Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Этиологическая структура и распространенность респираторных инфекций молодняка крупного рогатого скота 10
2. Этиологическая структура и распространенность желудочно-кишечных инфекций телят 12
3. Характеристика основных возбудителей вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят 14
4. Особенности иммунитета новорожденных телят 18
5. Методы диагностики респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота 23
6. Средства специфической профилактики респираторных инфекций молодняка крупного рогатого скота 28
7. Средства специфической профилактики желудочно кишечных инфекций молодняка крупного рогатого скота 36
Собственные исследования
Материалы и методы 41
Результаты исследовании
1. Серологический мониторинг животных на наличие антител к вирусам инфекционного ринотрахеита, . парагриппа-3 и вирусной диареи крупного рогатого скота в хозяйствах Московской области 52
2. Разработка схемы изготовления и методы биологического контроля вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К 56
4.2.1. Характеристика производственных штаммов вирусов, используемых для производства вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К 56
4.2.2. Получение и иммунохимическая характеристика гипериммунных антисывороток к производственным штаммам вирусов 60
4.2.3. Определение режима инактивации вирусов формалином 64
4.2.4. Определение оптимальной концентрации адъюванта 66
4.2.5. Изготовление опытных серий вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К
4.2.6. Контроль антигенной активности вирусных компонентов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К 71
на лабораторных животных
4.2.7. Контроль иммуногенной и антигенной активности бактериальных компонентов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К 76
4.2.8. Контроль антигенной активности вирусных компонентов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в процессе хранения 77
4.3. Оценка антигенной активности и определение оптимальной иммунизирующей дозы вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К для крупного рогатого скота 80
4.3.1. Оценка гуморального иммунного ответа у стельных коров и телят, иммунизированных вакциной КОМБОВАК-Р 80
4.3.2. Оценка гуморального иммунного ответа у стельных коров, иммунизированных вакциной КОМБОВАК-К 86
4.3.3. Оценка колострального иммунитета у новорожденных телят 89
4.4. Эффективность использования вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в производственных условиях 94
4.4.1. Испытание эффективности инактивированной комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза телят (КОМБОВАК-Р) 95
4.4.2. Испытание эффективности инактивированной комбинированной вакцины против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (КОМБОВАК-К) 97
5. Обсуждение 99
6. Выводы 108
7. Практические предложения 111
8. Список использованной литературы
- Этиологическая структура и распространенность желудочно-кишечных инфекций телят
- Методы диагностики респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота
- Разработка схемы изготовления и методы биологического контроля вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К
- Эффективность использования вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в производственных условиях
Введение к работе
Актуальность темы. Респираторные и желудочно-кишечные болезни молодняка крупного рогатого скота остаются одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии животных в большинстве стран мира, включая Россию В большинстве случаев эти заболевания имеют полиэтиологическую структуру, проявляются тяжелыми патологическими процессами и наносят значительный ущерб животноводству Ведущая роль в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота принадлежит вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), вирусной диареи (ВД), респираторно-синцитиальному, рео-, рино- и аденовирусам (Сюрин В Н с соавт, 1998, Мищенко В А с соавт, 2000, и др) Вирус диареи крупного рогатого скота, рота- (РВ) и коронавирусы (KB) являются наиболее важными вирусными агентами, участвующими в развитии патологического процесса при желудочно-кишечных заболеваниях у телят (Гоголев М М с соавт, 1989, Соколова НЛ, 1993, Жидков С А, 1994, Сатторов ИТ, 1995 и др ) Гибель животных от вирусных инфекций наблюдают, как правило, при осложнении их вторичной бактериальной микрофлорой (Высокопоясный А И с соавт, 1999, Гуненков В В с соавт, 2002 и др )
В животноводческих хозяйствах РФ все вышеперечисленные возбудители распространены практически повсеместно, вызывая появление смешанных инфекций с многообразием форм клинического проявления, что в значительной степени затрудняет их диагностику, терапию и иммунопрофилактику (Коромыслов ГФ с соавт, 1984, Сисягин ПН с соавт, 2002, Глотов А Г с соавт , 2002, К П Юров с соавт, 2003; Белова Н Б с соавт ,2003, Шеги-девич Э А с соавт, 2003, Соколова Н Л, 2003 и др) При смешанных инфекциях трудно определить ведущую роль того или иного инфекционного агента, поэтому наиболее эффективным средством профилактики таких болезней являются комбинированные (многокомпонентные) вакцины, включающие как вирусные, так и бактериальные антигены (Harkness J W et al, 1985, Pospisil Z et al, 1996, Van Oirschot J T, 1999, Hamers С et al, 2000 и др.) В
2 связи с этим поиск новых вакцинных препаратов, совершенствование схем и методов их применения, использование средств терапии и иммунокоррекции для профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний у телят остается актуальной проблемой ветеринарной науки и практики
В НПО «НАРВАК» (г Москва) с 1996 г выпускается комбинированная инактивированная вакцина КОМБОВАК, предназначенная для специфической профилактики шести основных вирусных болезней крупного рогатого скота (Сергеев В А, Непоклонов А Е , Алипер Т И, Патент РФ на изобретение № 2261111 от 08 04 2004) Однако в ряде животноводческих хозяйств наблюдаются преимущественно респираторные или желудочно-кишечные болезни телят В связи с этим нами были предложены два новых варианта вакцины для профилактики смешанных вирусо-бактериальных инфекций телят различной системной направленности
Цель работы. Разработка и оценка эффективности вакцин КОМБО-
ВАК-Р и КОМБОВАК-К, предназначенных для специфической профилак
тики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пасте-
реллеза (КОМБОВАК-Р) и вирусной диареи, рота-, коронавирусной инфек-
-дий-и-эшерихиоза-телят-(КОМБОВАК-К),
Основные задачи исследований:
-
Изучить эпизоотическую ситуацию по респираторным и желудочно-кишечным заболеваниям у телят в ряде животноводческих хозяйств Московской области
-
Разработать схему изготовления инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К и методы биологического контроля вирусных компонентов, входящих в их состав Для этого оценить специфичность производственных штаммов вирусов, получить моноспецифические гипериммунные антисыворотки, определить режим инактивации вирусов и подобрать концентрацию адъюванта в вакцине
-
В опытах на лабораторных животных определить безвредность и антигенную активность вирусных компонентов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМ-
БОВАК-К, а также сохранность их антигенной активности при хранении
-
Изучить гуморальный иммунный ответ у крупного рогатого скота на введение препаратов КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К Определить оптимальную иммунизирующую дозу вакцин и схему их применения Оценить эффективность вакцинации глубокостельных коров и ее влияние на формирование колострального иммунитета у потомства
-
Провести оценку эффективности вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в животноводческих хозяйствах, неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным болезням телят
Научная новизна работы Разработаны два новых вакцинных препарата против основных респираторных и желудочно-кишечных болезней телят, различающихся по антигенному составу с учетом этиологической структуры и системной направленности, и предназначенных для специфической профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза (вакцина КОМБОВАК-Р), вирусной диареи, рота-, коронави-русной инфекций и эшерихиоза телят (вакцина КОМБОВАК-К) Показано отсутствие интерференции между вирусными и бактериальными компонентами вакцин
Практическая значимость исследований. Научно обоснованы принципы изготовления и биологического контроля инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К Экспериментально установлена иммунизирующая доза препаратов, показана их эффективность и возможность оценки на лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Показана высокая иммуногенная активность вакцинных препаратов для стельных коров и формирование колострального иммунитета у телят Установлено, что в экспериментальных и производственных условиях вакцинация предлагаемыми препаратами обеспечивает выраженный протективный эффект, значительно снижая показатели заболеваемости и смертности телят
Указанные препараты производятся в НПО «НАРВАК» (г Москва) и применяются в соответствии с нормативной документацией, утвержденной в
4 установленном порядке
Основные положения, выносимые на защиту
схема изготовления вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К и методы биологического контроля их вирусных компонентов,
результаты исследований по изучению антигенных свойств вирусных компонентов, входящих в состав вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К, на лабораторных и естественно-восприимчивых животных,
эффективность применения разработанных вакцин в качестве средств специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных болезней телят в производственных условиях
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах Международной научной конференции «Актуальные проблемы патологии животных, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» (г Владимир, 2003), на семинарах и конференциях ветеринарных специалистов (г Уфа, 2004, г Краснодар, 2004, г Казань, 2004), научно-производственных совещаниях сотрудников НПО «НАРВАК» (2003 — 2007 гг )
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 научных
-рабш, н ium числе две работьга-изданиитТзекомендованном-ВАК-РФ
Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно В выполнении отдельных этапов работы принимали участие д б н ТВ Гребенникова (раздел 221), кбн ВВ Цибезов (раздел 2 2 1), двн М К Пирожков (раздел 2 2 7), ветеринарный врач А И Кузнецова (раздел 2 3) Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи в организации и проведении исследований научному руководителю д б н Т И Алиперу и сотрудникам НПО «НАРВАК», Института вирусологии им Д И Ивановского, ФГУ «ВГНКИ»
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 стр машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка
Этиологическая структура и распространенность желудочно-кишечных инфекций телят
Разработка и оценка эффективности вакцин КОМБО-ВАК-Р и КОМБОВАК-К, предназначенных для специфической профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пасте-реллеза (КОМБОВАК-Р) и вирусной диареи, рота-, коронавирусной инфекций и эшерихиоза телят (КОМБОВАК-К).
Основные задачи исследований:
1 .Изучить эпизоотическую ситуацию по респираторным и желудочно 7 кишечным заболеваниям у телят в ряде животноводческих хозяйств Московской области.
2.Разработать схему изготовления инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К и методы биологического контроля вирусных компонентов, входящих в их состав. Для этого оценить специфичность производственных штаммов вирусов, получить моноспецифические гипериммунные антисыворотки, определить режим инактивации вирусов и подобрать концентрацию адъюванта в вакцине.
З.В опытах на лабораторных животных определить безвредность и антигенную активность вирусных компонентов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К, а также сохранность их антигенной активности при хранении.
4.Изучить гуморальный иммунный ответ у крупного рогатого скота на введение препаратов КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К. Определить оптимальную иммунизирующую дозу вакцин и схему их применения. Оценить эффективность вакцинации глубокостельных коров и ее влияние на формирование колострального иммунитета у потомства.
5.Провести оценку эффективности вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в животноводческих хозяйствах, неблагополучных по респираторным и желудочно-кишечным болезням телят.
Научная новизна работы. Разработаны два новых вакцинных препарата против основных респираторных и желудочно-кишечных болезней телят, различающихся по антигенному составу с учетом этиологической структуры и системной направленности, и предназначенных для специфической профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза (вакцина КОМБОВАК-Р), вирусной диареи, рота-, коронави-русной инфекций и эшерихиоза телят (вакцина КОМБОВАК-К). Показано отсутствие интерференции между вирусными и бактериальными компонентами вакцин.
Практическая значимость исследований. Научно обоснованы прин 8 ципы изготовления и биологического контроля инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К. Экспериментально установлена иммунизирующая доза препаратов, показана их эффективность и возможность оценки на лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Показана высокая иммуногенная активность вакцинных препаратов для стельных коров и формирование колострального иммунитета у телят. Установлено, что в экспериментальных и производственных условиях вакцинация предлагаемыми препаратами обеспечивает выраженный протективный эффект, значительно снижая показатели заболеваемости и смертности телят.
Указанные препараты производятся и применяются в соответствии с нормативной документацией, утвержденной в установленном порядке.
Основные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения: схема изготовления инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К и методы биологического контроля их вирусных компонентов; результаты исследований по изучению антигенных свойств вирусных компонентов, входящих в состав вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К, на лабораторных и естественно-восприимчивых животных; эффективность применения разработанных инактивированных комбинированных вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в качестве средств специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных болезней телят.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной научной конференции «Актуальные проблемы патологии животных, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2003); семинарах и конференциях областных ветеринарных специалистов (г. Уфа, 2004; г. Краснодар, 2004; г. Казань, 2004); научно-производст 9 венных совещаниях сотрудников НПО НАРВАК (г. Москва, 2003 - 2007 гг.).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 научных работ, в том числе две работы в издании, рекомендованном ВАК РФ. Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие д.б.н. Т.В. Гребенникова (раздел 2.2.1), к.б.н. В.В. Цибезов (раздел 2.2.1), д.в.н. М.К. Пирожков (раздел 2.2.7), ветеринарный врач А.И. Кузнецова (раздел 2.3). Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи в организации и проведении исследований научному руководителю д.б.н. Т.И.Алиперу и сотрудникам НПО «НАРВАК», Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, ФГУ «ВГНКИ».
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 135 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 24 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает 190 источников (67 отечественных и 123 зарубежных авторов).
Методы диагностики респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота
Такие факторы неспецифической резистентности, как комплемент, пропердин и лизоцим, синтезируются новорожденным организмом, не получавшим молозива, в меньших количествах, чем у взрослых животных. До получения молозива способность к фагоцитозу проявляется ограниченно - фагоциты могут поглощать лишь непатогенные бактерии. Патогенные возбуди тели могут фагоцитироваться только после опсонизации антителами, поступившими с молозивом в кишечник и далее в кровь (Эльце К., 1977).
Иммунологическая защита новорожденных телят связана с иммуноглобулинами молозива, получаемыми в первые часы после рождения. Молозиво является единственным источником защитных антител от множества патогенных микроорганизмов. В период последней трети беременности иммуноглобулины избирательно концентрируются в молочной железе и защита осуществляется при поступлении антител и иммунокомпетентных клеток с молозивом в кишечник новорожденных животных. Наиболее выраженная способность эпителия кишечника абсорбировать иммунологически активные белки проявляется в первые 5-6 часов после рождения (Коромыслов Г.Ф., Федоров Ю.Н., 1988; McNulty M.S., 1983).
Через слизистую оболочку кишечника, проницаемую для белков, иммуноглобулины поступают в лимфатическую систему и кровяное русло. У новорожденного теленка иммуноглобулины проходят через стенку кишечника в неизменном виде в течение первых часов жизни и до 1 суток, затем проницаемость стенки резко снижается. Поэтому очень важно выпаивать молозиво своевременно. В возрасте 1-2 суток в сыворотке крови общее содержание иммуноглобулинов колеблется в пределах 27,2-29,6 мг/мл, в отдельных случаях - 66 мг/мл. Колостральные антитела представлены в основном иммуноглобулинами подкласса IgGi, что связано с тем, что IgGi в большем количестве содержатся в молозиве и меньше разрушаются в кишечнике трипсином. Другие иммуноглобулины (А и М) в крови телят имеют более низкий уровень, поскольку их концентрация в молозиве невысока (Зароза В.Г., 1991).
В силу того, что антитела в организме матери образуются в результате иммунной реакции (естественная инфекция, вакцинация), они являются специфическими только против тех микроорганизмов, с которыми контактировал организм матери. Пока новорожденный находится в той же среде, что и мать, он получает защиту с молозивом против микроорганизмов, обитающих в этой среде (Эльце К., 1977). Эффективной защиты плода in utero можно достичь созданием специфического иммунного статуса организма матери против конкретных инфекций. Такой подход дает возможность избежать трансплацентарного проникновения возбудителя, а в случае инфицирования плода предотвратить его гибель, приводящую к мумификации или абортам, и патологию развития. Такой способ защиты потомства применяют при профилактике многих вирусных заболеваний телят, ягнят и поросят. Так, у животных с выявляемым уровнем сывороточных антител редко отмечается трансплацентарная передача вируса ПГ-3 плоду (Swift B.L., Trueblood M.S., 1974), таким образом, предварительное заражение или вакцинация могут обеспечить защиту от абортов.
Принято считать, что у большинства видов млекопитающих потеря материнских антител наступает в 6-недельном возрасте. Однако некоторые животные могут к этому времени полностью сохранить пассивный иммунитет или теряют его значительно раньше. Уровень колостральных антител снижается из-за метаболического распада и становится невыявляемым к 2-11 месячному возрасту. Возраст, в котором наблюдается исчезновение колостральных антител, варьирует от теленка к теленку в зависимости от исходного уровня антител. Уровень колостральных антител у теленка определяется уровнем антител в молозиве матери, количеством выпоенного молозива и эффективностью абсорбции антител в пищеварительном тракте теленка. У большинства телят колостральные антитела исчезают к 6-ти месячному возрасту. Продолжительность материнского иммунитета важно знать, поскольку он может подавлять вакцинальный, особенно в случае применения живых вакцин (Marshall R.G., Frank G.H., 1975).
Разработка схемы изготовления и методы биологического контроля вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К
Подбор оптимальной иммунизирующей дозы каждой вакцины, оценку антигенной активности и безвредности экспериментальных и промышленных серий вакцин проводили на лабораторных (белые мыши массой 18-20 г, мор ские свинки массой 350-400 г, кролики массой 3-3,5 кг) и естественно-вос приимчивых животных (стельные коровы, телята), сформированных в соот ветствующие группы по принципу аналогов. Материалом для исследований служила сыворотка крови экспериментальных животных, в которой опреде ляли содержание вирус-специфических антител в различных серологических тестах. Вирус-спеиифические референтные антисыворотки. В исследованиях использовали моноспецифические референтные антисыворотки к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВД, рота- и коронавирусам крупного рогатого скота, полученные из Центральной ветеринарной лаборатории, г.Вейб-ридж, Великобритания.
Для обнаружения вирусных антигенов и специфических антител, использовали: реакцию нейтрализации (РН), реакцию гемагглютинации (РГА), реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), реакцию двойной иммуно-диффузии по Оухтерлони (РДП), иммуноферментный анализ (ИФА), метод электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГЭ-ДСН), иммуноблоттинг (ИБ), полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
Реакция нейтрализации РН использовали для проверки специфичности вирусов, выявления и количественной оценки специфических антител в сыворотках крови лабораторных животных и крупного рогатого скота. Сыворотки крови предвари 45 тельно инактивировали в водяной бане при 56С в течение 30 мин. РН ставили микрометодом в 96-луночных планшетах (Nunc, Denmark). В лунки вносили по 0,1 см3 поддерживающей среды и готовили двукратные разведения сывороток. К каждому разведению сыворотки добавляли по 0,1 см3 рабочего разведения вируса (1000 ТЦД5о/см ) и инкубировали в 5%-ной С02-атмосфере в течение 1 ч. Затем смесь сыворотки и вируса переносили по 0,2 см3 в лунки со сформированным монослоем клеток и инкубировали при 37С в течение 4-5 сут. Для постановки РН с рота- и коронавирусами в поддержи-вающую среду добавляли трипсин в концентрации 5 мкг/см среды. Вирус-нейтрализующий титр сыворотки выражали как предельное ее разведение, ингибирующее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток.
Реакция гемагглютинации и реакция торможения гемагглютина-ции Для постановки РГА и РТГА использовали эритроциты морской свинки и мыши. Кровь от животных, полученную с соблюдением правил асептики и антисептики, добавляли в раствор Альсевера в соотношении 1:10 и хранили при 4С в течение 7-10 суток. Перед постановкой реакции эритроциты трижды отмывали ФБР и готовили из них суспензию необходимой концентрации.
РГА использовали для выявления и количественной оценки вируса ПГ-3 в вируссодержащей культуральной жидкости. Реакцию ставили микрометодом в полистироловых планшетах с U-образным дном в объеме 0,05 см3. В лунках готовили двукратные разведения испытуемого материала на ФСБ, начиная с разведения 1:2. В каждую лунку добавляли 0,05 см3 0,75%-ной суспензии эритроцитов морской свинки. Планшет осторожно встряхивали и выдерживали в течение 2-3 ч при 4С. Для контроля эритроцитов на спонтанную агглютинацию к 0,05 см3 ФСБ добавляли 0,05 см3 суспензии эритроцитов. За титр антигена принимали наибольшее его разведение, вызывающее полную агглютинацию эритроцитов. РТГА использовали для идентификации вируса ПГ-3 и выявления специфических антител в сыворотках крови морских свинок и крупного рогатого скота. Перед постановкой реакции осуществляли подготовку проб сыворотки крови.
Подготовка проб сыворотки крови В сыворотке крови животных содержатся неспецифические ингибиторы вирусной гемагглютинации и гетероагглютинины, которые необходимо удалить перед постановкой РТГА. Для освобождения от термолабильных ингибиторов гемагглютинации сыворотки прогревали в водяной бане при 56-58С в течение 30 минут. От термостабильных ингибиторов гемагглютина-ции сыворотки освобождали каолином. Для этого к 0,2 см инактивирован-ной сыворотки добавляли 0,2 см 25%-ной суспензии каолина. Смесь выдерживали 12 ч при комнатной температуре и центрифугировали 10 мин при 1500 мин"1. Гетероагглютинины из сывороток крови удаляли обработкой их эритроцитами морской свинки. Для этого к 0,2 см каждой сыворотки добав-ляли осадок отмытых эритроцитов в объеме 0,05 см . Смесь выдерживали 1 час при комнатной температуре, периодически встряхивая, эритроциты осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 1500 мин"1.
РТГА ставили микрометодом в полистироловых планшетах с U-образ-ным дном. В лунки вносили по 0,05 см3 ФБР и готовили двукратные разведе-ния исследуемых сывороток. В каждую лунку вносили 0,05 см рабочего разведения антигена (4 ГАЕ) и выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Затем во все лунки добавляли 0,05 см3 0,75%-ной суспензии эритроцитов. Для вируса ПГ-3 использовали эритроциты морской свинки, для KB - эритроциты мыши. Планшет осторожно встряхивали и оставляли на 1,5-2 ч при +4С. Параллельно ставили контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию, контроль рабочей дозы антигена и контроль специфичности антигена. Специфичность антигена определяли по подавлению его гемагглютинирую-щей активности гипериммунной сывороткой. За титр антител принимали предельное разведение сыворотки, полностью подавляющее гемагглютини-рующую активность антигена.
Для обнаружения коронавирусного антигена и специфических антител использовали коммерческий «Набор для диагностики коронавирусного энтерита крупного рогатого скота методом гемагглютинации» производства ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (Россия). Постановку реакции и учет полученных результатов РГА и РТГА осуществляли согласно наставлению по применению «Набора...».
Эффективность использования вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К в производственных условиях
Известно, что инактивированная вакцина представляет собой препарат, содержащий культуру микроорганизма определенного вида, обезвреженную действием физико-химических факторов - утратившую способность к репродуцированию, но сохранившую иммуногенные свойства возбудителя (Д.Ф.Осидзе с соавт., 1981). Для инактивации вирусов используют различные вещества (инактиванты), которые инактивируют нуклеиновую кислоту (носитель инфекционности) и практически не изменяют антигенные детерминанты вирусов, вызывающие образование специфических антител и иммунную защиту. Несмотря на большое количество различных способов инактивации вирусов наиболее часто для этих целей применяется формалин, действующим веществом которого является формальдегид.
Процесс инактивации вирусов формалином является сложной физико-химической реакцией, важную роль в которой играют не только концентрация формальдегида, но и содержание белка и электролитов. При взаимодействии с нуклеиновыми кислотами формалин реагирует в основном с аминогруппами пуриновых и пиримидиновых оснований и подавляет матричную активность нуклеиновых кислот (Fraenkel-Conrat Н., 1981).
Формалин практически не влияет на физико-химические и антигенные свойства вирусных белков. Однако он образует поперечные сшивки между полипептидами и приводит к уплотнению белковой оболочки вирусов и уменьшению ее проницаемости (Фельдман М.Я., 1963).
Целью данного этапа нашей работы была отработка оптимального режима инактивации вирусов, входящих в состав разрабатываемых вакцин. В качестве инактиванта вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД, РВ и KB использовали формалин, содержащий не менее 37% формальдегида, в различных концен трациях. Инактивацию проводили при 37С в течение 24, 48 и 72 час. Полноту инактивации вирусов определяли по отсутствию ЦПД вируса в культуре клеток МДВК в течение 4-х пассажей (табл. 13). 0,2 48 Как видно из данных таблицы 13, формальдегид полностью инактиви-ровал вирус ИРТ в концентрации 0,3% при экспозиции 72 час; вирус ВД - в концентрации 0,1% при экспозиции 48 час. и 0,2% при экспозиции 24 и 48 час, вирус ПГ-3 - в концентрации 0,2% при экспозиции 24 и 48 час, рота- и коронавирус - в концентрации 0,2% при экспозиции 48 час.
Таким образом, на основании полученных результатов был установлен режим инактивации вирусов, входящих в состав вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К. В дальнейшей работе по производству опытных серий вакцин вирус ИРТ инактивировали формальдегидом в концентрации 0,3% в течение 72 час, вирусы ГТГ-3 и ВД - в концентрации 0,2% в течение 24 час, рота- и коронавирусы - в концентрации 0,2% в течение 48 час.
С целью повышения иммуногенной активности специфических антигенов широко используют адъюванты - неспецифические стимуляторы иммунного ответа. Концепция применения адъювантов как веществ, способных усиливать иммуностимулирующую активность антигенов при их совместном применении, была предложена Гастоном Рамоном в 1925 году. Он впервые показал возможность искусственного усиления антигенной активности дифтерийного и столбнячного анатоксинов при введении их лошадям совместно с квасцами, тапиокой, ланолином и другими веществами (Воробьев В.А., Васильев Н.Н., 1969).
Механизм стимулирующего действия адъювантов зависит от звеньев иммунной системы, на которые оно направлено. Ранее действие адъювантов сводилось к удержанию антигена на месте введения (депонированию) и длительному стимулированию иммунного ответа. В настоящее время установлено, что адъюванты действуют непосредственно на клетки иммунной системы организма. Так, минеральные сорбенты и масляные эмульсии способствуют лучшему поглощению антигенов макрофагами. Другие адъюванты усиливают пролиферацию иммунокомпетентных клеток.
Адъювантной активностью обладают многие вещества различного происхождения, химического состава и строения, однако лишь некоторые из них нашли широкое применение при изготовлении вакцин для людей и животных. Такие адъюванты как гидроокись алюминия (ГОА) или фосфат алюминия в течение многих десятилетий применяли для увеличения образования антител против бактериальных токсоидов у людей. Эти адъюванты, а также сапонин широко используются для повышения иммуногенности различных инактивированных вакцин для животных (Сергеев В.А., 1993; Lindblad Е.В., 2004).
Целью данного раздела нашей работы было определение оптимальной концентрации адъюванта - ГОА, который используется для изготовления прототипной вакцины КОМБОВАК.
Для решения поставленной задачи на основе вакцины КОМБОВАК, выпускаемой НПО НАРВАК (г. Москва), были приготовлены экспериментальные серии вакцины КОМБОВАК-Р против респираторных инфекций телят, в состав которой вошли вирусы ИРТ, ПГ-3 и ВД, а также P. multocida и P. haemolytica, и вакцины КОМБОВАК-К против инфекций желудочно-кишечного тракта телят, в которую вошли вирусы ВД, РВ, KB и патогенные ко-либактерии. Приготовили несколько вариантов вакцин: в 1-м варианте содержание 6%-ного геля ГОА составляло 10% от общего объема препарата, во П-м - 20% и в Ш-м - 30%. IV вариант служил контролем, в который вместо бактериального компонента в том же объеме добавили физиологический раствор, ГОА добавили в количестве 10% от общего объема препарата. Для приготовления всех вариантов вакцин КОМБОВАК-Р и КОМБОВАК-К использовали вирусные компоненты, полученные в одно время, с определенной инфекционной активностью и инактивированные формалином в определенном ранее режиме. В каждом варианте вакцины вирусы содержались в одинаковых соотношениях.
В качестве экспериментальной модели использовали морских свинок, сформированных в четыре группы по принципу аналогов (п=10 в каждой группе), которых иммунизировали изготовленными вариантами вакцин подкожно однократно в дозе 1,0 см3 . Взятие крови проводили на 21-е сутки после инъекции вакцины, полученные сыворотки крови исследовали в РН. Полученные результаты приведены в таблицах 14, 15.
