Введение к работе
Актуальность проблемы
Мобильные генетические элементы составляют значительную часть геномов большинства эукариот. Они занимают свыше 50% ДНК человека, тогда как последовательностям экзонов функциональных генов принадлежит лишь 3-5% генома. Ретроэлементы (РЭ), считаются единственной транспозиционно активной группой мобильных элементов млекопитающих. Их распространение происходит в результате обратной транскрипции РНК-матрицы с образованием кДНК-копии элемента, которая затем интегрируется в новое место генома. РЭ делят на две группы: LTR-coдержащие и LTR-не содержащие ретроэлементы (LTR - Long Terminal Repeat). Эндогенные ретровирусы (ЭРВ) и LINE-элементы (Long Interspersed Nuclea Elements, LINE) принадлежат группам содержащих и не содержащих LTR РЭ соответственно и являются автономными мобильными элементами (т.е. кодируют белки, необходимые для обратной транскрипции и встраивания в геном).
ЭРВ имеют строение, аналогичное строению обычных ретровирусов и, как считается, представляют собой остатки активных миллионы лет назад ретровирусов, закрепившихся в геноме путем инфицирования клеток зародышевой линии. В геномах ЭРВ представлены провирусами, а также одиночными LTR. LTR ЭРВ содержат функциональные энхансеры, промоторы и сигналы полиаденили-рования. Семейство ЭРВ HERV-K (HML-2) уникально тем, что содержит человек-специфические элементы (чсЭРВ), а также является одним из самых биологически активных ретровирусных семейств генома человека.
Ретротранспозоны LINE являются наиболее многочисленной группой автономных мобильных элементов в геномах млекопитающих. Так, например, в геноме человека ретротранспозоны LINE-1 (L1) представлены более чем 500.000 копий, занимающих -17% геномной ДНК. Полноразмерный L1 имеет длину 6-7 тысяч пар оснований и состоит из 5'-нетранслируемой области (5' НТО) и двух открытых рамок считывания (ОРС). Транскрипция мРНК L1 управляется уникальным внутренним промотором РНК-полимеразы II расположенным в 5'НТО ретротранспозона. Механизм действия этого промотора пока остается неясным.
РЭ являются важнейшими регуляторами структуры и функции геномов, поэтому разработка новых методов поиска транскрипционно-активных РЭ, анализ их промоторной активности в контексте геномного окружения, а также ис-
следование структурной организации их промоторов являются важными и актуальными задачами современной молекулярной биологии.
Цели и задачи исследования
Целями данной работы являлось детальное изучение транскрипционной активности человек-специфичных ЭРВ, а также исследование уникального внутреннего промотора ретротранспозона LI.
Были поставлены следующие задачи:
разработать метод полногеномной идентификации транскриптов, промоторами которых служат геномные повторы, с его помощью осуществить полногеномное картирование транскрипционно-активных чсЭРВ.
провести сравнительный анализ промоторной активности чсЭРВ в двух типах тканей - нормальной и соответствующей ей раковой.
картировать точку начала транскрипции в составе LTR чсЭРВ.
при помощи метода делеционного картирования выявить участки 5' НТО L1, имеющие наибольшие влияние на промоторную активность ретротранспозона.
определить положение точек начала транскрипции в 5' НТО L1 с делети-рованным «минимальным промотором».
Научная новизна и практическая ценность работы.
Разработан метод полногеномной идентификации транскрипционно-активных повторяющихся элементов - GREM (англ. Genomic Repeat Expression Monitor - GREM). Метод GREM применим как для качественной, так и для количественной оценки промоторной активности исследуемой группы повторяющихся элементов.
С использованием GREM впервые проведено полногеномное картирование промоторно-активных чсЭРВ и показано, что по крайней мере 50% чсЭРВ являются транскрипционно активными. Выявлено снижение активности 3'-провирусных чсЭРВ в случае их расположения в непосредственной близости от генов или в интронах генов. Показана повышенная транскрипционная активность 5'-провирусных LTR чсЭРВ по сравнению с одиночными и 3'-провирусными LTR независимо от ткани.
Проведено картирование альтернативной, отличающейся от канонической, точки начала транскрипции в LTR чсЭРВ. Показано преимущественное исполь-
зование найденной точки начала транскрипции для экспрессии генов провируса чсЭРВ.
С использованием метода делеционного картирования показано, что наиболее важным регуляторным участком 5' НТО L1 является область +390...+526, а не «минимальный промотор», как считалось ранее. Проведено картирование точки начала транскрипции в 5' НТО с делецией «минимального промотора» L1 и показано, что в этом случае происходит смещение старта транскрипции с +1 нуклеотида 5' НТО в её 3'- конец или в самое начало ОРС1 L1. Сделано предположение о роли внутренней области 5' НТО L1 в инициации транскрипции, что может способствовать пониманию механизмов инициации транскрипции не содержащих ТАТА-бокс промоторов.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III международной конференции, посвященной Н.В. Тимофееву-Ресовскому «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Украина, Алушта, 9-14 октября 2010 г.).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 2 тезиса докладов на конференциях.
Структура и объем диссертации.
