Введение к работе
Актуальность проблемы
Пестивирусы - важные патогены КРС, овец и свиней, приносящие значительный экономический ущерб во всём мире. Пестивирусные инфекции вызывают различные расстройства, такие как проблемы воспроизводства, иммуносупресию, диарею, тромбоцитопению и часто протекают латентно. У беременных животных трансплацентарная инфекция может привести к аборту, мертворождению, уродствам и персистентной инфекции у потомков [Becher Р., et al.,2003; Сергеев В.А. и др., 2007].
В настоящее время классическая чума свиней (КЧС) и вирусная диарея КРС (ВД КРС) - заболевания, часто регистрируемые на территории России (и ряда других стран) и приносящие серьезный экономический ущерб промышленному животноводству. Так, потери стран ЕС в результате эпизоотии КЧС 1993-1998 гг. составили более 5 млрд. долларов. ВД КРС, вероятно самая распространенная вирусная болезнь жвачных, антитела к ней обнаруживают в сыворотке крови у 50-90% КРС во всем мире.
Род Pestivirus, входящий в семейство Flaviviridae, по современной классификации составляют 4 вида вирусов: вирус КЧС, вирус диареи КРС-1 и вирус диареи КРС-2, вирус пограничной болезни овец (ПБО) и пестивирус выделенный от жирафа (8-й доклад Международного комитета по таксономии вирусов, 2005). Вирусы данного рода представляют 7 антигенных групп: вирус КЧС, 2 вируса диареи КРС (ВД КРС-1 и ВД КРС-2), 3 группы вируса пограничной болезни овец (ПБО-1, ПБО-2, ПБО-3), и отдельную антигенную группу представляет штамм Н138, выделенный от жирафа в Кении [Paton D.J., et al., 2000].
Геном пестивирусов представлен однонитевой несегментированной молекулой РНК положительной полярности, длинной примерно 12,5 тыс. нуклеотидов. Меньшие или большие размеры обусловлены соответственно делециями или инсерциями. В 5' и 3'- концевых частях вирусной РНК содержатся нетранслируемые области размером около 400 и 350 нуклеотидов.
В соответствии с эпизоотологической важностью и затруднениями в диагностике пестивирусных инфекций, возникла потребность в разработке новейших методов быстрой детекции, идентификации вирусов, улучшении систем контроля циркуляции вирусов и молекулярного типирования. Применение методов молекулярной генетики значительно повысило уровень лабораторной диагностики и позволяет точнее охарактеризовывать существующие и появляющиеся новые вирусные изоляты [Vilcek S., Nettleton P.F., 2006].
Генетическую и антигенную вариабельность вирусов изучают методом филогенетического анализа, на основе сравнительного анализа определенных фрагментов геномов и аминокислотных последовательностей различных вирусных изолятов и сравнения их с рядом наиболее известных референтных штаммов. При анализе определённых фрагментов геномов в разных лабораториях, получают сходные, воспроизводимые результаты. Поэтому важно, чтобы во всём мире использовались стандартные методы исследований.
Типирование с моноклональными антителами и филогенетический анализ показали, что пестивирусы внутри вида могут быть отнесены в разные генетические группы и подгруппы [Paton D.J.et al., 2000; Lowings J.P. et al., 1996, Vilcek S., 2006]. Это создаёт возможность для изучения эволюции пестивирусов.
За рубежом созданы базы данных геномов вирусов, куда добавляются все вновь выделенные полевые изоляты. Это позволяет более полно видеть картину эпизоотического процесса, определять пути распространения вируса, и соответственно принимать меры по их пресечению. Необходимо создание в РФ базы данных пестививирусов, используя те же фрагменты геномов и другие биологические маркеры, что и во всем мире.
Сегодня, как и ранее, очень важно иметь наиболее полную информацию о циркулирующих на территории Российской Федерации штаммах вирусов КЧС и ВД КРС. Возможность точного генотипирования вирусных изолятов позволяет контролировать эпизоотологическую ситуацию по вызываемым данными вирусами заболеваниям, а также идентифицировать и определять происхождение новых изолятов вирусов.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось генотипирование и филогенетический анализ вакцинных и полевых изолятов пестивирусов (ВКЧС и ВД КРС), циркулирующих на территории РФ.
Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:
Создать системы праймеров для амплификации в ПЦР, и секвенирования фрагментов генома вирусов ВД КРС.
Выделить РНК из клеточных культур, зараженных различными изолятами вирусов ВД КРС и КЧС. Получить фрагменты кДНК трех фрагментов генома (ВД КРС: 5'-UTR (250 нуклеотидов), участок гена Е2 (800 нуклеотидов), и участок гена Npro (480 нуклеотидов); ВКЧС: 5'-UTR (149 нуклеотидов), участок гена Е2 (180 нуклеотидов), и участок гена NS5B (200 нуклеотидов)) вакцинных и вирулентных штаммов вирусов.
Определить нуклеотидную последовательность полученных фрагментов геномов вирусов ВД КРС и КЧС.
Провести филогенетический анализ изолятов вирусов, на основе полученных последовательностей.
Провести филогенетический анализ генетических подгрупп полевых изолятов вирусов КЧС и ВД КРС.
Определить нуклеотидную последовательность вакцинного штамма вируса КЧС ЛК-К, Покров.
Выработать предложения по проведению филогенетического анализа вируса КЧС, разработать методические указания.
Научная новизна и практическая значимость
Впервые на территории Российской Федерации среди аборигенных стад крупного рогатого скота был обнаружен нецитопатогенный биотип 2-го генотипа вируса ВД КРС.
Генетическим типированием 61-го изолята, вызывавших вспышки КЧС на территории России в 1980-2007 гг. показана их принадлежность к группе 1 (подгруппа 1.1, 1.2) и группе 2 (подгруппа 2.3). Филогенетический анализ изолятов на основе 180-нуклеотидной последовательности фрагмента гена Е2 показал, что в 80-е годы прошлого столетия превалировал вирус подгрупп 1.2, 2.3 и единичные случаи - 1.1; в 90-е годы до 2002 г. - 1.1 и единичный случай 2.3; в 2002-2007 гг. - подгруппы 2.3.
Определена нуклеотидная последовательность вакцинного штамма ЛК-К вируса КЧС, Покров.
4. Разработаны методические указания по индикации и штаммовой
дифференциации вируса классической чумы свиней с помощью ПЦР и
секвенирования фрагментов генов Е2, NS5B и 5'-нетранслируемой области.
Утверждены заседанием научного совета ГНУ Всероссийского научно-
исследовательского института экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.
Коваленко 16 июля 2009г., протокол №7.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Проведение филогенетического анализа изолятов вируса классической
чумы свиней за период с 1980 по 2007 год и филогенетический анализ изолятов
вируса диареи КРС, выделенных в 2006 и 2007 гг.
2. Подтверждение факта постепенного замещения циркулирующих
генетических групп вируса классической чумы свиней в Российской Федерации.
В 80-е, годы прошлого столетия превалировал вирус КЧС подгрупп 1.2, 2.3 и
единичные случаи - 1.1; в 90-е годы до 2002 г. - 1.1 и единичный случай 2.3; в
2002-2007 гг. - подгруппы 2.3.
Выявление факта циркуляции на территории Российской Федерации 2 генотипа вируса диареи КРС.
Определение нуклеотидной последовательности вакцинного штамма ЛК-К вируса классической чумы свиней.
5. Разработка комплекта реагентов и методических рекомендаций по
штаммовой дифференциации вируса классической чумы свиней с помощью
ПЦР и секвенирования фрагментов генов Е2, NS5B и 5' нетранслируемой
области.
Апробация работы
Основные положения работы были представлены на следующих научных конференциях:
«Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I.Vavilov», Киев, Украина, 20-22 сентября 2007 г.
«Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» - Москва, 22-25 сентября 2008 г.
«II Московский конгресс молодых ученых НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского», Москва, 23 апреля 2009 г.
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 24 сентября 2009 г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 2 докладов в материалах международных конференций.
Объем и структура диссертации
