Содержание к диссертации
Введение
1.0.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика возбудителей сальмонеллеза 9
1.2. Источники возбудителя сальмонеллезной инфекции и причины, вызывающие эпизоотические вспышки болезни у свиней 13
1.3. Эпизоотологические, клинические, патологоанатомические, серологические, клинические аспекты диагностики сальмонеллеза у свиней 17
1.4. Специфическая профилактика сальмонеллеза свиней и ее особенности 21
1.5. Общая характеристика иммуномодулирующих средств и стратегии иммунокоррекции при инфекционных болезнях свиней 30
2.0. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал и методы исследований 38
3.0. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Этиологическая структура инфекционных болезней свиней в Курской области 44
3.2. Теоретическое обоснование конструирования тканевого иммунотропного препарата пролонгированного действия 46
3.3. Протективная активность янтарного спленолизата с адъю-вантом при экспериментальных инфекциях белых мышей 55
3.4. Теоретическое обоснование применения формолянтарного спленолизата при вакцинации свиней против сальмонеллеза 60
3.5. Характеристика эпизоотического состояния и клиническое проявление сальмонеллеза у свиней на примере ЗАО «Содружество» 62
3.5.1. Клиническое проявление сальмонеллеза у свиней разных возрастных групп 65
3.5.2. Патологоанатомические изменения у павших поросят при сальмонеллезе 66
3.5.3. Влияние янтарного спленолизата на состояние иммунологической реактивности свиноматок с низкими фоновыми показателями содержания специфических агглютининов при вакцинации против сальмонеллеза вакциной из штамма ТС- 177 68
3.5.4. Влияние янтарного стимулятора на содержание Т- и В-лимфоцитов в крови свиноматок при вакцинации против сальмонеллеза 70
3.5.5. Влияние янтарного спленолизата на синтез и накопление иммуноглобулинов М и G в крови свиноматок при вакцинации против сальмонеллеза 73
3.5.6. Влияние янтарного спленолизата и вакцины из штамма ТС-177 на реактивность свиноматок с высокими фоновыми показателями специфических агглютининов 76
3.5.7. Влияние иммунизации свиноматок янтарным стимулятором на физиологическое состояние новорожденных поросят 19
3.5.8. Влияние янтарного спленолизата и вакцины из штамма ТС-177 при иммунизации супоросных свиноматок на уровень титров специфических агглютининов в сыворотке крови поросят 80
3.6. Влияние янтарного спленолизата на показатели иммунобиологической реактивности поросят при вакцинопрофилактике сальмонеллеза 82
3.6.1. Титры специфических агглютининов в сыворотке крови поросят после вакцинации против сальмонеллеза и введения янтарного спленолизата 84
3.6.2. Влияние янтарного спленолизата на состояние гуморального иммунитета поросят при вакцинации против сальмонеллеза живой и инактивированной вакцинами 87
3.6.3. Влияние янтарного спленолизата на содержание Т-иВ-лимфоцитов в крови поросят при вакцинации поросят против сальмонеллеза живой и инактивированной вакцинами 89
3.7. Влияние янтарного спленолизата на иммунобиологическую реактивность подсосных поросят их рост и развитие 92
4.0.ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 98
5.0. ВЫВОДЫ 106
6.0. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 108
7.0. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 109
ПРИЛОЖЕНИЕ 130
- Источники возбудителя сальмонеллезной инфекции и причины, вызывающие эпизоотические вспышки болезни у свиней
- Материал и методы исследований
- Теоретическое обоснование конструирования тканевого иммунотропного препарата пролонгированного действия
Введение к работе
Актуальность темы. Свиноводство относится к отраслям специализирующимся и развивающимся по интенсивной технологии получения и выращивания поросят. Однако промышленное свиноводство характеризует ряд факторов, многие из которых имеют выраженную стрессовую направленность. К ним относятся: однообразное неполноценное кормление животных всех возрастных групп, несоблюдение параметров микроклимата, отсутствие солнечной инсоляции, частые перегруппировки по технологическим линиям, ранний отъем поросят от свиноматок. Все это обусловливает низкий уровень естественной резистентности организма, массовые проявления иммунодефицитов, что, в конце концов, приводит к заболеваемости желудочно-кишечными и респираторными болезнями (Бригадиров Ю.Н., 2002; Ковалев М.М., 2002;Петрянкин Ф.П. с соавт., 1995; Прудников СИ., Прудникова Т.М., 1997; Прудников СИ. с соавт., 1983;2002; Шахов А.Г.,1996,1999, 2002; Федоров Ю.Н. с соавт., 1997 и др.).
В этиологии желудочно-кишечных заболеваний в большинстве случаев участвуют различные ассоциации вирусов, бактерий, хламидий (Гаф-фаров Х.З. с соавт., 2002; Кареева Э.П. с соавт., 2002; Спиридонов Г.Н. с соавт., 2002; Шахов А.Г. 1996; 1999; 2002 и др.). Основные возбудители желудочно-кишечных заболеваний, как правило, относятся к условно-патогенным микроорганизмам, постоянно переживающим в желудочно-кишечном тракте. Свои патогенные свойства они способны реализовать только при выраженном дисбалансе принципа соответствия потребностей организма животного к условиям внешней среды. В этих условиях, когда возбудители желудочно-кишечных заболеваний персистируют в организме клинически здоровых животных, применение вакцинных препаратов носит вспомогательный характер, так как практически невозможно обеспечить достаточно напряженный иммунитет (Джупина СИ., 2002). Нерациональное, бессистемное применение антибиотиков и нитрофурановых препаратов при кишечных инфекциях ведет к возникновению лекарственно 6
устойчивых популяций микроорганизмов и утяжелению иммунодефицит-ных состояний. В связи с этим в настоящее время усиливается интерес и большого внимания заслуживают разработки иммуномодуляторов, действие которых направлено на повышение резистентности организма и на усиление иммунного ответа при вакцинациях (Артемов Б.Т., 1991; Беляев В.И., Сартасов Е.Л., 1992; Левин Ю.А., 1992; Петрянкин Ф.П. с соавт., 1995; Прудников СИ., 1997; Урбан В.П. с соавт., 1991; 1992; Федоров А.И. с соавт., 1993; 1998 и др.). Перспективным в этом направлении является использование иммунотропных препаратов на основе янтарной кислоты (Евглевский А.А. с соавт, 2005,2006; Лебедев А.Ф. с соавт.,2005 и др.). Сама по себе янтарная кислота универсальный стимулятор обмена веществ живой клетки. Применение янтарной кислоты показано для повышения устойчивости к неблагоприятным воздействиям внешней среды, в частности, при стрессовых ситуациях, всевозможных нарушениях обмена веществ и интоксикациях, при иммунодефицитных и инфекционных заболеваниях.
Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось научное обоснование практических подходов по разработке нового иммунотропного тканевого препарата на основе янтарной кислоты, обладающего широким спектром имму ном одул ирующего, антистрессового, антитоксического и антиинфекционного действия и его испытание при саль-монеллезе свиней.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1. Изучить эпизоотическое состояние и определить роль сальмонел-леза в современной структуре желудочно-кишечных заболеваний в свиноводческих хозяйствах Курской области;
2. Теоретически обосновать способ получения комплексного иммунотропного препарата «янтарный спленолизат» с широким спектром действия и изучить его превентивную эффективность при моделировании сальмонелл езной инфекции на белых мышах; 3. Изучить влияние янтарного спленолизата на усиление иммунного ответа при вакцинации свиноматок и поросят против сальмонеллеза;
4. Изучить влияние нового иммунотропного препарата на показатели клеточной и гуморальной систем иммунитета;
5. Изучить лечебную и профилактическую эффективность янтарного спленолизата при желудочно-кишечных заболеваниях поросят бактериальной этиологии.
Научная новизна. Впервые научно обоснован и разработан способ получения нового иммунотропного тканевого препарата пролонгированного действия на основе янтарной кислоты и селезенки « янтарный спленолизат» и изучена его эффективность применения при сальмонеллезе и желудочно-кишечных заболеваниях поросят. Новизна исследования подтверждается патентом РФ № 2278678 от 27 июня 2006г. «Способ получения препарата для повышения резистентности организма животных».
Практическая значимость работы. Полученные данные обосновывают целесообразность применения янтарного спленолизата в системе мер активной профилактики сальмонеллеза поросят, высокая эффективность которого подтверждена в производственных условиях. Основные положения, выносимые на защиту:
- Роль и место сальмонеллеза в формировании нозологического профиля инфекционной патологии свиней в условиях Курской области;
- Способ получения нового иммунотропного препарата, обладающего выраженным антиинфекционным и иммунотропным действием;
- Результаты научных исследований по применению нового иммунотропного препарата «янтарный спленолизат» в системе мер профилактики сальмонеллеза и желудочно-кишечных заболеваний поросят.
Апробация и публикация научных результатов.
Основное содержание диссертации доложено и обсуждено на научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Курской ГСХА (2004 г.); Всероссийской научно-практической конферен 8 ции, посвященной 120-летию ветеринарной службе Курской области (2005 г.); на ученом совете Курского НИИ агропромышленного производства по итогам научно-исследовательской работы (2003,2004,2005);
По материалам диссертации опубликовано 6 научных статей и получен патент на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 19 таблицами, 2 рисунками и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и приложения. Список использованной литературы включает 187 наименований, в том числе 18 иностранных авторов.
Источники возбудителя сальмонеллезной инфекции и причины, вызывающие эпизоотические вспышки болезни у свиней
Анализ литературных данных свидетельствует, что сальмонеллезом болеют не только молодые, но и взрослые животные (Ахмедов A.M., 1983; Прудников СИ., 1980; 1984; Романенко В.Ф., 1984 и др.).
Оценивая возраст свиней с точки зрения заболеваемости их сальмонеллезом можно отметить, что наиболее восприимчивы к сальмонеллезу поросята с первых дней жизни. Однако наиболее опасный это предотъем-ный период, когда чаще всего допускаются погрешности в кормлении и содержании поросят. (Прудников СИ., 1997; Шахов А.Г., 1999; 2000; Федоров Ю.Н., 1996 и др.). В этот период колостральный иммунитет резко снижается, а активный еще не сформировался. Многие отечественные и зарубежные исследователи, изучающие эпизоотологию сальмонеллеза свиней, считают, что источник возбудителя инфекции - больные животные и бактерионосители, которые выделяют его с калом, носовыми истечениями и другими экскрементами. Во внешнюю среду попадает большое количество высоковирулентного возбудителя, в результате быстро перезаражаются восприимчивые животные. Очень опасны в этом отношении сви-номатки-сальмонеллоносители. Заболевание у них проявляется абортами. В результате чего во внешнюю среду попадает большое количество высокоактивного возбудителя. Большую роль в инфицировании свиней сальмонеллами играют комбикорма с компонентами животного происхождения -боенскими отходами, мясо-костной и рыбной мукой (Окладников Н.И., Безденежных И.С.,1988).
Опасным источником сальмонеллезной инфекции являются и молодые животные - бактерионосители (Ахмедов A.M., 1983; Парахин В.К.,1984; Притулин П.И.,1975; Слинько В.Б.,1984; Романенко В.Ф.,1984). Они длительное время (до года и более) остаются носителями и выделителями возбудителя, инфицируют подстилку, корма, воду, почву, и через них - здоровый молодняк. Бактерионосители являются одним из факторов, обусловливающих стационарность сальмонеллезной инфекции. Длительность сальмонеллоносительства определяется многими моментами: биологией возбудителя, его локализацией в пораженном организме, восприимчивостью животного, гигиеной содержания и условиями кормления и др. Однако, при оптимальных условиях содержания свиней, энзоотические вспышки сальмонеллеза не возникают, наблюдаются лишь спорадические случаи заболевания среди поросят, отстающих в росте и развитии. Это свидетельствует о том, что сальмонеллы становятся болезнетворными только после изменения условий жизни животных или отклонений их физиологического развития (Плященко СИ. с соавт., 1988).
Следует иметь в виду, что сальмонеллоносители имеют и другой аспект эпизоотологической опасности, а именно: поступление таких животных в благополучные хозяйства и обусловливает вспышку сальмонеллеза среди поросят (Ахмедов А.М.,1983).
Таким образом, большую опасность как источники возбудителя сальмонеллезной инфекции представляют: больные животные и сальмонеллоносители; корма животного происхождения (кровяная, костная, рыбная и перьевая мука, молоко, пищевые и боенские отходы); навоз; сточные воды мясокомбинатов, животноводческих комплексов; дикие животные, грызуны, собаки и кошки (Паракин В.К.,1984; Павлов В.Н. с соавт., 1985; Потапова О.А., 1995).
Заражение поросят происходит преимущественно алиментарным путем. Факторами передачи служат подстилка, корма, вода, технологическое оборудование, предметы ухода, загрязненные выделениями больных животных, содержащими сальмонеллы. Ранние случаи заражения происходят и при родах. Важным эпизоотологическим фактором является аэрогенный способ заражения. Животные инфицируются аэрозолью (пылью), содержащей вирулентные сальмонеллы. Возбудитель со слюной и носовыми истечениями заглатывается в желудок; оседает на слизистой носа, носоглоточного кольца и проникает в легкие. Создаются и открываются разнообразные ворота проникновения в организм животных. Нередко факторы передачи возбудителя, при благоприятных условиях (нарушение санитарно-гигиенических норм и правил), становятся субстратом, в котором размножается и накапливается возбудитель.
Материал и методы исследований
Для иммунизации свиноматок и поросят использовали два вида вакцин: вакцину живую против сальмонеллеза свиней из штамма ТС-177 Щелковского биокомбината; ассоциированную вакцину против сальмонеллеза, Омской биофабрики.
Титр противосальмонеллезных агглютининов в сыворотке крови подопытных животных определяли в реакции агглютинации (РА) классическим пробирочным методом, используя комплексный антиген, включающий 1,5 млрд. микробных тел культуры S.choleraesuis и 0,5 млрд. микробных тел S.typhysuis убитых кипячением и 0,2 % формалином.
Для определения количества Т- и В- лимфоцитов в крови свиней применяли метод розеткообразования, включающий выделение взвеси лимфоцитов, инкубацию их с индикаторными частицами и учет реакции.
Выделение взвеси лимфоцитов из крови проводили путем градиентного центрифугирования. Для этого 3 мл. стабилизированного гепарином (25 ИЕ/ мл) крови смешивали с 6 мл. среды 199 и осторожно наслаивали 2,5 мл. градиента плотности. В качестве градиента плотности использовали смесь фикол-верографины с удельным весом 1,077 г./мл., представляющую смесь 84,7 мг 9% раствора фикола с молекулярной массой 400000 с 35,3 мл 34% раствора верографина. Указанную плотность градиента контролировали при температуре 20С с помощью денситометра. После наслаивания крови и среды 199 на градиент плотности пробирки и центрифугировали в течение 30 минут с интерфазной силой 400 Е. По окончании центрифугирования скопившиеся на поверхности лимфоциты переносили в другие си-ликонизированные центрифужные пробирки и дважды отмывали серой 199 в течение 10 минут. После подсчета концентрации лимфоцитов в камере Горяева взвесь лимфоцитов доводили до 2 млн.
Жизнеспособность лимфоцитов определяли по суправитальной окраске с 0,1% раствором трипанового синего. Для этого брали 0,25 мл суспензии лимфоцитов, добавляли 1-2 капли красителя и заправляли камеру Го-ряева. Подсчитывали не менее 100 клеток и определяли среди них процент жизнеспособных лимфоцитов (прозрачные клетки). Ядра мертвых клеток имеют голубоватый цвет.
В качестве индикаторных частиц для Т-лимфоцитов использовали 0,5% взвесь тщательно отмытых эритроцитов барана, хранившихся в растворе Олсвера при температуре + 4С.
Для выявления розеткообразующих Т-лимфоцитов (Е-РОК) 0,2 мл взвеси лимфоцитов (2x10 мл) смешивали с 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов барана в силиконизированных центрифужных пробирках. После тер-мостатирования в течение 10 минут при 37С пробирки центрифугировали 5 минут при 150g., а затем помещали в холодильник (4-5С) на 60 минут. Пробирки извлекали из холодильника, аккуратно плавно перемешивали содержимое и проводили фиксацию клеток. С этой целью в каждую пробирку вносили по 0,1 мл 3%-ного раствора глютарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере с рН 7,4. В последующем после плавного перемешивания смесь оставляли при комнатной температуре на 20 минут. Фиксацию прекращали путем прибавления 5 мл дистиллированной воды. Затем осаждали клетки центрифугированием при 200g в течение 10 минут. После декантирования надосадочной жидкости осадок ресуспензировали в 0,4 мл дистиллированной воды. Затем, полученную суспензию наносили на хорошо подготовленное предметное стекло, уложенное строго горизонтально. Подготовку предметных стекол осуществляли по общепринятой методике. Для обезжиривания применяли жидкость Никифорова. После высушивания на воздухе препараты фиксировали метанолом в течение 5 минут и окрашивали краской Романовского-Гимза. Учет реакции проводили в световом микроскопе под иммерсионной системой. В - лимфоциты идентифицировали способом спонтанного розеткообразования по методике Бабаяна В.А., Коломыцева А.А., Геворгяна А.С. (1988). При этом в качестве индикатора использовали эритроциты мыши. К 0,2 мл взвеси лимфоцитов (2x10/мл) добавляли 0,2 мл 1,5% взвеси эритроцитов мыши. Смесь осаждали при 1000 об/мин. в течение 5 минут, затем инкубировали при 37С 5 минут и при 4С 16-18 часов.
Теоретическое обоснование конструирования тканевого иммунотропного препарата пролонгированного действия
В настоящее время большинство исследователей считают, что появление и распространение желудочно-кишечных инфекционных болезней молодняка сельскохозяйственных животных является следствием несоответствия потребностей организма изменившимися условиям содержания, кормления и ухода, которые расцениваются как стрессовые (Ефанова Л.И., 1999; Прудников СИ. с соавт., 1997; 2002; Федоров Ю.Н. с соавт., 1982; ШаховА.Г.1999;2002идр.).
В научной литературе такие болезни определяют как факторные. Их пусковым механизмом оказались многочисленные стресс-факторы, присущие интенсивным технологиям. Борьба с факторными инфекционными болезнями существенно отличается от классических, которые в большинстве случаев удается профилактировать с помощью вакцин. В отношении факторных болезней этот подход носит чаще вспомогательный характер (Джупина С.И.,2002). Это связано с тем, что возбудители факторных инфекционных болезней, в частности, желудочно-кишечных, как правило, постоянно переживают в организме здоровых животных. Более того, одни микроорганизмы, как кишечная палочка, участвуют в физиологических процессах пищеварения. Свои патогенные потенции возбудители факторных инфекционных болезней проявляют при выраженном изменении условий жизнедеятельности облигатного хозяина, приводящих к снижению резистентности организма и развитию иммунодефицитов. На таком фоне попытки профилактировать развитие инфекционного процесса при желудочно-кишечных заболеваниях с помощью вакцин, антибиотиков, химиотера-певтических препаратов не дают желаемого результата. Более того применение живых вакцин и антибиотиков может вызвать усиления процесса иммуносупрессии и как следствие тяжелое развитие болезни. В этой связи разработка и применение иммуностимуляторов, действие которых направлено на повышение резистентности организма животных, заслуживает особого внимания. По мнению большинства исследователей механизм действия неспецифических иммунокорректоров существенно шире, чем принято считать и они способны значительно повысить эффективность традиционной профилактики и терапии болезней (Масычева В.И. с соавт., 1997; Прудников СИ., Прудникова Т.М., 1997; Уша Б.В., Беляков И.М., 1999; Федоров Ю.Н. с соавт., 1982).
Теоретическое и практическое разрешение проблем факторных инфекционных заболеваний у животных путем разработки и применения новых высокоэффективных экологически безопасных препаратов из сырья животного и растительного происхождения в последнее время привлекает все большее внимание отечественной и зарубежной науки и практики.
Особенно активно эти исследования проводятся в Китае, Кубе, Германии, Швейцарии, Испании, США. Следует отметить, что ведущиеся в этой области работы обычно носят закрытый характер, как по методологии, так и целям, что само по себе указывает на их возрастающую актуальность.
Вышеперечисленные обстоятельства послужили основанием для целенаправленного проведения исследований по разработке комплексного иммунотропного препарата, который был бы технологичен в изготовлении и состоял из доступного сырья и химических компонентов. При разработке такого иммунотропного препарата наше внимание привлекла возможность исследования для этой цели янтарной кислоты.
Сама по себе янтарная кислота - универсальный биогенный стимулятор обмена веществ живой клетки, естественный эндогенный субстрат окислительно-восстановительных процессов (цикл Кребса) в живых организмах. Избирательность действия экзогенной янтарной кислоты заключается в том, что она «плохо» проникает в нормальные ткани, значительно легче в клетки и ткани, находящиеся в состоянии возбуждения или патологически измененные. В этой связи применение янтарной кислоты показано для повышения устойчивости к неблагоприятным воздействиям внешней среды, в частности, при стрессовых ситуациях, интенсивных физических нагрузках, всевозможных нарушениях обмена веществ и интоксикациях. Высокая антиоксидантная и антигипоксическая активность янтарной кислоты нашла применение в хорошо известном в дезинтаксикационном растворе «Реамберин». Данный препарат с успехом применяется в клинике лечения вирусных гепатитов, острых кишечных инфекций и других инфекционных заболеваниях сопровождающихся выраженным токсикозом. В настоящее время экспериментально доказано высокое противоопухолевое действие янтарной кислоты (Парфенова И.Е. с соавт., 2003).
