Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени значительно
озрос уровень знаний о природе патогенносте микроорганизмов-озбудителей заболеваний человека и животных. Одним из основных іакторов патогенносте бактерий является их способность продуцировать оксины.(Вертиев Ю.В.,1991,1996; Celemin С,1995). Этой способностью бладают многие грамотрицательные бактерии. В настоящее время обь-ктом исследований ученых являются роды Vibrio, Shigella, Salmonella, roteus, Clostridium, Campylobacter, Yersinia, Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella (Бондаренко B.M., 1997). Одним из основных возбудителей иарейных заболеваний, широко распространенных среди людей, сель-кохозяйственных животных и, в частности, пушных зверей являются нтеротоксигенные эшерихии. Из 1 миллиарда ежегодно заболевших де-ей 3 миллиона умирают (Chavasse D.C.,1994). Неблагополучной по эше-ихиозам остается статистика и в ветеринарии, где регистрируется до 0% случаев заболеваемости (Nunos М., 1996).
На долю эшерихии и других энтеробактерий приходится до 70%
бсемененных патогенной микрофлорой кормов и патматериала от пуш-
[ых зверей. До 50% выявленных эшерихии несут детерминанты, обу-
ловливающие их LT и ST энтеротоксигенность (Smeth N.W. et. al., 1967,
daas R. et. al., 1985). Серьезную тревогу у медиков и ветеринаров вызы
вает ситуация с распространением энтерогеморрагических эшерихии и
[риобретение ими новых сочетаний инфекционных свойств (Пайков
J.A.,1994; Blanco І.Е.,1996; Ратинер Ю.А. и др., 1998). Нередко ха-
рактер заболевания зависит не столько от вида микроорганизма, участ-
2 вующего в инфекционном процессе, сколько от типа токсина, который он продуцирует. В данном случае речь идет о термолабильном (LT), термостабильном (ST) и шига-подобном энтеротоксинах, из которых доля термолабильного энтеротоксина в острых кишечных заболеваниях значительна (Петровская В.Г., 1990).
Поскольку токсикоинфекции, обусловленные различными представителями семейства энтеробактерий, наносят серьезный ущерб сельскому хозяйству и звероводству в том числе ( Сидоров М.А., 1984, Новак Д.Д., 1995), весьма актуальной задачей является борьба с ними.
Серьезная роль в борьбе с токсикоинфекциями отводится ранней диагностике. Несмотря на то, что показана связь серогруппы с определенными типами продуцируемых энтеротоксинов, нет четкой корреляции между продукцией энтеротоксинов и наличием определенных соматических (О) и капсульных (К) антигенов у эшерихии (Полякова О.А. и др.,1986). Исходя из этого, целесообразным представляется определение непосредственно токсинов. К сожалению, до настоящего времени простых и достаточно надежных методов детекции токсинов не разработано.
Недостатков, присущих биологическим методам, лишены имму-
нохимические методы определения энтеротоксинов, основанные на при
менении специфических антитоксических сывороток. Оптимальной, на
наш взгляд, является разработка иммуноферментных тест-систем для де
текции токсинов. Идеальным инструментом для создания
подобных методов индикации энтеротоксинов эшерихии являются моно-
клональные антитела (мкАт). В последние годы за рубежом поя
вились публикации о создании гибридом, продуцирующих моноклональ
ііе антитела к LT и ST энтеротоксинам эшерихий. Разработаны также ердофазный ИФА метод для определения STa энтеротоксина на основе сАт (Thompson М., 1984) и тест-системы для определенияЬТ и СТ энте-п-оксинов (Germani Y., 1984). Получены также мкАт к адгезину К99 lills К., 1984) и на их основе создан препарат для лечения диареи телят ^арег В. et al., 1996). Данных о ИФА тест-системах на основе мкАт для іределения термолабильного энтеротоксина эшерихий на момент вы-тнения данной работы в доступной нам литературе сообщений не най-
!Н0.
Цель исследования. Целью настоящего исследования является поучение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к различай типам термолабильного энтеротоксина эшерихий и использование кАт для разработки иммуноферментной тест-системы с целью детекции Г энтеротоксина в объектах ветнадзора.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следую-ие конкретные задачи:
-
Отработать оптимальные условия гибридизации.
-
Создать гибридомы, продуцирующие мкАт к термолабильному ггеротоксину эшерихий.
-
Изучить основные свойства полученных мкАт (специфичность, зоэлектрическая точка, аффинность, субкласс иммуноглобулинов, элек-юфоретическая подвижность).
-
Разработать на основе полученных мкАт иммуноферментную гст-систему для качественного определения термолабильного энтеро-эксина эшерихий.
Научная новизна исследования. Новизна настоящего исследования состоит в том, что получен уникальный набор мкАт против LTh, подробно исследована специфичность полученных мкАт. Данные мкАт были использованы для разработки оригинальной иммуноферментной тест-системы для качественного определения термолабильного энтеротоксина эшерихий.
На основе полученных мкАт показана возможность очистки термолабильного энтеротоксина из лизатов продуцентов LT на иммуносор-бентах (Давыдова Л.И., 1998).
Практическая ценность работы. Данная работа может служить методологической основой для создания и характеристики мкАт против различных вариантов термолабильного энтеротоксина и использования их в тест-системах для определения соответствующих антигенов в объектах ветнадзора.
Практическая ценность состоит в том, что на основе полученных мкАт разработана иммуноферментная тест-система для качественного определения термолабильного энтеротоксина эшерихий. По сравнению с широко используемыми биологическими пробами настоящая тест-система специфична, высокочуствительна, воспроизводима, что позволяет использовать ее для массового определения термолабильного энтеротоксина в объектах ветнадзора.
Полученные мкАт можно использовать для разработки новых прогрессивных технологий выделения и очистки препаратов энтероток-синов с целью практического их применения в сельском хозяйстве, в т.ч.
звероводстве, а также для создания стандартов энтеротоксинов для исследовательских целей.
Основные положения, которые выносятся на защиту:
создание гибридом, продуцирующие мкАт к различным типам термола-Зильного энтеротоксина эшерихий;
получение и характеристика мкАт к LTh;
разработка на основе полученных мкАт иммуноферментной тест-:истемы для качественного определения LT эшерихий в лизатах.
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на:
-Секции пушного звероводства РАСХН (НИИПЗиК им. В.А.Афанасьева, 1998);
-Научной сессии Россельхозакадемии "Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки в России" ( 1998); Межлабораторном заседании сотрудников НИИПЗиК им. В.А. Афанасье-їа (1998);
Методкомиссиях отдела им. НИИПЗиК им. В.А. Афанасьевав процессе зыполнения работы (1991-1997).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, иллюст-)ирована 28 таблицами, 16 рисунками, 4 фотографиями. Работа состоит із введения, обзора литературы,, материалов и методов исследования, ре-[ультатов исследований, обсуждения результатов, выводов, списка лите-)атуры, приложений. Указатель цитируемой литературы включает 263 істочника, в том числе 209 иностранных авторов.