Введение к работе
Актуальность проблемы.
Среди многочисленных природных источников биологически активных молекул, царство бактерий занимают особое место. Вторичный метаболизм этих вездесущих обитателей нашей планеты является практически неиссякаемым источником новых химических соединений, находящих широкое применение в органической химии, агрохимии и медицине. Являясь “системообразующими элементами” сложных биоценозов, бактерии обладают индивидуальным паттерном взаимодействия с окружающим биотическим компонентом, посредством синтеза и передачи “химических эффекторов”, конечными акцепторами которых являются как про- так и эукариотические клетки. Именно среди таких “эффекторных” вторичных метаболитов бактерий были найдены разнообразные антибиотики (включая фунгициды и инсектициды), иммунодепрессанты, антиоксиданты, противоопухолевые цитостатики и антидиабетические препараты (, ).
В отличие от биологически активных веществ растений, единственным способом промышленного производства которых в большинстве случаев является их экстракция с последующей дорогостоящей очисткой, аналогичные соединения бактериального происхождения могут быть эффективно синтезированы с помощью современных методов генной/метаболической инженерии непосредственно в клетках бактерии-источника и/или других микроорганизмов, широко используемых в биотехнологии: E. coli, B. subtilis, C. glutamicum (, , , , ).
Одним из примеров такой биотехнологической “редукции” является создание штамма E. coli, способного к эффективной биотрансформации L-изолейцина в 4-гидроксиизолейцин (4-HIL) (). 4-HIL является биологически активным веществом растительного происхождения, которое обладает свойствами регулятора синтеза глюкозы в адипоцитах, секретагога и сенсибилизатора действия инсулина, а также, инсулиномиметика (, , ). Ключевым этапом данной работы было клонирование гена L-изолейцин-4-гидроксилазы (IDO) из природного изолята Bacillus thuringiensis (). В ходе дальнейших исследований выяснилось, что в отличие от фенугрека (Trigonella foenum-graecum L.), клетки которого накапливают 4-HIL, в Ваcillus thuringiensis 4-HIL является промежуточным соединением в синтезе вторичного метаболита 2-амино-4-кето-3-метил-пентановой кислоты (АМКП), проявляющей свойства антибиотика (, ).
IDO является членом Pfam-семейства белков PF10014 (другое свое название - BsmA, семейство получило от одноименного фактора формирования биопленок и стрессоустойчивости из E. coli), насчитывающим около 200 известных гомологов IDO в диапазоне изменения величины E (параметр BLAST) от 710-179 до 1. Белки семейства PF10014 широко распространены среди бактерий, занимающих разные экологических ниши и обладающих различными типами метаболизма: от метилотрофных морских анаэробных бактерий, до агрохимически значимых фитопатогенов. Этот факт позволил нам предположить, что диоксигеназы семейства PF10014 обладают не менее широким диапазоном регио/субстратной специфичности, включая способность гидроксилировать свободные канонические L-аминокислоты.
Актуальность проблемы поиска новых гидроксилаз свободных L-аминокислот определяется следующими основными факторами.
Во-первых, учитывая уникальные свойства 4-HIL, можно предположить, что и другие гидроксилированные L-аминокислоты могут проявлять агрохимически значимую антибиотическую активность и/или обладать уникальными фармакологическими свойствами.
Во-вторых, гидроксилированные по метильным и метиленовым группам свободные L-аминокислоты могут быть использованы в тонкой химической технологии/нанотехнологии в качестве новых биогенных синтонов для органического синтеза ().
В-третьих, предложенная нами ранее биотехнология гидроксилирования L-изолейцина методом динамической биотрансформации, позволяет существенно упростить синтез целевых продуктов при наличии соответствующих Fe(II)/a-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ (). Таким образом, любая новая диоксигеназа, синтезирующая новую, биологически активную гидроксилированную аминокислоту, может быть непосредственно использована для ее промышленного синтеза с помощью указанного выше метода.
И, наконец, учитывая, что 65–85% патогенных микроорганизмов образуют устойчивые биопленки резистентные ко многим антибактериальным препаратам и/или физическим факторам воздействия, представляется актуальным поиск новых биогенных “факторов разрушения” этих опасных бактериальных агломератов. Кроме того, изучение белков, участвующих в работе биоценотической сигнальной и/или эффекторной цепи, может привести к неожиданным открытиям и гипотезам в области молекулярной биологии взаимодействия между разными биологическими доменами: например, бактериями и растениями, или бактериями и насекомыми.
Цели и задачи работы.
Целью данной диссертационной работы являлся поиск новых Fe(II)/a-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот.
В ходе работы решались следующие задачи:
Эвристический поиск вероятных Fe(II)/a-кетоглутарат-зависимых диоксигеназ свободных L-аминокислот среди белков Pfam семейств PF10014 и PF13640 методами современной биоинформатики; клонирование и экспрессия селектированных генов в E. coli, очистка соответствующих ферментов.
Биохимический анализ активности очищенных белков: определение их субстратной специфичности и кинетических параметров; очистка и идентификация продуктов реакций.
Научная новизна и практическая значимость работы.
На основании эвристического анализа семейства белков PF10014 были найдены и охарактеризованы новые Fe(II)/a-кетоглутарат-зависимые диоксигеназы, катализирующие С-4-гидроксилирование L-изолейцина, L-лейцина, L-треонина, С-5 гидроксилирование L-лейцина и окисление L-метионина до сульфоксида L-метионина. Кинетические параметры найденных диоксигеназ теоретически позволяют использовать эти ферменты для синтеза соответствующих гидроксиаминокислот по методу, описанному в работе ().
Было показано, что экспрессия гена L-треонин-4-гидроксилазы из фитопатогена Agrobacterium vitis S4 в штамме E. coli c инактивированным геном дегидрогеназы 4-фософоэритроновой кислоты (pdxB) восстанавливает рост клеток на минимальной солевой среде, без добавления витамина B6. Было установлено, что данный эффект строго зависит от способности штамма E. coli (DpdxB) синтезировать эндогенный L-треонин. Данный результат позволяет предположить существование нового, эритрозо-4-фосфат-независимого пути биосинтеза витамина B6.
На основании анализа генетической организации оперонов, включающих гены белков семейства PF10014 из фитопатогенных бактерий родов Pantoea и Pseudomonas, было предсказано и экспериментально доказано существование новой L-изолейцин-4’-гидроксилазы, принадлежащей к не охарактеризованному до сих пор Pfam семейству белков PF13640 и новой L-4’-гидроксиизолейцин-4-гидроксилазы из семейства BsmA. Было показано, что оба фермента образуют уникальный окислительный каскад, приводящий последовательно к синтезу L-4’-гидроксиизолейцина и L-4’,4-дигидроксиизолейцина - новых биогенных гидроксилированных форм L-изолейцина.
На основании полученных результатов выдвинут ряд гипотез о физиологической роли С-4-гидроксилирования свободных L-аминокислот в бактериях, экспериментальное подтверждение которых будет иметь большое практическое и теоретическое значение.
Публикации и апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в научных журналах, входящих в перечень ВАК РФ, оформлена 1 патентная заявка РФ №2011144625, с решением о выдаче патента от 4 июля 2012 г. Материалы, вошедшие в диссертацию докладывались автором на конкурсе работ молодых сотрудников ЗАО «АГРИ» (июль 2010, июнь 2012) и были представлены им на двух конференциях (Москва, Россия, 2009; Daegu, Republic of Korea, 2012).
Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП ГосНИИгенетика и НТС ЗАО «АГРИ» 9 октября 2012 года.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на 110 страницах, включая 40 рисунков и 11 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 150 источников.
