Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Специфическая профилактика бруцеллеза сельскохозяйственных животных 11
1.2. Методы определения количества жизнеспособных бактерий 15
1.2.1. Прямые методы анализа жизнеспособности микробной культуры 16
1.2.2. Косвенные методы определения количества жизнеспособных микробных клеток 18
1.2.2.1. Определение количества жизнеспособных микробных клеток биолюминесцентным методом при помощи люцифе-рин-люциферазной системы светляков 22
1.2.2.2. Применение люциферазы светляков для решения биоаналитических задач 23
1.2.2.3. Методология биолюминесцентного определения количества микробных клеток 25
1.2.2.4. Подготовка образцов для определения АТФ 25
1.2.2.5. Методы экстракции внутриклеточного АТФ 25
1.2.2.6. Применение АТФ-метрии для контроля качества лиофили-зированных вакцин 28
ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
2.1. Материалы и методы 31
2.2. Методики проведения экспериментов 33
2.2.1. Определение оптической концентрации бактерий 33
2.2.2. Определение количества живых бактерий чашечным методом 34
2.2.3 Измерение концентрации АТФ в бактериальных суспензиях биолюминесцентным методом 34
2.2.3.1. Приготовление растворов и экстрактов АТФ 34
2.2.3.2. Измерение биолюминесцентного сигнала 36
2.2.3.3. Расчет концентрации АТФ 36
2.2.3.4. Расчет количества жизнеспособных клеток по результатам биолюминесцентных измерений 37
2.2.3.5. Статистическая обработка результатов 37
2.3. Результаты собственных исследований 39
2.3.1. Влияние внеклеточного АТФ в образцах вакцины на интенсивность сигнала биолюминесценции 39
2.3.2 Калибровка АТФ-реагента при использовании стандартных АТФ-растворов 42
2.3.3. Определение оптимальных объемов реакционной смеси (реагент-испытуемый образец) 43
2.3.4. Изучение экстрагирующих свойств неонола-10 и влияния продолжительности экспозиции образца в экстрагенте на интенсивность биолюминесцентного сигнала 44
2.3.5. Определение возможности получения экстрактов лиофи-лизированной культуры бруцелл в ДМСО
2.3.6. Влияние длительности инкубирования водной суспензии бруцелл после восстановления лиофилизированной культуры на концентрацию АТФ 46
7. Определение количества жизнеспособных клеток в лиофилизированных вакцинах Brucella abortus 47
8. Биолюминесцентное определение количества жизнеспособных бруцелл в лиофилизированных бруцеллезных вакцинах на разных сроках хранения 55
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 58
ВЫВОДЫ 64
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 65
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 66
ПРИЛОЖЕНИЯ 91
- Специфическая профилактика бруцеллеза сельскохозяйственных животных
- Приготовление растворов и экстрактов АТФ
- Влияние внеклеточного АТФ в образцах вакцины на интенсивность сигнала биолюминесценции
Введение к работе
Бруцеллез сельскохозяйственных животных, являясь широко распространенной инфекцией, наносит существенный экономический ущерб животноводству, обусловленный массовыми абортами, бесплодием и яловостью маточного поголовья, снижением их продуктивности и жизнеспособности приплода, а также затратой значительных сил и средств на его ликвидацию [31, ПО].
Бруцеллез является зоонозом и относится к особо опасным инфекционным заболеваниям [1, 116].
В России для борьбы с бруцеллезом животных проводится комплекс организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий, успех которых во многом определяется применением средств специфической профилактики, преимущественно живых сухих вакцин [116, 215].
Продолжительность жизнеспособности бруцелл в составе вакцины требует соблюдения ряда условий [32, 87]. В частности, на выживаемость бруцелл при производстве и в процессе хранения вакцин влияют физические, химические и биологические факторы [4, 71, 79, 121, 130]. При этом количество жизнеспособных микробных клеток определяет количество иммунизирующих доз в конкретном объеме вакцины, а их количество в дозе, наряду со свойствами штаммов - ее иммуногенность. В связи с этим, контроль выживаемости бруцелл в живых бруцеллезных вакцинах осуществляют на предприятии-производителе при их выпуске, а также в ФГУ «ВГНКИ» в порядке проведения контроля за сертифицированной продукцией в процессе хранения [57, 63, 72, 111].
В настоящее время для этой цели используют культуральный и биохимический методы. Культуральный метод (определение количества живых бруцелл - колониеобразующих единиц (КОЕ) по числу колоний бруцелл, выросших на плотной питательной среде) является достаточно трудоемким и позволяет получить результат через 5 суток. Биохимический метод (в част-
ности, оценка дегидрогеназной активности бруцелл в отношении метиленового синего) проще по воспроизведению и сокращает время анализа до 5-6 часов.
Однако результаты исследований, полученные с помощью этих методов, не всегда коррелируют [40, 56, 152]. Анализ данных литературы, посвященной контролю выживаемости микроорганизмов в живых бактерийных вакцинах, показал, что с начала второй половины прошлого века были предложены и апробированы «косвенные» экспресс-методы, основанные на измерении какого-либо физико-химического параметра образца, абсолютная величина которого или её изменение пропорциональны количеству жизнеспособных клеток в образце. Среди достаточно большого разнообразия таких методов высокой точностью и воспроизводимостью отличались методы, основанные на определении содержания различных внутриклеточных или внеклеточных метаболитов, в первую очередь, внутриклеточного аденозин-трифосфата (АТФ), содержащегося в относительно высоких концентрациях в клетках любых микро- и макроорганизмов. Количество АТФ с большой точностью можно определить при помощи биолюминесцентного метода даже при ультрамалом содержании в образце - до 10"14 -10"15 моль/кювета люми-нометра [20, 142]. Причем, после гибели клетки содержание АТФ в них, в отличие от других внутриклеточных метаболитов, резко снижается в течение нескольких секунд [155]. Таким образом, количество АТФ коррелирует с количеством живых микробных клеток, содержащихся в анализируемом образце.
Процедура биолюминесцентного определения АТФ получила достаточное распространение в разных областях биометрии. Многие фирмы производят коммерчески доступные АТФ-реагенты и приборы для детекции биолюминесценции - люминометры, как портативные, так и стационарные. Их стоимость, по сравнению с большинством оптических приборов, невелика. Следует отметить, что биологические образцы, как правило, помимо
микробного (целевого) АТФ содерлшт внеклеточный АТФ в концентрациях, часто превышающих концентрацию целевого на несколько порядков [104, 139]. Поэтому для правильного определения микробного АТФ необходимо проводить специальную пробоподготовку образца, включающую такие стадии, как концентрирование микробных клеток и/или удаление из образца нецелевого АТФ. Методика пробоподготовки образца зависит от его состава, поэтому для конкретного образца очень важно подобрать и оптимизировать условия её проведения. От этого зависит возможность широкого практического использования биолюминесцентного метода в биотехнологических производствах.
С учетом вышеизложенного, совершенствование процедуры определения количества жизнеспособных микробных клеток в бруцеллезных вакцинах представляется актуальной.
Цель работы. Разработка методики определения количества живых бактерий в бруцеллезных вакцинах, основанной на использовании биолюминесцентного метода.
Основные задачи исследования.
Оптимизировать порядок подготовки образцов нативных и лиофили-зированных культур бруцелл для измерения концентрации внутриклеточного АТФ.
Установить оптимальные параметры определения количества живых микробных клеток в суспензиях нативных и лифилизированных культур бруцелл биолюминесцентным методом.
Провести сравнительное исследование методик определения живых бруцелл на основе биолюминесцентного и культурального методов с использованием коммерческих серий бруцеллезных вакцин.
Разработать методические рекомендации по определению количества живых бактерий в бруцеллезных вакцинах с использованием биолюминесцентного метода.
Научная новизна.
Впервые изучены и определены оптимальные параметры пробоподго-товки, установлены возможность и порядок определения количества живых бруцелл разных видов в составе бруцеллезных вакцин и бактерийных суспензий биолюминесцентным методом.
Практическая значимость.
Применение биолюминесцентного метода для определения количества живых бруцелл позволяет:
сократить время контроля выживаемости бруцеллезных вакцин в 5-10 раз, в сравнении с культуральным методом, исключив при этом использование питательных сред;
значительно уменьшить контакт технического персонала биопредприятий с вакциной, предохранив его тем самым от сенсибилизации.
Апробация полученных результатов.
Основные материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на 5-ой Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных» (Омск, 2006г.), конференциях молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2006, 2007г.) и заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.).
Положения, выносимые на защиту:
порядок подготовки образцов нативных и лиофилизированных культур бруцелл для измерения концентрации внутриклеточного АТФ;
порядок определения количества жизнеспособных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом;
результаты сравнительного изучения выживаемости микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным и культуральным методами.
Публикация результатов исследований.
По теме диссертационной работы опубликовано 4 научные статьи, в том числе 2 - в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 92 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 4 схемами. Список литературы содержит 218 источников, в том числе 101 иностранный.
Специфическая профилактика бруцеллеза сельскохозяйственных животных
Бруцеллез - хронически протекающая болезнь, вызываемая бактериями, объединенными под общим родовым названием Brucella, проявляющаяся часто абортами с последующим задержанием последа, развитием эндометрита и, как следствие, нарушением воспроизводительной функции животных. У отдельных особей бруцеллез может сопровождаться серозными бурситами, гигромами, артритами, тендовагинитами, у мужских - орхитами и эпидидимитами, а у женских - маститами. У свиней заболевание характеризуется появлением абсцессов в подкожной клетчатке и паренхиматозных , органах, параличами мышц таза и конечностей; у лошадей - бурситами в области затылка и холки. Однако, как правило, у большинства животных бруцеллез протекает без видимых клинических признаков [1,31, 110, 116].
Заражению бруцеллами подвержены все виды сельскохозяйственных, домашних и диких животных, а также человек. Кроме того, возбудителя изолировали от некоторых видов холоднокровных и членистоногих. Это обусловлено приспособляемостью и способностью возбудителя бруцеллеза размножаться в организме животных и долго сохранять жизнеспособность во внешней среде [1, 122].
Основу профилактики и ликвидации бруцеллеза животных в РФ составляет система организационно-хозяйственных, зоогигиенических и вете-ринарно-санитарных мероприятий, направленных на разрыв эпизоотической цепи и заключающихся в предупреждении заноса возбудителя в хозяйство, создании оптимальных условий содержания и кормления животных, изолированном выращивании молодняка, проведении дезинфекции и дезинсекции, применении средств специфической профилактики, средств и методов диагностики заболевания, своевременном убое больных животных [33, 75, 116, 117, 145,160, 192]. При этом многие исследователи считают, что применение средств специфической профилактики бруцеллеза делает эту систему более эффективной [8, 27, 28, 49, 50, 73, 98, 99, 109, 141].
Сегодня специфическую профилактику бруцеллеза проводят с помощью живых и инактивированных вакцин, попытки разработать которые были предприняты практически с момента открытия возбудителя болезни. При этом исследователи были весьма изобретательны [82, 134, 140, 169].
Так, с целью создания высокоэффективных и безопасных для человека и животных средств специфической профилактики бруцеллеза ученые направили свои усилия на получение штаммов бруцелл с ослабленными патогенными свойствами путем пассирования культур полевых штаммов через организм рыб [70], ядовитых змей [13], куриные эмбрионы [35, 36], воздействием на культуры бруцелл электромагнитными волнами высокой частоты и последующим неоднократным пассированием через организм амфибий и рептилий [2]. Ослабление вирулентности культур бруцелл достигали также путем воздействия на них антибиотиками [35, 153, 183, 204], ультрафиолетовыми лучами [196, 197] и бруцеллезными фагами [76].
Установление факта наличия стерильного постинфекционного иммунитета при бруцеллезе послужило обоснованием возможности воспроизведения иммунитета с помощью вакцин из убитых бруцелл [6, 17, 25]. Многочисленные исследования по разработке вакцин из убитых бруцелл [136, 144, 166, 177], клеточных стенок и других антигенных фракций [14, 15, 21, 91, 148, 153] дают очень разноречивые сведения об их эффективности [90]. Одни исследователи считают убитые вакцины малоэффективными и объясняют это тем, что стерильный иммунитет при бруцеллезе весьма краток и относителен по напряженности [13, 18, 19, 125]. Другие - придерживаются мнения о возможности создания высокоиммуногенных противобруцеллезных препаратов из убитых бруцелл путем применения различных иммуностимуляторов [22, 39, 118, 132, 178, 216] и создания рибосомальных вакцин [119, 187]. Последние сообщения [128, 188] об успешном применении в ряде стран таких вакцин в комплексе мер по профилактике и ликвидации бруцеллеза указывают на перспективность этого направления. В то же время, большинство исследователей придерживается мнения, что подобные препараты могут быть применены только на крупном рогатом скоте хозяйств, благополучных, угрожаемых или с ограниченным распространением этой инфекции. В зоне с широким распространением бруцеллеза и отгонного животноводства, по мнению этих авторов, необходимо применять вакцины бруцелл с более высокой остаточной вирулентностью [23, 84, 170]. Хотя такие инактивирован-ные адъювант-вакцины, как французская - из штамма Br. abortus 45/20 или сконструированная в ВГНКИ инактивированная адъювант - вакцина из штамма Br. abortus KB 17/100, пожалуй, опровергают это мнение [12, 44, 113, 217].
Приготовление растворов и экстрактов АТФ
В каждом эксперименте по измерению биолюминесценции опытных образцов проводили калибровку активности АТФ-реагента при помощи стандартных АТФ-растворов.
Для приготовления стандартных АТФ-растворов использовали водный раствор АТФ с концентрацией 10"6 моль/мл. Аликвоту водного раствора АТФ с концентрацией 10 6 моль/мл размораживали и разбавляли свежеперегнан-ным ДМСО или 1 % раствором неонола-10 (в зависимости от задачи опыта), получая стандартные растворы АТФ с концентрациями 10"10, 10"п, 10"12 моль/мл.
Первоначально для анализа лиофилизированных вакцин из различных серий содержимое ампул регидратировали до первоначального объема дистиллированной водой. Полученные образцы разбавляли в 100 раз дистиллированной водой, отбирали аликвоты (0,1 мл) и добавляли по 0,9 мл ДМСО или 1 % раствора неонола-10 (в зависимости от задачи опыта), получая АТФ-экстракты, которые замораживали (по 0,5 мл) и хранили при -20 С до использования.
В последующих опытах сухую исследуемую вакцину растирали стерильным шпателем до образования однородной порошкообразной массы. Из этой измельченной вакцины отбирали навески массой 50 мкг и 100 мкг (в зависимости от задачи опыта), ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды, помещали в холодильник при (4-6) С на 30 мин. Затем из этой бактериальной суспензии автоматическим дозатором отбирали аликвоты по 0,1 мл и вносили в пробирки Эппендорф, содержащие по 0,9 мл ДМСО, получая АТФ-экстракты. Данные образцы замораживали в низкотемпературном холодильнике и хранили до исследования.
На заключительном этапе данной работы массу сухой вакцины определяли по разнице веса флаконов с вакциной перед регидратацией стерильной дистиллированной водой до первоначального объема и пустых сухих флаконов с пробками после извлечения вакцины. Разведенную вакцину выдерживали в холодильнике при (4-6) С в течение 20 мин., разводили так, чтобы в 1 мл суспензии содержалось 100 мкг сухой вакцины. Аналогично вышеописанному готовили АТФ-экстракты из данных образцов вакцины. Измерение биолюминесцентных сигналов проводили при помощи АТФ-реагента «МИКРОЛЮМ» на люминометре «Биотоке-ЮМ».
За 30-60 минут до использования сухой АТФ-реагент реконструировали согласно инструкции деионизированнои водой, полученной на установке Milli-Q («Millipore», Франция). В кювету люминометра автоматическим дозатором вносили 0,05 или 0,09 мл реконструированного АТФ-реагента и регистрировали фоновый биолюминесцентный сигнал (I фон). Затем в ту же кювету вносили 0,01, 0,02 или 0,05 мл анализируемого образца (в зависимости от задачи исследования), тщательно перемешивали реакционную смесь, быстро прокачивая содержимое кюветы через наконечник автоматического дозатора, и измеряли максимум интенсивности биолюминесцентного сигнала (/ тах). Из (/ тах) вычитали (/ фон), получая абсолютное значение биолюминесцентного сигнала образца (I обр).
Влияние внеклеточного АТФ в образцах вакцины на интенсивность сигнала биолюминесценции
Определение оптимального соотношения объемов «образец - реагент» при измерении образцов бруцеллезной вакцины, обработанной ДМСО и не-онолом-10, проводили на люминометре «Биотоке-ЮМ». ДМСО - органический растворитель, представляет собой гигроскопичную жидкость без цвета и запаха, которая легко переохлаждается, неонол-10 (оксиэтилированный моноалкилфенол на основе тримеров пропилена) - высокоэффективное не-ионогенное поверхностно-активное вещество. Оба широко применяются как экстрагирующие вещества. Для этого испытуемую вакцину из штамма В. abortus 19 ресуспендировали стерильной дистиллированной водой до первоначального объема, выдерживали в течение 30 мин при t + 4 С. Затем автоматическим дозатором отбирали по 100 мкл суспензии данной вакцины и переносили в пробирки типа «Эппендорф», в которые заранее были внесены 900 мкл ДМСО либо 1 % раствор неонола-10 в том же объеме.
Непосредственно перед измерением биолюминесцентного сигнала в одни стрипы добавляли 90 мкл АТФ-реагента и 10 мкл экстрактов вакцины, в другие - по 50 мкл АТФ-реагента и экстрактов.
При этом было установлено, что биолюминесцентный сигнал при соотношении объемов «испытуемый образец - АТФ-реагент» 10 мкл:90 мкл выше, чем при соотношении объемов 50 мкл:50 мкл. Результаты исследования показаны в таблице 6.
В заключительных опытах перешли на следующее соотношение компонентов реакционной смеси: 0,02 мл АТФ-экстракта образца - 0,05 мл деи-онизованной воды - 0,05 мл АТФ-реагента. Такое соотношение объемов было использовано с целью экономии АТФ-реагента. Коэффициент корреляции между концентрацией АТФ стандартного раствора и биолюминесцентным сигналом при соотношении объемов 10:90 и 20:50:50 составил Rs - 0,99.
Недостатком всех экстрагентов является их высокое ингибирующее влияние на люциферазу светляков.
По литературным данным нами были выбраны два экстрагента: неонол-10 и ДМСО, - обладающие более выраженными экстрагирующими свойствами, чем ряд других препаратов.
Для изучения их экстрагирующих свойств образцы культуры вакцинного штамма В. abortus 19 (лиофилизированная культура; 1 сутки инкубирования; 2 суток инкубирования - (все культуры были доведены по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича на 10 ед. до концентрации 1,65 х 109 микробных клеток в 1мл) разбавляли в неоноле-10 и ДМСО. При разведении неонолом использовали маточные растворы неонола-10 с концентрацией 20 % и 30 %, получая при этом 10, 15 и 20 % растворы неонола-10 в суспензии бактериальных клеток. Непосредственно перед измерением сигнала биолюминесценции все образцы доводили до концентрации неонола-10 в растворе до 1 %, т. к. неонол-10 в высоких концентрациях ингибиру-ет интенсивность экстракции АТФ. Измерение сигналов биолюминесценции от образцов проводилось при одинаковых соотношениях объемов «образец -реагент» - 10 мкл:90 мкл. При расчете концентрации АТФ учитывали.
