Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени известно, что калицивирусы человека (семейство Caliciviridae, род Norovinis, род Sapovims) являются причиной острого гастроэнтерита у детей и взрослых, при этом норовирусы обусловливают возникновение эпидемий острого гастроэнтерита в различных странах fde Wit, 2001; Green, 1997]. По данным зарубежных исследователей до 90% вспышек ОКИ могут быть ассоциированы с норовирусами [Fankhauser, 2002]. В то же время роль представителей семейства калицивирусов в возникновении спорадических случаев острого гастроэнтерита требует дальнейшего изучения.
Ежегодно норовирусы вызывают 64 000 эпизодов диареи, требующих госпитализации, 900 000 посещений клиник детьми в развитых странах и до 200 000 смертельных случаев детей в возрасте до 5 лет в развивающихся странах [Patel, 2008]. Исследования последних лет показывают, что значение норовирусной инфекции в кишечной патологии детей первых лет жизни было недооценено во всем мире [Koopmans, 2008]. Все вышеизложенное определяет современное внимание к калицивирусам в плане изучения их разнообразия и значимости отдельных геновариантов в возникновении острого гастроэнтерита у детей, конечной целью которого является разработка норовирусной вакцины [Atreya, 2004; Duizer, 2004].
Геном калицивирусов характеризуется уникальной вариабельностью нуклеотидной последовательности. Так, среди представителей норовирусов отмечают низкую гомологию нуклеотидных последовательностей отдельных генов -36% по гену хеликазы и 53-64% по гену полимеразы [Matsuno, 1997; Vinje, 2000; Wang, 1994]. Несомненно, это затрудняет разработку универсальной тест-системы для обнаружения РНК калицивирусов человека. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генома среди норовирусов выделяют семь геногрупп (GI-GVII), из которых только представители геногрупп I, II и IV патогенны для человека. При этом среди норовирусов наиболее распространенной второй геногруппы идентифицируют 23 генотипа [Phan, 2007]. Саповирусы классифицированы в пять геногрупп (GI-GV), из которых представители геногрупп I, II, IV и V инфицируют людей [Hansman, 2005].
Изучение капицивирусной инфекции в России носит фрагментарный характер. К началу наших исследований показана циркуляция калицивирусов на территории г. Москвы и г. Санкт-Петербурга, где частота обнаружения калицивирусов у детей, госпитализированных с ОКИ составила 6,4% и 12,6%, соответственно [Мухина, 2002; Сироткин, 2003]. Данные о молекулярно-биологической характеристике циркулирующих штаммов были представлены только для г. Москвы 2001-03 гг. [Мухина, 2002; Подколзин, 2004]. Недостаточно изучены распространенность отдельных генотипов калицивирусов на различных территориях России. Отсутствуют сведения о геновариантах норовирусов и временных особенностях их циркуляции. В связи с вышеизложенным представляло научно-практический интерес проведение
исследований по изучению молекулярно-биологических свойств калицивирусов (норовирусов, саповирусов) и особенностей их циркуляции среди детей Нижегородской области.
Цель исследования: изучение генетического разнообразия калицивирусов человека и анализ особенностей циркуляции их геновариантов среди детей Нижегородской области в 2003-08 гг.
Задачи исследования:
Оптимизировать методику ПЦР для универсальной детекции калицивирусов человека (норовирусов и саповирусов различных генотипов).
Провести обнаружение калицивирусов у детей, госпитализированных с острой кишечной инфекцией, оценить распространенность калицивирусов на территориях Нижегородской области.
Провести генотипирование выявленных калицивирусов с использованием ПЦР NvGI/GlI. Определить их относительное распределение и возрастную группу риска.
Установить первичную структуру фрагментов генома выделенных изолятов калицивирусов, идентифицировать геноварианты.
6. Изучить филогенетические отношения нижегородских вариантов калицивирусов и
штаммов калицивирусов, выделенных на других территориях земного шара.
7. Провести анализ частоты обнаружения калицивирусов (норовирусов) в
многолетней и годовой динамике.
Научная новизна и практическая значимость работы: Разработан способ выделения РНК кишечных вирусов, в том числе калицивирусов, для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции, позволяющий избежать возможного ингибирования реакции. Научная новизна подтверждена патентом (Патент № 2313792 от 27.12.2007, приоритет от 10.04.2006.). Способ используется при проведении научно-исследовательской работы по изучению кишечных вирусов в ФГУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (Акт внедрения от 05.02.09).
Оптимизирован метод ПЦР для универсальной детекции норо- и саповирусов, что позволило провести скринииговые исследования на большой выборке по обнаружению калицивирусов человека, циркулирующих на территории Нижегородской области. Методические разработки могут стать основой создания тест-системы на основе ПЦР для универсальной детекции РНК калицивирусов человека.
Впервые показана выраженная гетерогенность нижегородской популяции качицивирусов человека, которая в 2004-08 гг. была представлена как минимум норовирусами геногруппы I, норовирусами геногруппы II (генотипы Gll.b, G1I.2, GI1.6, GII.7, GII.4 - варианты 2006а, 2006b, Н.Н.2008) и саповирусами геногрупп I (GI.l, GI.2) и II (СИЛ).
Идентифицирован новый вариант норовирусов - NvGII.4-H.H.2008. Различия в нуклеотидной последовательности с другими вариантами NvGII.4 составили 4,7%-
8,4%, N/S регион данного варианта имеет аминокислотные замены в позициях (по вирусу Lordsdale): 1709-PnaQ, 1738-А на V, 1741-М паї, 1771-LHaD.
Установленные нуклеотидные последовательности норовирусов депонированы в GenBank под номерами EU620235 - EU620247, FJ743692 - FJ743694, что расширяет международную базу иуклеотидных последовательностей генов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу и белок капсида калицивирусов человека.
В процессе работы была установлена этиологическая роль калицивирусов в возникновении 294 эпизодов острого гастроэнтерита. Результаты исследований оперативно сообщались лечащим врачам для выбора адекватной стратегии лечения детей (Акт внедрения от 30.01.09) и ежеквартально направлялись во ФГУЗ «Центр ГиЭ в Нижегородской области» и Управление Роспотребнадзора по Нижегородской области, где использовались для расчета доли ОКИ установленной этиологии в официальной статистике инфекционной заболеваемости в Нижегородской области (Акт внедрения от 11.02.09.).
Составлен аналитический обзор «Роль калицивирусов в кишечной патологии детей и взрослых», который может быть использован при подготовке нормативно-методических документов Роспотребнадзора (письмо ФС Роспотребнадзора от 14.11.06 №0100/12159-06-26).
Основные положения, выносимые на защиту:
Калицивирусы широко распространены на территории Нижегородской области.
Нижегородская популяция калицивирусов представлена как минимум норовирусами геногруппы I, геногруппы II генотипов GILb, GII.2, G1I.6, GII.7 и GII.4 (вариант 2006а, 2006b, Н.Н.2008) и саповирусами геногруппы I (GI.l, GI.2) и геногруппы II (GII.1).
Особенностью циркуляции норовирусов в г. Нижнем Новгороде в 2006-08 гг. явилось доминирование NvGII.4, последовательная смена его геновариантов.
Апробация работы:
Основные положения диссертации доложены и обсуждены:
на заседании Нижегородского отделения научного биохимического общества (г. Нижний Новгород, 2006 г.);
на четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2008 г.)
на заседании общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Нижний Новгород, 2008 г.)
на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (п. Оболенск, Московской области, 2009 г.).
на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института.
Объем и структура диссертации:
