Введение к работе
Актуальность темы. Острые кишечные инфекции (ОКИ) являются одной из важных проблем здравоохранения как в развивающихся, так и в развитых странах. ОКИ могут быть вызваны патогенными и условно-патогенными бактериями, простейшими и вирусами. Особое значение ОКИ имеют для детей раннего возраста, у которых в связи с незрелостью системы гомеостаза наиболее часто возникают состояния, угрожающие жизни. По данным ВОЗ в мире регистрируется ежегодно около 700 миллионов случаев ОКИ, и ежегодно смертность, ассоциированная с гастроэнтеритами, составляет более 3-х миллионов (Wilhelmi et al., 2003). Ввиду социальной значимости острых кишечных инфекций человека актуальным является эпидемиологический мониторинг вызывающих их этиологических факторов.
Астровирус человека (HAstV) по данным зарубежных исследователей является второй по значимости причиной вспышек ОКИ в таких регионах, как Юго-Восточная Азия, Северная и Латинская Америка, а вклад в спорадическую заболеваемость варьирует от 4 до 17% в различных регионах (Palombo et al., 1996; Pang et al., 1999; Naficy et al., 2000; Bhattacharya et al, 2006; Nguyen et al., 2008; Guo et al., 2010). В Российской Федерации санитарно-эпидемиологический контроль астровирусной инфекции не проводится.
Важной частью эпидемиологического мониторинга вирусного заболевания является установление циркулирующих серотипов/генотипов вируса, доминирующих в данное время в конкретном географическом районе. Происходящие в человеческой популяции смена или появление новых серотипов HAstV также требуют детального изучения их геномов. Исследование изменчивости геномов этого патогена важно для прогнозирования появления новых вариантов вируса, кроме того этот анализ может пролить свет на распространение и эволюцию астровирусов.
Систематические исследования астровирусной инфекции и
молекулярно-генетического разнообразия изолятов HAstV,
циркулирующих на территории Российской Федерации, начаты недавно. В Западно-Сибирском регионе такие исследования начаты нами в 2005 г.
Цель работы - комплексное исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов астровируса человека, выявленных в Новосибирске.
Задачи исследования:
- оценить этиологическую значимость астровирусов в структуре ОКИ у детей раннего возраста и эпидемические особенности астровирусной инфекции;
- исследовать молекулярно-генетическое разнообразие изолятов
астровируса человека, выявленных с 2003 по 2010 гг.;
- определить нуклеотидные последовательности геномов изолятов
астровируса человека, принадлежащих к редко встречающимся генотипам;
провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и оценить скорость изменчивости генома астровируса человека.
Научная новизна. Впервые проведено многолетнее комплексное молекулярно-эпидемиологическое исследование астровирусной инфекции у детей раннего возраста в Новосибирске. Установлено, что HAstV являются относительно редкой этиологической причиной ОКИ у детей раннего возраста в Новосибирске, но их вклад в этиологию этого заболевания может резко возрастать в отдельные эпидемические периоды. Получены новые данные, свидетельствующие о распространенности астровирусной инфекции в сочетании с кишечными инфекциями другой этиологии.
Впервые проведено исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов HAstV, циркулирующих в Новосибирске. Выявлено доминирование изолятов астровируса первого генотипа, показано постепенное изменение спектра генетических линий этого генотипа с течением времени.
Определены нуклеотидные последовательности полных геномов трех изолятов астровирусов третьего генотипа и изолята астровируса шестого генотипа. Впервые установлена скорость изменчивости генома HAstV, продемонстрировано, что она в целом соответствует скорости изменчивости для вирусов с РНК геномом. Филогенетический анализ показал, что российские изоляты третьего генотипа вероятно дивергировали от общего предшественника около 20 лет назад.
Практическая значимость. Проводившееся оперативное выявление этиологической причины ОКИ у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику, позволило врачам этой клиники оптимизировать курс лечения, что сокращало время пребывания пациентов в стационаре и снижало стоимость лечения.
Результаты проведенного исследования позволили определить этиологическую причину в случаях, ранее относившихся к кишечным инфекциям неустановленной этиологии (КИНЭ). Полученные данные включены в статистические отчеты детской городской клинической больницы №3 и вошли в Государственные доклады о санитарно-эпидемиологической обстановке на территории Новосибирской области.
Многолетний мониторинг генетического спектра циркулирующих изолятов HAstV является актуальным ввиду социальной значимости ОКИ, а исследование изменчивости геномов этого патогена важно для прогнозирования появления новых эпидемически значимых вариантов HAstV.
Результаты проведенных исследований будут использованы для подготовки практических рекомендаций для клиницистов, специалистов СЭС и эпидемиологов по контролю и профилактике вирусных кишечных инфекций и внедрению современных методов диагностики.
Положения, выносимые на защиту.
Астровирус человека является третьей по значимости этиологической причиной спорадических случаев ОКИ у детей раннего возраста в Новосибирске.
В Новосибирске циркулируют преимущественно изоляты астровируса человека первого генотипа, при этом с течением времени происходит постепенная смена спектра генетических линий этого генотипа. Вторыми по встречаемости являются изоляты второго генотипа астровируса человека.
Скорость эволюции генома астровируса человека в целом соответствует скорости изменчивости для вирусов с РНК геномом.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 статей. Результаты работы были представлены на 5-ти российских и 3-х международных конференциях: Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней», Новосибирск, 2005; Ш Российская научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2006; Российская научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней», Москва, 2007; XLV Международная Научная Студенческая Конференция, Новосибирск, 2007; Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика», Новосибирск, 2009; 81 International Symposium on Positive-Strand RNA Viruses, Washington DC, USA, 2007; 26th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID), Graz, Austria, 2008; 9th International Symposium on Positive-Strand RNA Viruses, Atlanta, USA, 2010.
Вклад автора. Выявление РНК астровирусов методом ОТ-ПЦР, определение генотипической принадлежности выявленных изолятов и филогенетический анализ осуществлялись автором лично. Дизайн олигонуклеотидных праймеров для определения полных нуклеотидных последовательностей геномов изолятов астровируса человека, секвенирование полных последовательностей геномов изолятов
астровирусов и анализ полученных последовательностей также проводился автором лично. Выделение препаратов РНК из лизированных образцов фекалий осуществлялось соискателем совместно с к.б.н. Е.В. Жираковской, к.м.н. С.А. Бодневым и С.Н. Соколовым. Расчет скорости эволюции генома астровируса человека проводился совместно с к.б.н. И.В. Бабкиным.
Диссертационная работа выполнялась с 2005 по 2008 гг. в Лаборатории разработки средств экстренной профилактики ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в рамках выполнения проекта МНТЦ №2935р, а с 2008 по 2011 гг. в Лаборатории молекулярной иммунологии ИХБФМ СО РАН и в Лаборатории бионанотехнологий НИЧ НГУ в рамках гранта НШ-65387.2010.4 по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации и госконтракта № 02.740.11.0767 «Выявление вирусных возбудителей заболеваний, актуальных для здравоохранения Западной Сибири (гепатиты, гастроэнтериты, серозный менингит), изучение их генетического разнообразия в целях разработки и совершенствования диагностикумов»
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", главы "Результаты», главы «Обсуждение результатов", выводов и списка литературы. Библиография включает 161 публикацию. Работа проиллюстрирована 29 рисунками и включает 8 таблиц. Кроме этого, в работе содержится два приложения.
