьми линейным В-эпитопам оболочечных белков Е1 и Е2 выявляются у людей с острым и хроническим гепатитом С. Исход острого гепатита С не зависит от наличия антител к этим В-эпитопам оболочечных белков, хотя на 3 из них образуются вируснейтрализующие антитела. При хронической инфекции достоверно чаще, чем при острой, обнаруживаются иммуноглобулины G на СООН-концевой эпитоп 1-ого гипервариабельного региона, антитела на который нейтрализуют связывание вируса с клеткой.
Специфические антитела класса G на оболочечные, капсидный и неструктурные антигены вируса гепатита С при острой инфекции появляются и исчезают, в случае элиминации вируса, в определенной последовательности. Обнаружены два варианта динамики титров специфических иммуноглобулинов G к капсидному белку и неструктурным белкам вируса в зависимости от исхода острого гепатита С.
Антитела класса G к нуклеокапсидному антигену выявляются при хроническом гепатите С в более высоких титрах, чем в острую фазу инфекции. Титры антител к неструктурным белкам при при хроническом гепатите С имеют широкий диапазон значений. Для всех белков вируса гепатита С кроме оболочечных характерна высокая иммуногенность. Установлена позитивная корреляция между величинами титров иммуноглобулинов G к капсидному и неструктурным белкам, наличием вирусной РНК в крови и повышенным уровнем аланин-аминотрансферазы.
Специфический гуморальный иммунитет после острого гепатита С, завершившегося элиминацией вируса, характеризуется отсутствием специфических иммуноглобулинов М и более узкой направленностью антител класса G, титры которых имеют низкие значения.
При проведении терапии интерфероном-альфа у людей с хроническим гепатитом С обнаружено снижение титров специфических антител класса М и G в случае позитивного результата лечения.
Специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом С имеет отличия от гуморального иммунитета взрослых больных. У детей, рожденных матерями с маркерами ВГС-инфекции, обнаружено два варианта динамики титров иммуноглобулинов G к капсидному белку в первый год жизни.
При ВГС-инфекции специфический гуморальный иммунитет (наличие антител на индивидуальные антигены вируса, их титр и динамика уровня) имеет определенную информационную значимость.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на XXVII и XXVIII научной конференции Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии (РФ, Москва, 1999, 2000); на II Всероссийской научно-практической конференции "Интернет и современное общество" (РФ, С.Петербург, 1999); на V и IX конференции "Гепатология сегодня" (РФ, Москва, 2000, 2004); на 10-ом Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и болезням печени (США, Атланта, 2000); на III научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)" (РФ, Москва, 2000); на конференции по Межведомственной научно-технической программе «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» (РФ, Геленджик, 2000); на 2-ом международном пептидном симпозиуме (США, Сан Диего, 2001); на IV и на V Российской научно-практической конференции "Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики" (РФ, Москва, 2001, 2003); на 5-ом Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (РФ, Москва, 2002); на VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (РФ, С.-Петербург, 2002); на II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы. Биотехнология и медицина» (РФ, Москва, 2003); на IV конгрессе детских инфекционистов России (РФ, Москва, 2005).
Диссертация апробирована на заседании межлабораторного Ученого совета ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН (протокол № 2 от 13 декабря 2005 г.) и в ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (протокол № 7 от 31 марта 2006 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 48 научных работ (в том числе 19 статей, из них 13 в центральных отечественных и зарубежных журналах, 23 тезиса докладов в журналах, материалах и сборниках тезисов и 6 тезисов) и одно пособие для врачей.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 260 страницах, содержит 58 таблиц (из них три таблицы в приложении) и 28 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (три главы), собственных исследований (пять глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Список литературы включает 442 источника (25 отечественных и 417 зарубежных).
Вирус гепатита С как представитель семейства Flaviviridae
Для представителей семейства Flaviviridae характерно взаимодествие с различными видами клеток, т.е. они имеют широкий клеточный тропизм [Westaway Е.С., 1987]. Детерминанты клеточного тропизма в основном локализованы в оболочечных белках, как например, у вируса японского энцефалита и вируса денге [Sumiyoshi Н. et al., 1995]. Установлено, что ВГС тоже имеет тропизм к различным клеткам. Вирус реплицируется в гепатоцитах, в периферических и асцитных мононуклеарных клетках, включая лимфоциты и моноциты [Afonso A.M., 1999; Okuda М. et al., 1999; Hsu C.-W. et al., 1999], в дендритных клетках [Laporte J. et al., 2003; Goutagny N. et al., 2003; Tsubouchi E. et al., 2004], в гематопоэтических клетках-предшественниках [Sansonno D. et al., 1998], в микроглии [Forton D.M. et al., 2004], в кардиомиоцитах [Matsumori A. et al., 1999], в кишечном эпителии [Deforges S. et al., 2004], в остеобластах [Kluger R. et al., 2005], в В-клеточных фолликулах лимфотических узлов [Pal S. et al., 2004].
Во всех родах семейства геном представлен плюс-цепью РНК и имеет размер от 9600 до 12300 нуклеотидных остатков. Как в первичной, так и во вторичной структуре РНК, выделенной от представителей трех родов, обнаружено много консервативных элементов [Thinner С. et al., 2004]. Геном кодирует одну рамку считывания, ограниченную с 5 - и 3 - конца НТО. Вирусные белки образуются после расщепления единственного полипротеина клеточными и вирусными сигнальными пептидазами [Ryan M.D.etal., 1998].
В семействе два механизма контроля репликации и трансляции. Первый характерен для рода Flivivirus. Вирусы этого рода имеют кэп-структуру I типа в 5 -концевой НТО и высоко структурированную 3 -концевую нетранслируемую область [Brinton М.А., Dispoto J.H., 1988]. При репликации РНК формируется кольцевая форма генома [Khromykh А.А. et al., 2001].
Второй тип контроля характерен для представителей родов Hepacivirus и Pestivirus. В данном случае трансляция инициируется IRES, локализованным в 5 -концевой НТО и имеющим очень много консервативных участков, особенно в доменах И, III, IV и в псевдоузле [Wang С. et al., 1995; Pestova T.V. et al., 1998]. IRES сформирован 300-350 нуклеотидными остатками [Pestova T.V. et al., 1998; Fletcher S.P. et al., 2002]. 3 -концевая НТО более короткая и менее структурирована, чем у рода Flivivirus. Как установлено недавно, у представителей родов Hepacivirus и Pestivirus тоже происходит циклизация генома, что свидетельствует в пользу гипотезы о существовании общего вируса-прародителя [Thurner С. et al., 2004]. Циклическую форму образуют комплементарные последовательности в области IRES и в зоне NS5b (Рис. 6). Рис. 6. Схема циклической формы генома у представителей рода Hepacivirus: ВГС (HCV) и вируса гепатита G (HGV) [Thinner С. et al., 2004]. Использовано сокращение и английская терминология: nt - нуклеотид; viral genome - вирусный геном.
Структура фрагмента генома, кодирующего полипротеин, имеет общие черты строения во всем семействе (Рис. 7). От N-концевой области полипротеина к С-концевой последовательно располагаются белки: [(Npro)] - капсидный - [(ргМ), (Ems)] -оболочечный [(El, Е2, р7)] -неструктурные белки (1,2,3,4а, 4Ь, 5а, 5Ь). В скобках отмечены специфичные для каждого рода белки. Функции связывания с рецептором и слияния с мембраной клетки-хозяина обнаружены в белках Е или Е1 и Е2. Предполагают, что гликопротеины Е1 и Е2 эволюционно произошли от белка Е путем дубликация участка гена, кодирующего этот полипептид, и появления специфических вставок, например, таких как 1-ый гипервариабельный регион у ВГС [Garry R.F., Das S., 2003]. Полипептид р7 эволюционно происходит из второго трансмембранного участка, характерного для рода Flivivirus. Белки Npro и Ems обнаружены только у представителей рода Pestivirus. В геноме представителей трех родов обнаружены сходные участки первичной и вируса желтой лихорадки (yellow fever virus); вируса клещевого энцефалита (tick-borne encephalitic virus); вирус гепатита С (hepatitis С virus); GB вируса С/ вируса гепатита G (GB virus С/ hepatitis G virus); нецитопатического пестивируса (pestivirus: non-cytopathic) [Thurner С. et al., 2004]. Прямоугольниками отмечены участки со сходной первичной и вторичной структурой генома.
Все представители семейства проникают в клетку путем слияния вирусной и клеточной мембран. Этот процесс индицирует пептид слияния. У представителей рода Flivivirus (вируса клещевого энцефалита и вируса денге) обнаружен внутренний пептид слияния II класса [Rey F.A. et al., 1995; Kuhn RJ. et al., 2002]. У представителей родов Hepaciviras и Pestivirus выявлен при протеомном анализе укороченный вариант внутреннего пептида слияния II класса [Garry R., Das S., 2003].
В первичной структуре оболочечных белков в семействе Flaviviridae, в частности у белка Е вируса клещевого энцефалита, Е1 вируса гепатита С и Е2 классического вируса лихорадки свиней обнаружены отдельные общие элементы, которые отмечены на рис. 9. Пептид слияния имеет сходную структуру: цистеиновые остатки на концах, в срединной части -ароматические и гидрофобные аминокислотные остатки. Сходство обнаружено в первичной структуре белка Е1 ВГС во фрагменте с аминокислотными остатками (АКО) 246-281 и белка Е вируса клещевого энцефалита в области с АКО 350-396, аналогично - в положении АКО 316-356 белка Е1 ВГС и в позициях АКО 496-544 белка Е вируса клещевого энцефалита [Garry R., Das S., 2003]. Элементы подобия отмечены на рис. 9 с указанием достоверности расчетов [Rey F.A. et al., 1995; Garry R.F., Das S., 2003].
Биологическое значение и эпитопы белков NS5a и NS5b
Белок NS5a не достаточно хорошо изучен. Он взаимодействует с многими клеточными белками, значение большинства этих контактов не установлено [Tellinghuisen T.L. et al., 2002]. Протеин NS5a фосфорилируется клеточными киназами по сериновым остаткам, обнаружены две формы белка с гипо- и гиперфосфорилированием. Биологическое значение этих форм белка не известно. Протеин NS5a ассоциирован с мембранами при помощи МН2-концевой амфипатической альфа-спирали и имеет три хорошо выраженных домена [Tellinghuisen T.L. et al., 2002; Lindenbach В., Rice СМ., 2005]. Все домены обладают регуляторной функцией, влияющей на эффективность репликации вирусной РНК и на процесс фосфорилирования белка NS5a.
Полипептид NS5b обладает активностью РНК-зависимой РНК-полимеразы [Behrens S.E. et al., 1996]. Инициация синтеза РНК может осуществляться как при помощи праймера, так и без него. Белок NS5b имеет типичную для "правосторонней" полимеразы структуру с каталитическим центром в домене «ладонь», окруженном доменами «большой палец» и «пальцами» (рис. 19) [Lin с. et al., 1995; Bressanelli S. et al., 1999]. Пространственная структура протеина NS5b и способность к de novo инициации напоминают полимеразу бактериофага фи 6 [De Francesco R., Migliaccio G., 2005].
«Пальцы» окружают активный центр и формируют канал для связывания РНК. Обнаружен участок для связывания ГТФ, который, вероятно, выполняет функцию аллостерического центра. В настоящее время активно ведутся работы по поиску ингибиторов полимеразы [De Francesco R., Migliaccio G., 2005]. Белок NS5b ассоциирован с мембранами ЭПР (рис. 11), на которых формируется репликативный комплекс [Quinkert D. et al., 2005].
В белке NS5a выявлены консервативные В-эпитопы, локализация которых представлена в таблице 9. Данных о В-эпитопах белка NS5b нет.
Итак, структура и функции белка NS5a изучены не достаточно полно. Для РНК-зависимой РНК-полимеразы, пространственная организация которой установлена недавно, еще не разработаны ингибиторы полимеразнои активности. В антигенах NS5a и NS4b выявлены В- и Т-клеточные эпитопы.
Вирус гепатита С инфицирует человека, если попадает в кровь [Feinstone S. et al., 1975; Fernandez J.L. et al., 2004; Mas A. et al., 2004; de Ledinghen V. et al., 2005], на поврежденные кожу и слизистые покровы [Ross R.S. et al., 1999; Nakayama H. et al., 2005], может передаваться при половых контактах и от матери к ребенку при беременности и родах, если происходит повреждение околоплодных оболочек и кожных покровов плода [Argentini С. et al., 1999; Conte D. et al., 2000; Steininger С et al., 2003].
Исход острой инфекции определяется иммунной системой организма-хозяина и тактикой размножения ВГС. Традиционно ключевую роль в борьбе вирус-макроорганизм отводили скорости размножения патогена. Но на примере ВГС и ВИЧ продемонстрирована еще одна возможность -появление новых генетических вариантов вируса. Среди появляющихся новых вариантов ВГС преимущество получают те, которые реплицируются с меньшей скоростью и имеют мутации в структуре эпитопов. В процессе развития острого гепатита С возникают очень сложные взаимоотношения вируса и организма-хозяина, детали которых еще не достаточно изучены.
Течение острой ВГС-инфекции исследовано в модельных экспериментах на шимпанзе [Abe К. et al., 1992; Bowen D.C., Walker СМ., 2005 (Nature); Dahari H. et al., 2005]. Обнаружено, что первое появление вирусной РНК в крови у зараженных животных наблюдалось через несколько дней после начала инфекции, достигая максимально высокого уровня на 6-10-ой неделе [Abe К. et al., 1992; Bowen D.C., Walker СМ., 2005 (Nature)].
При введении ВГС как внутривенно, так и непосредственно в печень выявлялось два пика виремии [Dahari Н. et al., 2005]. Первый пик РНК ВГС и всплеск уровня АлАТ связан с массовым выходом вирусных частиц из инфицированных клеток, а следующее за тем их снижение вызвано действием эндогенного интерферона I типа, под действием которого вирусная нагрузка уменьшилась почти на 90%. Через несколько недель наблюдался следующий всплеск виремии и подъем уровня АлАТ, что вызвано иммуноопосредованным цитолизом инфицированных гепатоцитов. Затем происходило постепенное снижение активности АлАТ и уровня РНК у всех животных. Около 40% инфицированных шимпанзе выздоравливают. Как считают Н. Dahari и соавторы, у этих жтвотных происходит нецитолическая элиминация вируса, которую обеспечивают эндогенный интерферон-альфа, Мх-белки и вируснейтрализующие антитела [Dahari Н. et al., 2005].
Типичные взаимоотношения инфицированного организма и ВГС в острой фазе инфекции укладываются в три варианта: быстрое развитие персистенции вследствие слабого контроля виремии, постепенное развитие хронической инфекции из-за частичного временного ограничения репликации вируса и успешный контроль иммунной системы над инфекцией (рис. 20). Первому варианту соответствует неспособность иммунной системы некоторых людей и шимпанзе генерировать достаточно высокий уровень специфических Т-хелперных и Т-киллерных лимфоцитов, а иногда наблюдается их полное отсутствие [Beach M.J., 1992; Cooper S. et al., 1999; Bowen D.C., Walker СМ., 2005 (Nature)]. Второй вариант наблюдается в случае позднего появления специфических Т-хелперных и Т-киллерных клеток. Третьему варианту соответствует мощный (интенсивный) и широкий по направленности ответ CD4+ и CD8+ Т- лимфоцитов. Чаще всего события развиваются по второму варианту.
Как установлено недавно, важную роль в ограничении ВГС-инфекции выполняют NK-клетки, которые являются компонентом неспецифического иммунитета [Trimme R. et al., 2001]. Изучая генетические факторы, под контролем которых находятся иммуноглобулин-подобные рецепторы (KIR) для киллерных клеток (аббревиатура KIR от «killer-cell immunoglobulin-like receptor»), S. I. Khakoo и соавторы установили, что люди, имеющие HLA-C1 и гомозиготные по аллели KIR2DL3, чаще выздоравливают при остром гепатите С (Р 0,0004) [Khakoo S.I. et al., 2004]. Авторы проанализировали генотипы 1037 людей, перенесших ОГС, из которых 352 человека выздоровели, у остальных развился хронический гепатит С.
Специфический Т-клеточный ответ при гепатите С
В формировании Т-клеточного иммунитета у каждого конкретного человека проявляются генетические особенности главного комплекса гистосовместимости (ГКГ). Гены ГКГ представлены 6 локусами: А, В, С, DR, DQ, DP - первые три из которых кодируют белки класса I и вторые три -белки класса II.
Белки ГКГ класса I экспрессируются в Т-лимфоцитах и других ядросодержащих клетках и выполняют важную роль в рестрикции межклеточных контактов. Т-киллерные лимфоциты имеют рестриктирующие элементы класса I и маркируются как CD8+ Т-лимфоциты. Белки ГКГ класса I связывают чужеродные антигены чаще всего в процессе биосинтеза в ЭПР, реже в протеосомах. У этих белков имеется специальный участок (так называемый «желобок») для связывания антигенов, который рассчитан на пептиды из 8-11 аминокислотных остатков. Поэтому величина Т-эпитопов не превышает 11 АКО.
Белки HLA класса II экспрессируются на В-лимфоцитах и макрофагах и необходимы для презентации антигенов и для осуществления межклеточных контактов. Т-хелперные лимфоциты имеют рестриктирующие элементы класса II и маркируются как CD4+ Т-лимфоциты.
Белки ГКГ класса II способны связывать вирусные и бактериальные антигены чаще всего в компартменте эндосомы-лизосомы. Связывающий «карман» этих белков способен захватить пептидный участок в 15-22 аминокислотных остатка. Иногда белки ГКГ класса II связывают цельный антиген, который затем подвергается протеолизу в основном с помощью катепсинов. У людей существуют индивидуальные генетические различия в наборе катепсинов и других протеолитических ферментов, поэтому возможна презентация разных фрагментов одного и того же антигена. Величина В-эпитопов не превышает 22-х аминокислотных остатков.
Т-хелперные лимфоциты распознают вирусные пептидные антигены, которые представлены на поверхности антиген-презентирующих клеток, рестриктированных белками ГКГ класса II. В зависимости от набора выделяемых цитокинов CD4+ Т-лимфоциты делят на две категории: Txl и Тх2. Первые продуцируют интерферон-гамма и интерлейкин 2, которые усиливают клеточный иммунный ответ и активность цитотоксических Т лимфоцитов. Популяция Тх2 после стимуляции выделяет интерлейкин 4 и интерлейкин 10, которые стимулируют В-клеточный иммунный ответ. CD4+ Т-лимфоциты выполняют главную роль в регуляции иммунного ответа.
Установлено, что при остром гепатите С в периферической крови присутствуют CD4+ Т-лимфоциты (мононуклеарные клетки периферической крови), активированные против различных вирусных антигенов [Leroux-Roels G. et al., 1996; Missale G. et al., 1996]. Анализ пролиферативного ответа Т-хелперных лимфоцитов выявил наличие Т-хелперных эпитопов во всех вирусных белках (табл. 2, 4, 6, 8, 10). При этом обнаружены широкие индивидуальные различия в Т-хелперном ответе в острой фазе инфекции [Diepolder Н.М. et al., 1995; Leroux-Roels G. et al., 1996; Lechner F. et al., 2000; Thimme R. et al., 2001]. У больных, перенесших острый гепатит С с выздоровлением, выявлен широкий по направленности (до 14 эпитопов) и интенсивный специфический Т-хелперный ответ [Geriach J.T. et al., 1999; Day C.L. et al., 2002; Schulze zur Wiesch J. et al, 2005]. Т-хелперный ответ у больных ОГС, у которых острая фаза инфекции перейдет в хроническую, узкий по направленности (всего на один или несколько эпитопов), слабый, с преобладанием цитокинового профиля Тх2-клеток [Tsai S.L. et al., 1997; Fan X.G. et al., 1998; Pham B.N. et al., 1995; Geriach J.T. et al., 1999; Thimme R. et al., 2001].
В настоящее время стало общепризнанным, что ключевая роль в исходе острого гепатита С принадлежит Т-хелперному ответу [Diepolder Н.М. et al., 1995; Pawlotsky J.M. et al., 1999; Cramp M.E. et al, 1999; Lechner F. et al., 2000; Семененко T.A., 2000; Lauer G.M. et al., 2004]. В пользу этого свидетельствует факт того, что снижение ответа CD4+ Т-лимфоцитов против антигенов ВГС в острой фазе предшествует развитию персистентной инфекции [Diepolder Н.М. et al., 1995; Pawlotsky J.M. et al., 1999; Lauer G.M. et al., 2004]. Еще один эксперимент подтверждает эту гипотезу: шимпанзе, дважды перенесшей ОГС с выздоровлением, перед третьим заражением вводили анти-С04+ иммуноглобулин, в результате - развилась персистентная инфекция [Shoukry N.H. et al., 2004]. В исследование C.L. Day и соавтров у экспериментально зараженных ВГС шимпанзе перед элиминацией вируса наблюдали увеличение количества эпитопов, распознаваемых CD4+ Т-лимфоцитами [Day C.L. et al., 2002]. Вероятно, существует набор Т-хелперных эпитопов, распознавание которых достаточно для ограничения инфекции, но он не включает все возможные эпитопы.
Считается, что наиболее важные Т-хелперные эпитопы локализованы в нуклеокапсидном антигене и в сериновой протеазе/хеликазе. Н.М. Diepolder и соавторы показали, что при остром гепатите С сильный пролиферативный ответ Т-хелперных лимфоцитов на антигены капсидный и NS3 наблюдается только у больных, у которых происходит элиминация ВГС [Diepolder Н.М et al., 1995]. Наиболее иммунодоминантный Т-хелперный эпитоп в сериновой протеазе/хеликазе локализован на участке с АКО 1248-1261. Он презентируется десятью наиболее распространенными DR аллелями ГКГ [Diepolder Н.М et al., 1995; 1997]. Два других доминантных эпитопа презентируются редкими DR аллелями ГКГ. В нуклеокапсидном белке выявлено несколько доминантных Т-хелперных эпитопов [Hoffmann R.M. et al., 1995; Leroux-Roels G. et al., 1996]. J. J. Lasarte и соавторы считают, что для элиминации ВГС, необходимо распознавание определенного набора доминантных Т-хелперных эпитопов в нуклеокапсидном белке [Lasarte J.J. et al., 1998]. Относительно наличия и роли Т-хелперных эпитопов в оболочечных белках нет единого мнения. J. Т. Geriach и соавторы считают, что эти эпитопы несущественны [Geriach J.T. et al., 1999].
Определение и титрование специфических иммуноглобулинов G к антигенам -капсидный, NS3,NS4ab и NS5a
Выявление специфических антител класса G к отдельным антигенам ВГС: нуклеокапсидному, NS3, NS4ab, NS5a - выполнялось в сертифицированных тест-системах ImmunoComb II HCV ("Orgenics" Ltd., Израиль) и РекомбиБест анти-ВГС - спектр (ЗАО "Вектор-Бест", РФ, Новосибирская обл., п. Кольцово), качество которых было положительно оценено в государственных испытаниях в 1999-2000 гг.
Первоначально сыворотки тестировались в тест-системе ImmunoComb II HCV, которая позволяла получать результаты анализа через 40 мин. В данной тест-системе используется методика твердофазного иммуно-сорбентного анализа, который выполняется на пластиковых зубцах, где сорбированы вирусные антигены в 2-х точечных зонах. В одной -нуклеокапсидный белок, в другой - антигены NS3 и NS4ab. Анализ сывороток выполнялся в соответствии с протоколом фирмы-производителя.
По данным разработчиков тест-системы РекомбиБест анти-ВГС спектр (персональное сообщение к.б.н. О.Н. Ястребовой) структура сорбированных антигенов соответствует аминокислотной последовательности белков субтипа 1а. Нуклеокапсидный антиген, входящий в состав иммуносорбента, состоит из НН2-концевой и срединной части полноразмерного белка (АКО 1-123) и включает в себя наиболее иммуногенные и консервативные В-эпитопы; антиген NS3 содержит 199 аминокислотных остатков из срединной иммуногенной части белка; антиген NS4ab - 154 аминокислотных остатков, содержащих генотип- и субтип-зависимые и консервативные В-клеточные детерминанты; антиген NS5a - 250 аминокислотных остатков, что соответствует наиболее иммуногенной части этого белка.
Перед проведением анализа лунки промывали 300 мкл фосфатно-солевого буфера с 0,1% твином 20. Предварительное титрование сывороток выполняли по авторской методике. Для этого в лунки вертикальных рядов 1, 5 и 9 вносили по 88 мкл раствора для разведения образцов, а во все остальные лунки - по 100 мкл. Затем в лунки вертикальных рядов 1, 5 и 9 вносили по 22 мкл анализируемых сывороток, разведение образцов 1/5. После тщательного перемешивания из лунок отбирали по 10 мкл и вносили их в соседние лунки по горизонтальному ряду, где титр уже составил 1/50. Схема внесения сывороток представлена в таблице 12.
Процедуру повторяли, в итоге в соседних лунках по горизонтальному ряду титр сывороток составил 1/500, а в следующих лунках вертикальных рядов 4, 8 и 12 разведение сывороток имело значение 1/5000. Дальнейшие этапы анализа и расчет пороговой ОП выполнялись в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. После определения предварительного титра сыворотки проводилось точное титрование образца с разведение в 2 раза.
Для определения антител к ВГС методом оптического биосенсора был использован двухканальный прибор типа "резонансное зеркало" IAsys plus и аминосилановые кюветы (Affinity Sensors, Labsystems, Англия). Анализ выполнен в ГУ Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН совместно с м.н.с. О.В. Гнеденко, асп. Н.И. Константиновой и д.б.н. Ю.Д. Ивановым. Центральное звено этого оптического биосенсора - измерительная кювета, схема которой представлена на рис. 22.
Дно измерительной кюветы состоит из стеклянной призмы и волновода с высоким показателем преломления (neh), которые разделены кварцем, формирующим среду с низким показателем преломления (nei). К чувствительной поверхности волновода был иммобилизован фрагмент нуклеокапсидного (кор) белка, в результате получен биочип. Структура фрагмента нуклеокапсидного белка и условия получения биочипа патентуются.
Регистрация комплекса антиген-антитело выполняется в результате последующих физических процессов. Луч лазера подается на границу призма-кварц под углом больше угла полного внутреннего отражения. Часть света при этом туннелирует через кварцевый слой при определенном резонансном угле падения и распространяется вдоль волновода, а затем туннелирует обратно и выходит из призмы. При резонансном угле падения излучения лазера на чувствительной поверхности волновода формируется поле затухающей световой волны, интенсивность которой экспоненциально падает с расстоянием от поверхности.
При добавлении в кювету анти-капсидных иммуноглобулинов G происходит образование комплекса антиген-антитело. В результате меняется показатель преломления среды в чувствительном слое и, соответственно, меняется резонансное положение угла излучения. Мониторинг изменения резонансного угла падения лазерного луча в зависимости от времени позволяет регистрировать образование комплекса антиген-антитело, происходящее в данный момент (так называемый анализ в реальном времени). После удаления сыворотки или раствора с антителами из кюветы и добавления стандартного фосфатно-солевого буфера с 0,1% твином 20 происходила диссоциация комплекса антиген-антитело. После нескольких промывок ФСБ с 0,1% твином 20 кювета была готова к следующему измерению.
В данной работе для контрольного тестирования были использованы моноклональные антитела СЕ 1, СЕЮ, СЕ 11, СЕ 12, CD11 к капсидному белку ВГС любезно предоставленные доктором биологических наук, профессором П. Г. Свешниковым (Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, Москва). Концентрацию фрагментов нуклеокапсидного белка перед иммобилизацией определяли по методу, описанному в пункте 4.5.
