Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Общие сведения о паратуберкулезе 9
2.2. Возбудитель паратуберкулеза и его устойчивость во внешней среде 19
2.3. Методы выявления источников возбудителя паратуберкулеза крупного рогатого скота 27
2.3.2. Аллергическое исследование 28
2.3.3. Серологические исследования 35
2.3.4. Бактериоскопическое исследование фекалий и соскобов со слизистой оболочки прямой кишки 41
2.3.5. Культуральный метод исследования фекалий и соскобов со слизистой оболочки прямой кишки 42
2.3.6. Патоморфологический метод 43
2.3.7. Культуральный метод исследования патологического материала 45
3. Собственные исследования 51
3.1. Материалы и методы исследований 51
3.2. Результаты исследований 55
3.2.1. Оптимизация условий адаптации культур Mycobacterium paratuberculosis к росту на жидких питательных средах для накопления бактериальной массы 55
3.2.2.Изготовление и испытание аллергенов для диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота 60
3.2.2.1. Изучение специфичности и активности йонина, приготовленного из культуры «А» микобактерий паратуберкулеза 61
3.2.2.2. Результаты испытания йонинов, полученных из клеточных оболочек и цитоплазмы микобактерий паратуберкулеза 74
3.2.2.3. Результаты сравнительного изучения йонинов, полученных по методу Е.С.Орлова и по методике ВИЭВ 78
3.2.2.4. Результаты испытания йонинов, альт- и ППД-туберкулинов для птиц на крупном рогатом скоте хозяйств с различным эпизоотическим статусом. 4. Обсуждение результатов исследований 104
5. Выводы 115
6. Практические предложения 117
7. Список использованной литературы 118
8. Приложение
- Методы выявления источников возбудителя паратуберкулеза крупного рогатого скота
- Бактериоскопическое исследование фекалий и соскобов со слизистой оболочки прямой кишки
- Оптимизация условий адаптации культур Mycobacterium paratuberculosis к росту на жидких питательных средах для накопления бактериальной массы
- Результаты испытания йонинов, полученных из клеточных оболочек и цитоплазмы микобактерий паратуберкулеза
Методы выявления источников возбудителя паратуберкулеза крупного рогатого скота
Паратуберкулез (паратуберкулезный энтерит, болезнь Johne) -инфекционная, хронически протекающая болезнь жвачных, преимущественно крупного и мелкого рогатого скота, верблюдов, северных оленей, вызываемая Mycobacterium paratuberculosis (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis), и характеризующаяся поражением кишечника и мезентериальных лимфатических узлов.
Болезнь протекает, в основном, в латентной форме, при переходе в клиническую стадию сопровождается диареей, анемией, истощением и заканчивается, как правило, гибелью животных.
В 1895 году немецкий ветеринарный врач Гармс у 6-летней коровы, страдающей диареей, заподозрил туберкулез кишечника и проверил ее туберкулиновой пробой. Реакция на туберкулин была слабая. При вскрытии он нашел у коровы утолщение кишечника, часть которого послал на исследование профессору Дрезденской высшей ветеринарной школы А. Ионе, который совместно с Л. Фротингеном обнаружили в нем кислотоустойчивые микроорганизмы. Когда зараженные патологическим материалом морские свинки не заболели, авторы сообщили, что это неизвестная форма болезни, вызванная ослабленным возбудителем бычьего или птичьего типа туберкулеза, и описали ее как особую форму туберкулеза кишок. Этого взгляда авторы придерживались долгие годы. С этим был согласен и Р. Кох.
Этиология болезни подвергалась обсуждению долгие годы, так как исследователи придерживались различных мнений. Только опытами Б. Банга (1906) была доказана инфекционность болезни и он предложил называть ее паратуберкулезом, а Мак Фадиен (1907) назвал в честь впервые описавшего ее автора болезнью Ионе. После того, как Творт и Ингрем (1912) описали возможность культивирования на искусственных питательных средах возбудителя паратуберкулеза и полученной культурой вызвали болезнь у подопытных животных, вопрос об этиологии паратуберкулеза был решен окончательно.
Впоследствии заболевание крупного рогатого скота паратуберкулезом зарегистрировали почти во всех странах мира. Рэнкин (1958) пришел к выводу, что имеется мало стран, свободных от этой болезни. И. Катич (1969) отмечал, что паратуберкулез зарегистрирован в 51 стране на всех континентах земного шара.
В России И.И. Шукевич, М.И. Романович, А.Н. Уранов и А.Н. Петровский (1914) впервые описали паратуберкулез у быка и козы, а С.А. Хрустал ев (1927), К.Г. Боль (1927) описали клинические признаки и патоморфологические изменения у крупного рогатого скота при этой болезни. О наличии паратуберкулеза в различных зонах страны, куда завозили импортный племенной скот, сообщали: М.А. Арнольдов (1929), Н.А. Алексеев-Голов (1929), И.И. Лукашев (1938), Х.Ш. Альмеев (1939, 1941), Т.Р. Гайнуллин (1952), Н.М. Львов (1957), В.В. Корнеев (1961), Е.И. Буткин (1961), А.П. Аликаева (1967), В.Е. Щуревский (1972) и др.
Экономический ущерб от паратуберкулеза в неблагополучных по этому заболеванию странах значителен из-за снижения продуктивности больных животных (молочной, мясной), вынужденным убоем клинически больных, а также затратами на проведение диагностических исследований и ограничительных мероприятий. По мнению Рэнкина (1960), сумма ежегодных потерь от паратуберкулеза в Великобритании составляет не менее 4 млн. фунтов стерлингов. Ван дер Шааф и Зантинга (1955) определяют ежегодные потери от паратуберкулеза в Нидерландах в 2,5 млн. гульденов, а Хуитема (1962) оценивают их по меньшей мере в 3,2 млн. гульденов. На международном симпозиуме, состоявшемся в США 16-18 июня 1983 г., сообщалось, что в США ежегодный экономический ущерб в целом по стране составляет 1,5 миллиарда долларов. Масштабы потерь в Австралии и Новой Зеландии приближаются к уровню США.
По данным G. Benedictus et all. (1987), убыток от убоя каждой клинически больной коровы от недополучения молока на 19,5% и снижения содержания в нем жира и белка на 20% составил 279 фунтов стерлингов, а убыток от убоя коров, не имеющих клинических признаков, состоял в снижении надоя молока на 16% и уменьшения содержания в нем жира и белка на 17,5%. При задержке убоя больных коров на год, размер потерь увеличился еще на 5-6%.
Восприимчивыми животными в естественных условиях являются крупный рогатый скот, верблюды, буйволы, овцы, козы и северные олени. Спорадические случаи заболевания наблюдались у зебу и его гибридов с серым украинским скотом, у антилопы Канна, оленя, индийского зебу. Имеются единичные сообщения о паратуберкулезе у лошади, антилопы гну, муфлона. По И. Катичу (1961), иногда у свиней обнаруживали патологоанатомические изменения, сходные с паратуберкулезными изменениями у крупного рогатого скота. Н.Р. Riemann and В. Arras (1983) сообщают о нахождении возбудителя паратуберкулеза у некоторых видов оленей, лосей ослов и свиней, a A. Greig et all. (1997) - у диких кроликов. Однако убедительных доказательств о заболеваемости паратуберкулезом этих видов животных до настоящего времени не приведено.
Поиски лабораторных животных в качестве модели для воспроизводства болезни не увенчались успехами. Заражать мелких лабораторных животных начали с 1895 г. Ионе и Фротингем, а позднее Штуурман (1909), Кольт (1912) и другие при субкутанном и парэнтеральном заражении морских свинок и кроликов получили отрицательные результаты. В дальнейшем заражали крольчат и хомяков (Херч, 1956), других мелких лабораторных животных (Е.Г. Посохин. 1949; Леви, 1950; Ломенский, Камерон и Роберте, 1956; Рэнкин, 1958; Белчев, 1962, и другие), но до сего времени нет методики и модели для изучения паратуберкулеза. Только А.П. Аликаевой (1940) удалось заразить алиментарно кроликов культурой и патологичеческим материалом от заведомо больного паратуберкулезом крупного рогатого скота. У кроликов, павших через 12,5-20 месяцев, она обнаружила множественные творожистые абсцессы в области суставов и на легочной плевре. Из этих мест ей удалось выделить культуру микобактерий паратуберкулеза. При внутривенном заражении культурой микобактерий паратуберкулеза, выделенной от крупного рогатого скота, А.П. Аликаева (1941) обнаружила у одного из них, зараженного в дозе 30 мг, через 32 дня, а у другого, зараженного в дозе 1 мг, через 4 месяца 12 дней культуру микобактерий и очаги из эпителиоидных клеток в паренхиматозных органах.
В.Е. Щуревский (1972), обобщая литературные данные по этому вопросу, отмечает, что это объясняется тем, что, вероятно, у лабораторных животных, как и у крупного рогатого скота, болезнь протекает, в основном, латентно. Поэтому у погибших или убитых через различные сроки после заражения лабораторных животных латентное течение паратубекулеза установить не удалось, так как бактериологического и гистологического исследований чаще всего не проводили. Автор считает, что кролики, хомяки и мыши могут быть использованы для изучения некоторых вопросов, связанных с этой инфекцией, а морские свинки, куры и крысы для этих целей непригодны. Однако морских свинок и кур используют для сенсибилизации при изучении аллергии и стандартизации изготовляемых аллергенов.
Главными источниками возбудителя инфекции является клинически и латентно больной крупный рогатый скот. Больные животные вместе с фекалиями выделяют во внешнюю среду огромное количество микобактерий паратуберкулеза. Это связано с тем, что у больных паратуберкулезом животных поражения локализуются в кишечнике.
Бактериоскопическое исследование фекалий и соскобов со слизистой оболочки прямой кишки
При паратуберкулезе крупного рогатого скота патологический процесс ограничивается кишечником и брыжеечными лимфатическими узлами. С развитием патологии вместе с переваренными кормовыми массами находятся обрывки отслоившейся измененной слизистой оболочки кишечника, в которых содержится огромное количество микобактерии паратуберкулеза. Громадное количество возбудителя находится и в самих фекальных массах. Поэтому Б. Банг (1906), Лекленш (1907), К.Ф. Мейер (1908, 1914) Мисснер (1926) и др. считали, что исследование фекалий может способствовать ранней диагностике болезни. Однако ценность бактериоскопии фекалий для подтверждения диагноза у животных расценивается по-разному.
К.Ф. Мейер (1908) установил, что бактериоскопия фекалий у крупного рогатого скота достоверна только в 40% случаев, а К.Н. Мейер (1926) находил возбудителя в 62% случаев. При этом он использовал 30%-ный антиформин. B.C. Рягузов, А.К. Голосницкий и Ф.В. Хомицкий (1936), применяя антиформин, обнаружили микобактерии паратуберкулеза только у 40% исследованных животных, в то время как при посмертном исследовании они находили их в 90% случаев. Дойл и Спирс (1951), Хоул (1953), Рэнкин (1958) и др. считают, что бактериоскопия выявляет около 30% заведомо больных животных. Дойл (1956) отмечает, что прижизненная бактериоскопия фекалий имеет определенное диагностическое значение только у клинически больных животных и часто бывает отрицательной у животных с латентной инфекцией.
Кильшпергер (1959) указывает, что бактериоскопический метод исследования фекалий переоценен и не может удовлетворить ни ветеринарных врачей лаборатории, ни врачей-практиков. Он считает, что кислотоустойчивые апатогенные палочки морфологически похожи на паратуберкулезные и если ставить диагноз по наличию единичных палочек, то во многих случаях можно установить паратуберкулез там, где его в действительности нет. А если диагноз ставить только на основании характерно расположенных палочек, то можно выявить около 20% больных животных. Это отмечает также М.Л. Леви (1948).
Кристи (1950), Кунингем и Гилмор (1950), А.И. Орлов (1961), Пирсон (1962) и др. предложили ряд усовершенствований для бактериоскопии фекалий, а Гардинг (1959) и О.А. Полякова (1957, 1961, 1970) и др. испытали метод флюоресцирующей микроскопии, но получили разноречивые данные. Указанный метод не дает возможности дифференцирования кислотоустойчивых патогенных представителей от сапрофитов этой же группы и его можно применять в качестве сигнального метода в общем комплексе диагностических исследований (О.А. Полякова, 1961, 1970).
При бактериоскопии соскобов или кусочков слизистой оболочки прямой кишки учитывают, что положительные результаты могут быть получены только в тех случаях, когда поражена прямая кишка. Это бывает у 25-30% животных с клиническим течением паратуберкулеза. Хотя эффективность и этого метода невысока, тем не менее считают, что пренебрегать им нельзя, так как в общем комплексе исследований он может сыграть положительную роль (В.Е. Щуревский, 1972).
Диагностическая ценность этого метода изучается многими исследователями, но мнения о его ценности так же противоречива, как и о методе бактериоскопии фекалий (М.И. Леви, 1948; А.В. Тейлор, 1951; Рэнкин, 1958; Меркал и соавт., 1968; А.П. Аликаева, В.Е. Щуревский, 1966; А.П. Аликаева, 1970 и др.) Сопоставляя результаты бактериоскопического исследования с выделением культур из фекалий, М.Л. Леви (1948) пришел к выводу, что метод получения культур является более точным диагностическим методом, чем бактериоскопия. Однако, по мнению А.В. Тейлора (1951) и Рэнкина (1958), при культуральном исследовании фекалий положительный результат может быть получен только через 4-6 недель. Это исследование требует много времени, а отрицательный результат не исключает наличия инфекции.
Меркал и соавторы (1968) исследовали пробы фекалий от здорового крупного рогатого скота и выявили значительное число кислотоустойчивых бактерий, которых можно было отличить от возбудителя паратуберкулеза только культуральным исследованием. Эти авторы рекомендуют проводить культуральное исследование фекалий для обнаружения субклинических случаев паратуберкулеза у крупного рогатого скота.
Y.R. Stabel (1997) усовершенствовал метод культивации М. paratuberculosis, выделенной из образцов фекалий, и сравнил его с методами осаждения, центрифугирования и Корнелла. Этот метод (NADC) явился в 10 раз более чувствительным для выделения колоний М. paratuberculosis, а контаминация значительно снизилась по сравнению с результатами других методов.
Кристи (1950), Хоул (1953) и др. указывают, что только положительные результаты исследований фекалий являются доказательством паратуберкулеза, а отрицательные данные не дают оснований снимать подозрение на паратуберкулез.
Этот метод применяют для подтверждения паратуберкулеза при гибели животного с клиническими признаками болезни, а также при убое животных с положительными показаниями аллергии или серологии. Он позволяет определять стадии развития патологического процесса.
Патологоанатомические изменения при паратуберкулезе крупного рогатого скота имеют некоторые особенности. Как правило, они ограничиваются кишечником и брыжеечными лимфатическими узлами. Чаще всего их можно обнаружить в заднем отрезке тонкого отдела кишечника, на илеоцекальной заслонке, в слепой и начальном отрезке ободочной кишок. Они характеризуются утолщением и складчатостью слизистой оболочки кишечника, увеличением брыжеечных лимфатических узлов. На разрезе узлы влажные, поверхность разреза бело-желтая или мозговидная, на ней встречаются беловатые очажки, а в отдельных случаях почти вся поверхность имеет беловатый вид. При гистологическом исследовании обнаруживают различной величины скопления эпителиоидных клеток. Среди эпителиоидных клеток нередко встречаются гигантские клетки типа чужеродных тел и типа Лангганса (П.П. Вишневский, 1941; В.Е. Щуревский, 1972).
Характерной особенностью паратуберкулеза является незначительное изменение тканей при наличии колоссального количества микробов и наоборот, при обширных и значительных изменениях в кишечнике возбудителя паратуберкулеза не обнаруживают или выявляют единичные палочки (П.П. Вишневский, 1941; В.Е. Щуревский, 1972, и др.). Кроме того, П.П. Вишневский отмечал, что при паратуберкулезе у крупного рогатого скота отсутствуют микроскопически видимые некрозы или творожистое перерождение, присущие туберкулезу.
С. Buergelt et all. (1978, 1979) описали у клинически больного крупного рогатого скота, микрогранулематозные поражения портальных лимфоузлов, кальцификацию стенок эндокарда и аорты, поражение тимуса и небольшие скопления кислотоустойчивых бактерий в срезах из печени. В.Е. Щуревский (1972) отмечает, что паратуберкулезный энтерит отличается от других энтеритов наличием типичных эпителиоидно-клеточных пролиферативных разростов. В большей или меньшей степени поражающих слизистую оболочку кишечника и брыжеечные лимфатические узлы. Поэтому патоморфологический диагноз на паратуберкулез необходимо ставить только на основании гистологического исследования патологического материала. Необходимо также параллельно проводить бактериоскопию и если можно, бактериологическое исследование.
Оптимизация условий адаптации культур Mycobacterium paratuberculosis к росту на жидких питательных средах для накопления бактериальной массы
Образовавшийся осадок отмывали от остатков среды 1% раствором трихлоруксусной кислоты с центрифугированием в течение 15 минут при 2500-3000 об/мин. двукратно. Надосадочную жидкость удаляли, осадок взвешивали в 0,3% растворе однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2Р04) и подвергали центрифугированию при том же режиме, затем осадок растворяли в изотоническом растворе следующего состава: Na2HP04 12 Н20-3,6 г; КН2РО4-0,8 г; NaCl - 6,4 г; Н20 до 2000 мл (рН-7,0). Для растворения этот раствор брали в объеме равном 1/15-1/20 объема исходного фильтрата культуры.
Раствор осадка для отделения крупномолекулярных частиц центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин. Затем в растворе определяли количество общего азота колориметрическим методом с реактивом Несслера. Путем умножения величины азота на коэффициент 6,25 устанавливали содержание белка в растворе.
Полученный раствор протеина фильтровали через фильтр Зейтца (пластину ЕК), разливали с помощью автомата в ампулы и лиофильно высушивали. После высушивания препарат представлял из себя в ампуле почти белый порошок в виде таблетки.
В растворитель препарата входило: Na2HP04 12 Н20-3,6 г; КН2РО4-0,8 г; NaCl - 6,4 г; фенол - 10,0 г; глицерин - 200 мл и Н20 до 2000 мл (рН-7,0).
Полученные 4 серии очищенных аллергенов испытали в различных концентрациях по содержанию сухого вещества в 1 мл консерванта на тех же опытных животных, как и при проверке неконцентрированных аллергенов.
При проверке специфичности очищенных препаратов в концентрации 4 мг сухого вещества в 1мл на 26 курах и в концентрации 3 мг сухого вещества в 1 мл на 15 курах установили, что очищенные аллергены не вызывают неспецифических реакций у кур при двукратной внутрикожной пробе.
При испытании препаратов на 7 курах, сенсибилизированных культурой «А», через 8 мес. после заражения, получены во всех случаях положительные реакции и при испытании препаратов в концентрациях 4 мг, 2 мг и 0, 4 мг вещества в 1 мл консерванта на этих же курах через 12 мес. после сенсибилизации, положительные реакции были у 6 кур.
Таким образом, очищенные аллергены специфически активны при испытании на курах.
Титрация активности очищенного аллергена провели на 27 курах, сенсибилизированных культурой «А» внутримышечно (15 из них -суспензией в физрастворе и 12 — суспензией в вазелиновом масле) в дозах 1 мг, 5 мг и 10 мг. Кур исследовали через 24 и 47 дней после заражения внутрикожным методом однократно в различных дозах по количеству сухого вещества в объеме 0,1 мл разведения. Учет реакций проводили через 24 и 48часов.
При испытании аллергена в концентрации 2 мг и 0,4 мг вещества в 1 мл консерванта на курах через 24 дня после заражения положительно реагировали 26 и сомнительно 1 из 27 исследованных.
Испытание аллергена в концентрации 0,04 мг и 0,01 мг вещества в 1 мл консерванта на курах через 47 дней после заражения показало, что все 11 исследованных кур, сенсибилизированных культурой, суспензированной в вазелиновом масле, реагировали положительно.
Аллерген в концентрации 0,04 мг вещества в 1 мл консерванта из 15 исследованных кур, сенсибилизированных культурой в физиологическом растворе, вызвал положительные реакции у 13, сомнительные у 2-х кур (инфицированных культурой в дозе 1 мг).
Аллерген в концентрации 0,01 мг вещества в 1 мл консерванта из числа тех же 15 кур, вызвал положительные реакции у 9,сомнительные у 2 и отрицательные у 4 кур.
Следует отметить некоторые особенности проявления аллергических реакций у кур в зависимости от дозы препарата, дозы заражающей культуры и времени исследований. Так, у 2-х кур, зараженных 10 мг культуры 8 мес. тому назад, были вызваны резко выраженные типичные реакции (++++) на 24 часу, которые усилились к 48 часам. Причем, у одной курицы наблюдался отек подчелюстного пространства и в одинаковой степени выраженная реакция и на второй бородке, куда препарат не вводили.
У одной курицы, зараженной 5 мг культуры 8 мес. тому назад, реакция протекала менее резко, но типично: на 24 часу - +, на 48 часу - ++ и на 72 часу - +.
У одной курицы, зараженной культурой в дозе 20 мг 1 год и 7 мес. тому назад, на первое введение препарата была слабо положительная реакция на 24 часу (+) и на 48 часу (+). После повторного введения у этой курицы была выраженная типичная реакция (+++).
При введении препарата в дозе 0,1 мл в разведении 1 мг белка в 1 мл консерванта 7 из 8 кур реагировали на 24 и 48 часу с типичной реакцией на ++++ с образованием специфического отека на второй бородке и подчелюстного пространства. У одной курицы типичная реакция была на повторное введение аллергена в дозе 0,2 мл того же разведения.
На введение препарата в дозе 0,1 мл разведения 0,1 мг белка в 1 мл консерванта реагировало 5 из 8 кур на 48 часу с сильно выраженными реакциями (++++). Одна курица положительно реагировала на 3+. Две курицы положительно реагировали на повторное введение препарата в дозе 0,2 мл того же разведения, а одна курица реагировала только на более концентрированные препарат (1 мг в 1 мл), введенный в другую бородку.
При введении препарата в дозе 0,1 мл разведения 0,01 мг белка в 1 мл консерванта положительные реакции были у 7 из 9 кур на первое введение и у 2 кур реакция была вызвана лишь повторным введением препарата в более сильной концентрации (1 мг белка в 1 мл) в другую бородку, между тем как на повторное введение препарата в испытуемом разведении в сенсибилизированную бородку куры не реагировали. Таким образом, результаты исследований показывают, что очищенный аллерген обладает высокой активностью и вызывает специфические аллергические реакции у кур, сенсибилизированных гомологичной культурой, в концентрациях 2 мг; 1 мг; 0,4 мг; 0,1 мг; 0,04 мг и 0,01 мг белка в 1 мл консерванта. В концентрации 0,01 мг вещества в 1 мл аллерген не выявляет у сенсибилизированных кур с пониженной чувствительностью, но выявляет кур, сенсибилизированных культурой, суспензированной в вазелиновом масле. Куры могут быть использованы в качестве лабораторной модели при изучении и стандартизации аллергенов.
Определение диагностической ценности опытного аллергена проводили на 4 коровах, подозреваемых в клиническом проявлении паратуберкулеза, в дозе 0,4 мг общего белка. Одновременно животным вводили алытуберкулин для птиц в дозе 0,4 мл. На альттуберкулин для птиц сомнительно реагировало только 2 коровы и не реагировало 2. На опытный аллерген положительно реагировали все 4 коровы. После убоя, у всех этих животных установлен активный, распространенный паратуберкулез. Внутрикожные реакции на альттуберкулин для птиц были ограниченные, твердые с утолщением кожной складки на 5-14 мм и промерами 22x22 -30x30-30x35 мм. На опытный аллерген реакции были разлитыми, горячими, тестоватыми и болезненными с утолщением кожной складки на 7-13 мм и промерами от 28x30 до 60x60 мм.
Результаты испытания йонинов, полученных из клеточных оболочек и цитоплазмы микобактерий паратуберкулеза
Паратуберкулез крупного рогатого скота (болезнь Ионе) распространен во многих странах мира и продолжает наносить значительный экономический ущерб. По данным Международного эпизоотического бюро (МЭБ) за 2001-2004 гг. паратуберкулез регистрировали в 67 из 191 страны практически всех континентов мира (35,0%).
По итогам международного коллоквиума, состоявшегося в США 16-18 июня 1983 г., паратуберкулез признан одной из важнейших болезней современности. В США он причиняет ущерб ежегодно в целом по стране 1,5 миллиарда долларов. Размер потерь в Австралии и Новой Зеландии приближается к уровню США. Серьезная ситуация сложилась в Японии.
В Российской Федерации эта болезнь также регистрируется среди крупного рогатого скота, однако имеющиеся данные не полностью отражают фактическое состояние хозяйств по этой инфекции.
Паратуберкулез остается наименее изученным по сравнению с другими хроническими инфекционными болезнями, так как имеет ряд особенностей: длительный инкубационный период, преимущественно латентное течение, трудность экспериментального воспроизведения болезни (Н.П. Овдиенко, 1987). Некоторые исследователи считают, что, несмотря на то, что болезнь была впервые описана более чем столетие назад, биология инфекционного организма и механизмы его взаимодействия с хозяином все еще остаются тайной (P. Valenti-Weigand, R. Goethe, 1999). В последние годы обсуждается предположение об общей этиологии паратуберкулеза жвачных и хронических воспалительных заболеваний кишечника других видов животных (в частности собак) и человека (Sechi L.A. et al., 2005; Ghadidli A.H. et al., 2004; Pickup R.W. et. al., 2005; Ayele W.Y. et. al., 2005). В течение многих лет обсуждается вопрос о роли возбудителя паратуберкулеза в болезни Крона у человека (Kanazawa К. et. al., 1999; Van Kruiningen H.J., 1999; Gan H., Onyang Q., Ви H., 1997 и др.).
Изложенное свидетельствует о своеобразии этого «коварного», как отмечал П.П. Вишневский в 1941 г., заболевания и в настоящее время, и необходимости расширения исследований по всестороннему его изучению.
Диагностика паратуберкулеза занимает важное место в общем комплексе организационно-хозяйственных и специальных мероприятий по профилактике и оздоровлению поголовья крупного рогатого скота.
Изучение аллергического метода диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота начинается с сообщения О. Банга (1906), который указал, что инфицированный возбудителем паратуберкулеза скот реагирует на подкожное введение птичьего туберкулина, и работ Ф. Творта и Г. Ингрема (1912) о преимуществах йонина (аллергена, приготовленного из микобактерий паратуберкулеза).
В настоящее время во многих странах мира общепринятым методом аллергической диагностики паратуберкулеза считается внутрикожная проба с ППД-туберкулином для птиц или йонином (паратуберкулином). Но до настоящего времени нет еще исчерпывающего анализа о диагностической ценности этих двух аллергенов - птичьего туберкулина и йонина.
До проведения наших исследований в практике нашей страны для аллергической диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота применяют альттуберкулин для птиц. Первоначально в соответствии с Инструкцией «О борьбе с паратуберкулезом крупного рогатого скота» утвержденной Главветупром Наркомзема СССР 10 июля 1935 г., птичий туберкулин применяли под кожу в виде 20% раствора в 0,5% карболовой воде. В 1939 г. было утверждено «Наставление по диагностике паратуберкулезного энтерита крупного рогатого скота», в котором наряду с подкожным применением птичьего туберкулина предусмотрено применение двойной внутрикожной пробы альттуберкулином для птиц, предложенной
П.П. Вишневским. Только с 1975 г для аллергической диагностики паратуберкулеза применяют только двойную внутрикожную пробу альттуберкулином для птиц. Причем, туберкулин применяли в следующих дозах: животным в возрасте до 2 лет - 0,2 мл, от 2 до 3 лет - 0,3 мл, старше 3 лет - 0,4 мл.
П.П. Вишневский (1941) изготовил и испытал паратуберкулин и считал, что аллерген, приготовленный из возбудителя паратуберкулеза, является более надежным диагностическим средством, чем альттуберкулин для птиц. Однако, этот препарат, как и паратуберкулины, предлагаемые В.В. Корнеевым, М.П. Новиковой, Э.Д. Лакман, не были приняты в практику.
Дальнейшие исследования научных сотрудников лаборатории по изучению туберкулеза и паратуберкулеза ВИЭВ, под руководством профессора И.В. Поддубского, показали несовершенство аллергической диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота альттуберкулином для птиц (В.Е. Щуревский и соавт., 1979).
Поэтому, была поставлена задача изыскать более совершенный аллерген для диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота. Научные исследования по разработке аллергена, начатые П.П. Вишневским, были продолжены сотрудниками лаборатории по изучению туберкулеза и паратуберкулеза ВИЭВ (ныне лаборатория микобактериозов) А.П. Аликаевой, З.С. Газарх, В.А. Шаровым, Н.П. Овдиенко, А.Х. Наймановым, Н.А. Ивановой, Н.И. Даниловой, В.Е. Щуревским, О.В. Якушевой.
В задачи наших исследований входило: - адаптация и выращивание культур М. Paratuberculosis на питательных средах для накопления бактериальной массы для изготовления аллергенов; изготовление и испытание йонинов для диагностики йонинов (паратуберкулинов); - сравнительное испытание йонинов, альт- и ППД-туберкулинов для птиц в хозяйствах с различным эпизоотическим статусом. Первоначальной задачей являлась отработка методики адаптации культур микобактерий паратуберкулеза к росту на питательных средах. В результате проведенных исследований показано, что скорость роста и развитие колоний возбудителя зависели от генерации культуры. Если при посеве второй или третьей генерации вырастали единичные, то при седьмой и выше генераций вырастали множественные колонии. Наиболее рациональным, надежным и быстрым способом перевода роста микобактерий паратуберкулеза с плотной среды на жидкую является перевод через глицериновый картофель Павловского. При пересевах лабораторных штаммов на элективные среды без добавления стимулирующих веществ необходимо брать для пересева большое количество культуры. По-видимому, жизнедеятельные лабораторные культуры сами выделяют в среду необходимые им для развития стимулирующие вещества. Эти данные согласуются с данными А.П. Аликаевой (1957), М.П. Новиковой (1959), Н.А. Ивановой (1984) и др.
Известно, что повышение чувствительности и видоспецифичности туберкулинов, как и других аллергенов, связана с совершенствованием методов выделения активных протеинов, очистки и концентрации препарата (Лазовская А.Л. с соавт., 1973; Галкин Н.И., 1978; Янокова Д., Иолов И., 1976; Лысенко А.П., 1984 и др.).
Поэтому следующей задачей наших исследований являлось испытание изготовленных йонинов на лабораторных животных и крупном рогатом скоте благополучных и неблагополучных по паратуберкулезу стад.
Испытание йонинов (паратуберкулинов), полученных по обычной методике; воздействием ультразвука на живые микобактерий паратуберкулеза и отделением из них растворимых фракций; экстрагированием активного вещества при нагревании и на холоду в слабощелочной среде с последующим фильтрованием через стерилизующий фильтр; по способу, предложенному А.Г. Малаховым, З.С. Газархом и
Г.И. Устиновой (1972), показало, что препараты безвредны, не обладают сенсибилизирующими свойствами, специфичны и активны. Эти аллергены вызывают аллергические реакции у кур, морских свинок и телят, экспериментально сенсибилизированных возбудителем паратуберкулеза.
Однако на йонин реагировали телята, сенсибилизированные микобактериями туберкулеза птичьего вида, атипичными микобактериями и возбудителем туберкулеза бычьего и человеческого видов. Реагировали на йонины и животные, больные туберкулезом. Это объясняется близким родством между микобактериями туберкулеза птичьего вида и микобактериями паратуберкулеза, а также с другими видами микобактерий.
В зарубежных странах для аллергической диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота стали применять ППД-туберкулин для птиц вместо алытуберкулина.
В нашей стране были проведены исследования В.И. Ротовым и А.И. Крошевым (1956) с ГШД-туберкулином для птиц, которые показали большую активность ППД-туберкулина для птиц при диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота. А.А. Попов (1958) также показал, что ППД-туберкулин для птиц является более активным и специфичным препаратом, чем альттуберкулин для птиц. С помощью этого препарата было выявлено почти в два раза больше зараженных паратуберкулезом животных, чем производственным альттуберкулином.
