Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы 11
2.1. Характеристика возбудителя вирусной лейкемии кошек 11
2.1.1 История 11
2.1.2 Таксономия и классификация возбудителя 11
2.1.3 Вирион и структура генома
2.2. Эпизоотология заболевания 14
2.3. Особенности патогенеза 18
2.4. Клинические симптомы 24
2.5. Методы диагностики вирусной лейкемии кошек 27
2.6. Лечение 33
2.7. Средства специфической профилактики 36
3. Собственные исследования 44
3.1 Материалы и методы 44
3.1.1 Вирусы, культуры клеток и питательные среды 44
3.1.2 Определение количества и жизнеспособности клеток 44
3.1.3 Криоконсервация культуры клеток 45
3.1.4 Инактивация вируса 45
3.1.5 Адъюванты 45
3.1.6 Определение стерильности 46
3.1.7 Экспериментальные животные 46
3.1.8 Выделение РНК as
3.1.9 Амплификация и клонирование reHagp70 вЕ.соІі 47
3.1.10 Приготовление питательной среды LB и L-arapa 48
3.1.11 Получение компетентных клеток 48
3.1.12 Трансформация компетентных клеток E.coli 49
3.1.13 Наращивание
3.1.14 Индукция 50
3.1.15 Сыворотки 50
3.1.16 Очистка рекомбинантного белка rgp70 методом металло-хелатной аффинной хроматографии (МХАХ) 50
3.1.17 Определение концентрации белка 51
3.1.18 Оценка иммунологической активности белка rgp70 52
3.1.19 Учет и интерпретация результатов ИФА 52
3.1.20 Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия
(ПААГ-ДСН) .53
3.1.21 Статистическая обработка результатов 54
3.2 Результаты собственных исследований 55
3.2.1 Изучение условий культивирования культуры клеток F422 55
3.2.2 Инактивация вируса 58
3.2.3 Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против В ЛК на лабораторных животных 59
3.2.4 Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на кошках 62
3.2.5 Изготовление и контроль опытных серий вакцины против вирусной лейкемии кошек 67
3.2.6 Получение и характеристика рекомбинантного оболочечного гликопротеина ВЛК gp70 (rgp70) 69
3.2.7 Разработка тест-системы по определению антител к оболочечному гликопротеину вируса лейкемии кошек gp70 з
4. Обсуждение 78
5. Выводы 88
6. Практические предложения 89
7. Список литературы 89
8 Приложение
- Методы диагностики вирусной лейкемии кошек
- Очистка рекомбинантного белка rgp70 методом металло-хелатной аффинной хроматографии (МХАХ)
- Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на кошках
- Получение и характеристика рекомбинантного оболочечного гликопротеина ВЛК gp70 (rgp70)
Введение к работе
1.1.Актуальность работы. Вирус лейкемии кошек (Feline leukaemia virus, FeLV или ВЛК) - РНК-содержащий вирус семейства Relroviridae, является одним из наиболее распространенных возбудителей инфекционных заболеваний кошек. В США, где система по обнаружению и изоляции инфицированных животных, а также профилактической вакцинации кошек действует в течение 20 лет, распространенность данного заболевания (среди клинически здоровых животных) составляет 2%. У больных особей, и кошек, принадлежащих к группе риска, эта цифра варьируется от 6 до 33% (Hartmann С, 2006). Инфицированность животных вирусом лейкемии в Центрально-Черноземном районе Российской Федерации достигает 12,6% (Федосов Д.В., 2007). В связи с этим, контроль за распространением заболевания и профилактика лейкемии кошек является актуальной проблемой.
Основной путь передачи вируса - горизонтальный, также возможно трансплацентарное инфицирование плода. В организме животных вирус вызывает дегенеративные, пролиферативные и неопластические процессы в клетках гемопоэтического ряда. У персистентно инфицированных кошек это приводит к лейкемии, фибросаркомам или, чаще всего, к супрессии иммунной системы животного, на фоне которой проявляются оппортунистические инфекции (Hardy W.D., 1980).
Основной метод контроля за распространением инфекции, вызываемой ВЛК, - выявление и изоляция инфицированных животных (Hartmann С, 2006), а также профилактическая вакцинация кошек. Вакцинированные кошки, у которых происходит синтез вируснейтрализующих антител к поверхностному гликопротеину gp70 ВЛК подгруппы А, устойчивы к заражению вирулентным штаммом вируса (Russell Р.Н., 1978).
За рубежом для специфической профилактики вирусной лейкемии кошек разработано несколько видов вакцин, причем установлено, что культуральная инактивированная и рекомбинантная субъединичная вакцины обладают наибольшей эффективностью (Sparkes А.Н., 1997).
1.2.Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка культуральнои инактивированнои вакцины против вирусной лейкемии кошек и методов определения ее антигенной активности.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Оптимизировать условия культивирования культуры клеток F422 для
получения максимального выхода поверхностного гликопротеина gp70 ВЛК.
2. Отработать условия инактивации культуралыюго ВЛК.
З.Приготовить экспериментальные серии культуральнои
инактивированнои вакцины против вирусной лейкемии кошек.
4. Изучить безвредность, реактогенность и антигенную активность экспериментальных серий культуральнои инактивированнои вакцины против ВЛК на кошках и лабораторных животных.
Определить оптимальную иммунизирующую дозу, способ и схему введения культуральной инактивированиой вакцины для получения напряженного и длительного иммунитета к ВЛК у иммунизированных животных.
Получить рекомбинантный белок rgp70 вируса лейкемии кошек и использовать его в иммуноферментном анализе для определения уровня антител к gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.
І.З.Научная новизна. Изысканы оптимальные условия культивирования перевиваемой хронически инфицированной вирусом лейкемии кошек культуры клеток и определены оптимальные условия его накопления.
Отработаны режимы инактивации вируса
Разработана схема изготовления культуральной инактивированиой вакцины против ВЛК.
Определена безвредность и антигенная активность культуральной инактивированиой вакцины против ВЛК на кроликах и кошках.
Изучено влияние хранения на антигенную активность вакцины.
Подобраны праймеры для амплификации гена gp70.
Получен и охарактеризован рекомбинантный оболочечный гликопротеин вируса лейкемии кошек (rgp70).
Разработана иммуноферментная тест-система для выявления вирус-специфических антител к оболочечному гликопротеину gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.
ІЛ.Практтеская ценность работы. Разработана безвредная и эффективная инактивированная вакцина против вирусной лейкемии кошек.
Научно обоснованы принципы изготовления и биологического контроля инактивированиой вакцины против вирусной лейкемии кошек.
Экспериментально установлена иммунизирующая доза препарата, показана возможность оценки антигенной активности на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.
Разработана нормативная документация на культуральную инактивированную вакцину против вирусной лейкемии кошек.
Разработана иммуноферментная тест-система для определения уровня антител к gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.
1.5.0сновные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:
-схема изготовления и методы биологического контроля вакцины против вирусной лейкемии кошек,
-результаты исследований по изучению антигенных свойств культуральной инактивированиой вакцины против ВЛК на лабораторных и естественно-восприимчивых животных,
- разработка иммуноферменпой тест-системы по определению уровня антител к оболочечному гликопротешу gp70 ВЛК в сыворотке крови кошек.
І.б.Апробация работы. Основьые положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 6-ой Меадународной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2007); 7-ой Международной конферщции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая бдопасность населения» (2008); 2-ой ежегодной конференции молодых ученее ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; заседании Ученого совета МГУПБ (2009), межлабораторном совещании МГУПБ.
1.7.Публикация результатов исстдоважй. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.
1.8. Объем и структура работы. Рібота выполнена на базе НПО «НАРВАК». Диссертация ізложена на 109 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, пракіические предложенгя и список литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 8 рисункіми. Список использованной литературы включает 119 отечественных и зарубокных авторов.
Методы диагностики вирусной лейкемии кошек
Вирусные частицы округлой формы, около 100 нм в диаметре, состоящие из сердцевины с одноцепочечной РІЖ и наружной оболочки.
Сердцевина инкапсидирует геном вируса, который, как и в случае других представителей этого семейства, представлен двумя линейными одноцепочечными молекулами РНК в виде димера. РНК вируса имеет 5 кэп и полиадениловый хвост на 3 конце. Длина генома составляет около 8кЬ в длину. С обоих концов генетическая последовательность содержит длинные концевые повторы (long terminal repeats-LTRs), которые не кодируют белки, но выполняют регулирующую функцию и управляют экспрессией других вирусных генов. Схематично, от 5 к 3 концу геном выглядит следующим образом: LTR-gag-pol-env-LTR. В составе миелоидных лейкемий кошек внутри LTR часто встречаются регуляторные последовательности, обладающие энхансерными свойствами (URE), что послужило основанием выдвинуть предположение, что эта область генома вируса связана с онкогенезом (Hartmann С, 2006).
На своей поверхности частицы вируса имеют шипы, состоящие из мультимеров двух белков, которые кодирует оболочечный (env) ген: gp70 -поверхностный гликопротеин и р15Е - трансмембранный протеин. Оболочечный белок gp70 является группоспецифическим и имеет большое значение с точки зрения специфической профилактики, так как антитела к этому белку являются вируснейтрализующими, что стало основанием для использования этого белка как основного компонента вакцин против вирусной лейкемии кошек (Salerno R.A., et. al, 1978; Pedersen N.C. et. al.s 1986; Sparkes A.H., 2003). По данным Mathes L. E., трансмембранный белок р15е препятствует развитию клеточного иммунитета, что облегчает персистенцию вируса (Mathes L. Е., et. al., 1978).
Ген полимеразы (рої) "кодирует обратную транскриптазу (ревертазу), протеазу и интегразу; ген группоспецифического (gag) гена кодирует структурные белки вируса: главный группоспецифический белок р27 и р15. Gag белок р27, который используется в серологической? диагностике ВЛК, присутствует в большом количестве в цитоплазме зараженных клеток, а также в плазме инфицированных кошек, что является причиной доступности для большинства диагностических тест-систем: иммуноферментного анализа и метода флуоресцирующих антител, разработанных для обнаружения этого белка. Свободный р27 не только циркулирует в плазме, но также может содержаться в слезах и слюне. Другой продукт gag гена р10 - белок нуклеокапсида, ассоциирован с вирионной РНК (Coffin J. М., 1979).
На основе реакции нейтрализации, интерференции, способности размножаться в культурах клеток, а также на основании различий в генетической последовательности поверхностного гликопротеина вируса, ВЛК был разделен на подгруппы: ВЛК-А, ВЛК-В, ВЛК-С, а также ВЛК-Т. Вирусы одной подгруппы препятствуют суперинфекции (явление интерференции) другим вирусом той же подгруппы, что связано с использованием трех различных рецепторов клеток хозяина подгруппами вируса и блокировании этих рецепторов в персистентно инфицированных клетках оболочечными гликопротеинами вируса. Основные рецепторы подгрупп А, В и С идентифицированы. Только ВЛК-А обладает инфекционными свойствами и передается горизонтально от кошки к кошке в естественных условиях. Подгруппы В и С образуются de novo у ВЛК-инфицированных кошек при помощи мутаций и рекомбинаций между геномом ВЛК-А и геномом клетки, а также генами эндогенных ретровирусов, которые могут содержаться в ДЕК кошки. Репликация ВЛК-В и ВЛК-С возможна только при участии ВЛК-А, так как часть генома, необходимая для репликации, у этих рекомбинантных вирусов отсутствует. Таким образом, ВЛК-А выполняет функцию вируса-помощника (Sarma P.S. et. al., 1978).
Тем не менее, в некоторых экспериментах репликация дефектных вирусов,осуществлялась без участия ВЛК-А. У новорожденных, свободных от патогенной микрофлоры котят (SPF), экспериментальная инфекция, вызванная ВЛК-В или ВЛК-С, наблюдалась без участия ВЛК-А (Bechtel М.К. et. al., 2006., Sarma P.S. et.- al., 1978). Однако в естественных условиях у инфицированных кошек выявляется либо только подгруппа А, либо ВЛК-А в комбинации с подгруппами В,.С, или обеими. Следовательно, устойчивость животного по отношению к подгруппе А вируса, означает устойчивость к ВЛК в целом. Патогенность подгрупп В и С выше, чем подгруппы A (Sarma P.S. et. al., 1978). Подгруппа В обычно связана со злокачественными новообразованиями. Подгруппа С встречается редко, главным образом она связана с нерегенеративной анемией (Pedersen N.C., 1988). Одновременное введение кошкам подгрупп А и В приводило к ослаблению инфекции по сравнению с инфекцией, вызванной только подгруппой A (Phipps A. J., 2000). Четвертая подгруппа - ВЛК-Т, является высоко цитопатогенной для Т лимфоцитов и способна индуцировать иммуносупрессию (Lauring A. S., et. al., 2001).
Очистка рекомбинантного белка rgp70 методом металло-хелатной аффинной хроматографии (МХАХ)
Поскольку большинство естественно подвергнутых заражению кошек вырабатывают антитела к вирусу и становятся иммунными, это стало основанием для разработки специфической профилактики данного заболевания. Решение задачи по созданию вакцины против ВЛК сопряжено с рядом трудностей. Механизм защиты против ВЛК, и особенно роль клеточного иммунитета, являются не до конца изученными. Выработка нейтрализующих антител к подгруппе А вируса является ключевым моментом, поскольку только эта подгруппа передается от одного животного другому в естественных условиях. Вакцинированные кошки, у которых происходит синтез вируснейтрализующих антител к поверхностному гликопротеину gp 70 ВЛК подгруппы А, устойчивы к заражению вирулентным штаммом вируса (Russell Р.Н., 1978; Clark N., et. al., 1991).
Вакцинировать необходимо только клинически здоровых и свободных от данного заболевания кошек. К группе пониженного риска следует отнести тех животных, которые находятся в условиях, исключающих контакт с другими животными, а также находящиеся в питомниках или гостиницах, свободных от данного заболевания. Необходимо тестировать всех кошек на наличие возбудителя вирусной лейкемии кошек до вакцинации. Только выявление и устранение инфицированных животных позволяет эффективно влиять на распространение заболевания. Исследование сывороток кошек на наличие антител к gp70 при помощи ИФА обычно используется как критерий оценки эффективности вакццнациш Вакцинация инфицированных животных никакой пользы (и вреда) не несет, поэтому таких животных иммунизировать не рекомендуется (Lutz Н., et. al., 2009). Необходимо вакцинировать всех кошек группы риска, то есть всех животных, которые контактируют с кошками с неизвестным в отношении ВЛК статусом. Для кошек, которые имеют риск контакта с вирусом, начинать иммунизацию необходимо до 12-недельного возраста. В группу риска в случае данной инфекции могут быть включены: животные, содержащиеся в питомниках или приютах, в которых наблюдались случаи выявления инфекции, имеющие свободный доступ на улицу, бродячие кошки, а также животные с неизвестным в отношении ВЛК статусом. Если курс вакцинации начинают в 8-10-недельном возрасте или позже, то до иммунизации необходимо брать образцы сыворотки крови. Это необходимо делать для того, чтобы решать спорные вопросы, которые могут возникнуть в том I случае, если кошка после прохождения полного курса вакцинации даст \ положительный результат при тестировании на наличие инфекции ВЛК. Выбор времени и конкретной вакцины для иммунизации должен осуществляться совместно с практикующим ветеринарным врачом. Поскольку ИФА в первые дни после инфицирования не позволяет установить инфицировано животное или нет, то имеет смысл и после первой иммунизации исследовать животных на наличие антигена вируса. В том случае, если результат будет отрицательным, курс вакцинации может быть продолжен. В противном случае вакцинацию следует прекратить, также необходимо исследовать сыворотку крови такого животного спустя 4-8 недель. Если и это исследование даст отрицательный результат, то это будет свидетельствовать о том, что за это время данное животное переболело вирусной лейкемией, следовательно, потребность в» возобновлении курса вакцинации минимальна. Если же повторное тестирование вновь даст положительный результат, то это с практически 100% вероятностью, будет указывать на наличие персистентной инфекции. Также в этой ситуации оправданно применение непрямого метода флюоресцирующих антител, положительный результат которого будет свидетельствовать о том, что инфицирован костный мозг (Lutz Н., et. al., 2009).
Первые вакцинные препараты против данного заболевания несли высокий риск анафилаксии. Опытные образцы инактивированных вирусных вакцин были не только неэффективны, но также и увеличили тяжесть иммуносупрессии после контрольного заражения. Живые вирусные вакцины способствовали развитию иммунитета, но некоторые привитые котята имели клинические симптомы. Этот факт, а также опасность интеграции вируса в геном хозяина, стали основанием того, что большинство исследований по вакцинации сосредоточились на использовании инактивированных и субъеденичных вакцин (Sparkes А.Н., 2003).
Первая вакцина против вирусной лейкемии кошек была лицензирована в 1985 году. С того времени эта вакцина подверглась модификациям; кроме того, появилось несколько новых коммерчески доступных препаратов. Лицензированные вакцины содержат инактивированный вирус или рекомбинантные части вируса. Поскольку диагностика ВЛК основана на выявлении белка р27, а не антител, то вакцинация не препятствует диагностике ВЛК.
В Европе лицензирована рекомбинантная вакцина, содержащая три гена ВЛК, клонированные в вирус оспы канареек. Преимущество этой вакцины состоит в том, что она не нуждается в воспалительном процессе на месте инъекции; так как антиген распространяется по организму при помощи вируса оспы и взаимодействует с иммунной системой-no другим механизмам. Генетическая, информация специфических белков ВЛК - интегрирована в геном вируса оспы канареек, с которым она проникает в клетку. Именно здесь белки ВЛК и производятся; что приводит к выработке антител, а также к возникновению клеточного иммунитета. Безопасность этого типа вакцины
была доказана. Также было доказано, что при этом возникает быстрый, длительный и эффективный иммунитет (Poulet Н., et. al., 2003; Tartaglia J., et. al.,1993). В ходе эксперимента, в котором вакцинированные кошки были размещены вместе с кошками, инфицированными ВЛК, в течение 27 недель было показано, что векторная вакцина обладала такой же эффективностью, как и другие коммерчески доступные вакцины (Gruffydd-Jones T.J., 1999). В исследовании на крысах было показано, что воспалительный процесс на месте инъекции в случае рекомбинантной вакцины был меньше по сравнению с обычными вакцинами. В ограниченном эксперименте на кошках при применении этой вакцины не было отмечено возникновения гранулематозного воспаления на месте инъекции. Также была разработана ДНК-вакцина, которая содержит все гены ВЛК и кошачий ген IL-18 в качестве адъюванта. Эта вакцина показала свою высокую эффективность в отношении вируса лейкемии кошек в эксперименте на котятах, у которых в ответ на введение вакцины наблюдалась выработка ВЛК-специфических цитотоксических лимфоцитов (Poulet Н., et. al., 2003).
Определение антигенной активности культуральной инактивированной вакцины против ВЛК на кошках
Вирусная лейкемия кошек - заболевание, распространенное среди домашних и диких кошек по всему миру. В организме инфицированных животных вирус вызывает дегенеративные, пролиферативные и неопластические процессы в клетках гемопоэтического ряда. У персистентно инфицированных животных это может приводить к развитию иммунной супрессии, анемиям и образованию лимфом. Большая часть таких кошек (70-90%) умирает в период от 18 месяцев до 3 лет после инфицирования (Hardy W.D, et. al., 1976).
Иммунная супрессия проявляется в виде атрофии тимуса, лимфопении, нейтропении, снижении числа CD4+ и, что имеет большее значение, CD8+ лимфоцитов. Следствием .подавления активности иммунной системы является возникновения чувствительности инфекционным агентам, к которым в норме кошки невосприимчивы, например Salmonella. Кроме того, может усугубляться развитие заболеваний, вызываемых поксвирусами, Mycoplasma haemofelis, Cryptococcus, также могут проявляться клинические признаки заболеваний, которые в норме протекают незаметно, например токсоплазмоз. У кошек, инфицированных вирусом лейкемии, может наблюдаться развитие нескольких типові анемии: в основном нерегениративного типа. Регенеративная анемия с развитием гемолиза наблюдается редко ш может быть связана, с вторичными инфекциями (особенно М. Haemofelis) или иммунно-обусловленными нарушениями (Scott D.W., et. al., 1973; Kociba G.J., 1986). Вирус лейкемии кошек также приводит к развитию лимфом и лейкемий; Лимфома, индуцированная вирусом лейкемии кошек — наиболее часто встречающаяся опухоль среди кошек (Louwerens М., et. al., 2005).
Основными методами контроля за распространением данного инфекционного заболевания является выявление и изоляция инфицированных животных, а также профилактическая вакцинация. На данный момент для специфической профилактики вирусной лейкемии кошек применяются культуральная инактивированная, рекомбинантная субъединичная, а также векторная на основе вируса оспы канареек вакцины.
Культуральными инактивированными вакцинами, предназначенными для профилактики вирусной лейкемии кошек, представленными на рынке, являются вакцина FEL-O-VAX (Fort Dodge), содержащая инактивированный вирус лейкемии кошек, штамм 6IE-А и вакцина Fevaxyn (Schering-Plough), которая содержит инактивированный вирус, штамм Rickard. Обе вакцины содержат адъюванты. Кроме того, применяется субъединичная вакцина Leucocell-2 (Pfizer), вирусный белок которой получен из культурального супернатанта хронически инфицированной 3-мя подгруппами вируса лейкемии кошек, в качестве адъюванта в этой вакцине используется гидроокись алюминия и сапонин. Разработаны и успешно применяются рекомбинантная субъединичная вакцина, полученная в прокариотической системе экспрессии Leucogen (Intervet), содержащая сапонин (QS-21) и гидроокись алюминия в качестве адъюванта, а также векторная вакцина на основе вируса оспы.канареек Purevax (Merial), не содержащая адъюванта.
Таким образом, учитывая положительный опыт производства» и использования вакцин для специфической профилактики вирусной лейкемии кошек, целью1 нашей работы была определена разработка технологии производства и методов биологического контроля культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек. Первым этапом наших исследований была оптимизация условий культивирования перевиваемой культуры клеток F422, хронически инфицированной вирусом лейкемии кошек подгруппы А, штамм Rickard, целью которых являлось получение культуральной жидкости с максимальной концентрацией оболочечного гликопротеина gp70 ВЛК. Культуру клеток F422 выращивались статическим (в культуральных матрасах) и роллерным способом с использованием различные питательных сред и сывороток крови. В результате проведенных исследований было установлено, что максимальное накопление антигена вируса отмечали при культивировании клеток в роллерах с использованием в качестве питательной среды RPMI 1640 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и добавлением 100 ЕД пенициллина и 100 jig стрептомицина на 1см3 среды, при этом концентрация клеток достигала 1-1,2x10 , а титр оболочечного гликопротеина gp70 ВЛК в ИФА 1:32 на 3-й сутки культивирования. Дальнейшее культивирование не приводило к увеличению концентрации клеток и соответственно концентрации gp70. Также необходимо отметить, что процедура замораживания/оттаивания культуральной жидкости не влияла на уровень gp70, определяемого в ИФА на основе моноклональных антител.
В качестве инактиванта инфекционной активности ВЛК нами был использован формальдегид, который широко используется для производства инактивированных вакцин (Сюрин В.Н. с соавт., 1984). Полноту инактивации определяли по отсутствию ЦЩГ,вирусав.культуре клеток GRFKвтечение 4-х последовательных пассажей: В результате проведенных исследований был установлено; что оптимальным является режим, при- котором инактивация вируса лейкоза кошек происходит 40% формальдегидом в конечной концентрации 0,3% в течение 24 часов при 37 С.
Получение и характеристика рекомбинантного оболочечного гликопротеина ВЛК gp70 (rgp70)
Проведенные нами испытания показали, что все 3 приготовленные нами экспериментальные серии инактивированной культуральной вакцины против вирусной лейкемии кошек стерильны, безвредны и ареактогенны, обладают выраженной антигенной активностью и могут храниться при температуре +4 С не менее 12 месяцев с момента изготовления, не теряя своих свойств.
Известно, что иммуногенную специфическую активность вакцин оценивают в опытах прямого заражения иммунизированных животных, а антигенную активность характеризует уровень образования специфических антител в сыворотке крови вакцинированных животных (Осидзе Д.Ф. с соавт., 1981). Однако на данный момент среди изготовителей вакцин против вирусной лейкемии кошек не установлено единого стандарта по определению их антигенной и иммуногенной активности (Sparkes А.Н., 2003.). Тем не менее установлено, что образование специфических антител к оболочечному гликопротеину gp70 ВЛК подгруппы А в сыворотке крови кошек, определяемое в ИФА коррелирует с РН на 90%. Протективный титр антител, определяемый в ИФА, при экспериментальном заражении кошек вирулентным штаммом Glasgow-1 ВЛК равен 1:256, а в случаях длительного контакта здоровых кошек с ВЛК-инфицированными - 1:100 (Marciani D.J., 1991; Jarrett О., 1977; Clark N., et. al., 1991). Следовательно, для контроля антигенной активности разработанной нами инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек необходима надежная тест-система для выявления специфических антител к оболочечному гликопротеину gp70 ВЛК в сыворотке крови вакцинированных животных.
Поэтому, следующей стоящей перед нами задачей было получение рекомбинантного оболочечного гликопротеина вируса лейкемии кошек подгруппы A (rgp70) в прокариотической системе экспрессии и использовании его в иммуноферментной тест-системе по определению уровня антител к оболочечному гликопротеину вируса лейкемии кошек подгруппы А.Важным компонентом любой иммуноферментной тест-системьг является используемый в ней антиген, от качества которого зависят специфичность и чувствительность. анализа: При разработке иммуноферментных тест-систем направленных на определение уровня антител к оболочечному гликопротеину вируса лейкемии кошек подгруппы А перед нами стояла задача выбора вида антигена, способа его накопления и очистки. Длительное и относительно слабое накопление вируса лейкемии кошек, а точнее, оболочечного гликопротеина вируса лейкемии кошек подгруппы А в культуре клеток F422, дорогостоящая процедура очистки культурального антигена и вероятность наличия в сыворотке крови кошек антител к микоплазме (которая может контаминировать культуру клеток) и, как следствие, повышения фона в ИФА, определили наш выбор в пользу рекомбинантного вирусного антигена.
В связи с вышеизложенным, при разработке иммуноферментной тест-системы для определения уровня антител к оболочечному гликопротеину вируса лейкемии кошек подтипа А в качестве антигена мы использовали рекомбинантный оболочечный гликопротеин (rgp70) вируса. Из-за низкого выхода белка rgp70 при синтезе его в бакуловирусной системе было решено перейти на прокариотическую систему экспрессии рекомбинантного гликопротеина rgp70. В рамку вектора рЕТ23 с С-концевым пептидом из шести гистидиновых остатков нами был вставлен ген ген оболочечного гликопротеина gp70 и первые 34 аминокислоты трансмембранного белка р15Е и; в клетках BL21(DE3)pLysS синтезирован белок [rgp70-(His)6J. Проведенные нами исследования по очистке синтезированного вЕ.соИ белка [rgp70-(His)6] показали, что; в рЕТ системе экспрессии происходит, в основном, синтез этого белка в виде нерастворимых телец включения. Белок [rgp70-(His)6] частично выделялся и в нативных условиях очистки, однако, выход его составлял только десятую часть от очищенного в денатурирующих условиях (в нативных условиях - 0,041% от веса микробной массы, тогдакак в денатурирующих условиях - 0 43%). Очищенный рекомбинантный? антиген [rgp70-(His)6]i вируса5; лейкемии; кошек, охарактеризованный методамш SDS-электрофореза! в? 12%-ом; ШААГ ш иммуноблоттинга с мкАТГ 3-15;, имел молекулярную1 массу примерно 50 kDa, что соответствует литературным данным (Marciani D.J., et.al., 1991) и был иммунохимически активен в непрямом ИФА. Таким образом, отсутствие олигосахаридных остатков в молекуле белка rgp70 (приводящее к снижению его молекулярной массы до 50 Ша), не препятствует его взаимодействию с моноклональными антителами к оболочечному гликопротеину вируса лейкемии кошек подгруппы А.
Испытания разработанной нами тест-системы при использовании референтных положительных и отрицательных, а также полевых сывороток крови кошек в сравнении с набором Biologicals Ltd. (Нидерланды) показал, что коэффициент корреляции результатов, полученных с помощью двух иммуноферментных тест-систем, составил 0,95.
Из полученных результатов следует, что полученный в рЕТ экспрессионной системе рекомбинантный белок rgp70 обладает активностью и специфичностью (в ИФА и иммуноблоттинге соответственно), и он может применяться в качестве компонента тест-системы по определению уровня антител к оболочечному гликопротеину ВЛК gp70 подгруппы А.
Завершая обсуждение результатов проведенных исследований, можно сказать, что нами были разработаны технология производства и методы биологического контроля культуральной инактивированной вакцины против вирусной лейкемии кошек, отраженные в проекте СТО 76418883-0002-2009 Вакцина «ЛЕОМИНОР».
Разработанная нами культуральная инактивированная вакцина против вирусной лейкемии кошек на основе инактивированного ВЛК подгруппы А RickarcL являются безвредной и ареактогенной, обладает выраженной антигенной активностью, создает напряженный иммунитет к вирусу лейкоза кошек-длительностью-не менее 12 месяцев и после широких клинических испытаний может быть рекомендована к применению в ветеринарной практике.
