Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8 стр.
1.1. Микробиологический контроль производства кисломолочной продукции 8 стр.
1.2. Закваска, микрофлора и виды порчи кисломолочного творога 13 стр.
1.3. Краткие сведения об изучении бактериофагии микроорганизмов 16 стр.
1.4. Репродукция и классификация бактериофагов 19 стр.
1.5. Свойства бактериофагов и фагорезистентность молочнокислых бактерий 24 стр.
1.6. Лизогенные культуры молочнокислых микроорганизмов 28 стр.
1.7. Источники бактериофагов и их влияние на
качество кисломолочных продуктов и сыров 32 стр.
1.8. Пути борьбы с лактофагами 34 стр.
1.9. Роль санитарно-гигиенического состояния в
профилактике явления бактериофагии на производстве 36 стр.
2. Материалы и методы исследований 38 стр.
2.1. Организация проведения экспериментальных исследований 38 стр.
2.2. Методы выявления лактофагов 40 стр.
2.3. Статистическая обработка данных 43стр.
3. Результаты собственных исследований 44 стр.
3.1. Микрофлора заготовляемого сырого молока 44 стр.
3.1.1. Уровень обсеменения сырого молока
лактобактериями и лактококкофагами 47 стр.
3.1.2. Частота и интенсивность обсеменения сырого молока бактериями группы кишечных палочек 50 стр.
3.1.3. Содержание Е.соН и колифагов в сыром молоке 53 стр.
3.1.4. Микрофлора бактофугированного и пастеризованного молока 58 стр.
3.1.5. Микрофлора сухого обезжиренного молока 66 стр.
3.1.6. Эффективность методов выявления лактококкофагов с использованием различных заквасочных культур 69 стр.
3.1.7. Сравнительный анализ методов выявления лактококкофагов при производстве творога 80 стр.
3.1.8. Микрофлора воздуха цехов производства кисломолочных продуктов 81 стр.
3.1.9. Микрофлора и эффективность дезинфекциипроизводственного оборудования 88 стр.
3.2. Микрофлора объектов производства творога 90 стр.
выводы 94 стр.
практические предложения 95 стр.
список литературы
- Закваска, микрофлора и виды порчи кисломолочного творога
- Методы выявления лактофагов
- Частота и интенсивность обсеменения сырого молока бактериями группы кишечных палочек
- Эффективность методов выявления лактококкофагов с использованием различных заквасочных культур
Введение к работе
Актуальность темы. Важнейшим требованием современного рынка молочной продукции является её стабильное качество и микробиологическая безопасность. Одним из факторов их обеспечения при производстве кисломолочных продуктов является интенсивность и направленность процесса сквашивания.
Главными причинами снижения интенсивности кислотообразования при
сквашивании являются: использование молока, содержащего ингибирующие
вещества и молока с недостаточным количеством сухих веществ, несоблюдение
технологических режимов и, наконец, несоответствие качества сырья и условий
производства санитарно-гигиеническим требованиям, а также использование
молока, пораженного бактериофагами полезной микрофлоры (В.И. Ганина,
В.Ф. Семенихина МГУПБ, 1999). Как показывает повседневная
производственная практика, проблема бактериофагии на
молокоперерабатывающих предприятиях в настоящее время стоит достаточно остро, что обусловливает необходимость проведение фагового мониторинга с целью снижения рисков экономических потерь, связанных с фаговой инфекцией.
Теоретические и практические основы в изучении явления бактериофагии в молочной промышленности заложены в трудах В.З. Ахвердяна, Л.А. Банниковой, В.И. Ганиной, А.В. Гудкова, И.Р. Волковой, Н.С. Королевой, Н.Ф. Кувалдиной, Л.Г. Мытник, Г.Д. Перфильева, В.Ф. Семенихиной, П.П. Степаненко, Д.А. Яковлева, Н. Ackermann, V. Braun, A. Coffey, С. Hill, A. Jarvis, T.R. Klaenhammer, P. Laux, S. Moineau, H. Neve, B. Terzaghi, M. Teuber и др.
Изучением явления бактериофагии учёные занимаются несколько десятилетий, тем не менее, существует ряд нерешённых проблем, определивших цель и задачи настоящего исследования.
Цель работы и задачи исследований. Целью настоящей диссертационной работы явилось определение источников и интенсивности контаминации объектов кисломолочного производства творога лактококкофагами, санитарно-показательными и другими микроорганизмами, характеризующими санитарное состояние производства и предложение практических рекомендаций по его улучшению.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
изучить микрофлору и оценить санитарное состояние заготовляемого сырого и сухого обезжиренного молока;
определить источники и интенсивность контаминации лактококкофагами основных объектов кисломолочного производства творога;
определить наиболее эффективный метод выявления лактококкофагов в объектах кисломолочного производства творога;
подобрать наиболее приемлемую заквасочную культуру для обнаружения лактококкофагов;
проанализировать динамику микрофлоры на различных этапах производства творога;
определить оптимальный метод выявления микроорганизмов в воздухе;
для снижения контаминации объектов производства предложить усовершенствованный метод дезинфекции производственных цехов и молочного оборудования.
Научная новизна. Впервые выявлена достоверная зависимость между общей бактериальной обсеменённостью, концентрацией молочнокислых бактерий и титром лактококкофагов в объектах производства творога, определены основные источники и интенсивность контаминации лактококкофагами объектов кисломолочного производства творога, что позволит объективно оценивать фаговую ситуацию на молокоперерабатывающих предприятиях.
Предложен новый научно - обоснованный эффективный метод выявления лактококкофагов в различных объектах кисломолочного производства, позволяющий точно определять источники и интенсивность контаминации производимой продукции лактококкофагами: в частности, подобрана тест-культура, использование которой обеспечивает высокую эффективность метода определения лактококкофагов.
Изучена динамика микрофлоры на различных этапах производства творога, что позволяет оценивать микробиологическую ситуацию и осуществлять профилактику развития возбудителей порчи и условно-патогенных микроорганизмов.
Практическая значимость работы. Разработана рабочая инструкция методов обнаружения бактериофагов, что даёт возможность быстро и эффективно проводить анализ и оценивать фаговую ситуацию на различных этапах кисломолочного производства творога.
В условиях молокоперерабатывающего предприятия определено санитарное состояние сырья, других объектов производства творога и даны практические рекомендации по его улучшению.
Предложен эффективный метод определения микроорганизмов в воздухе, позволивший значительно повысить выявляемость различных групп микроорганизмов.
Внедрён в производственную практику усовершенствованный метод дезинфекции производственных цехов и молочного оборудования, в результате чего уменьшается общая микробиальная обсеменённость и количество лактококкофагов в указанных объектах производства.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на Международных научно-практических конференциях: «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции», (М., МГУПБ,
2004); «Живые системы и биологическая безопасность населения», (М., МГУПБ, 2006).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на
страницах машинописного текста и включает введение, обзор
литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Диссертация содержит 22 рисунка, 17 таблиц. Список литературы включает 155 источников, в том числе 52 иностранных.
Положения, выносимые на защиту. Изучена микрофлора и оценено санитарное состояние заготовляемого сырого и сухого обезжиренного молока. При этом статистически доказано, что лактококкофаги и колифаги могут служить показателем санитарного состояния перерабатываемого молока.
Определены основные источники обсеменения и интенсивность контаминации лактококкофагами других объектов кисломолочного производства творога: молочное сырье, не подвергавшееся тепловой обработке.
Определен эффективный метод выявления лактококкофагов в различных объектах кисломолочного производства: метод агаровых слоев с использованием в качестве тест-культуры штамма Lactococcus lactis.
Изучена динамика изменения микрофлоры на различных этапах производства творога: инактивация фагов сырого молока в процессе пастеризации с последующим возрастанием их титров в процессе сквашивания.
Определён оптимальный метод выявления микроорганизмов в воздухе производственных помещений: аспирационный отбор проб с использованием прибора MAS-lOOEco.
Предложен и внедрен усовершенствованный метод дезинфекции молочного оборудования и цехов производства средством «Неосептал ПЕ - 15» в концентрации рабочего раствора 0,12% с экспозицией 10 минут.
Закваска, микрофлора и виды порчи кисломолочного творога
Официально признано, что основоположником вирусологии является русский ботаник Ивановский Д.И., который в 1892 г открыл вирус табачной мозаики. Он установил фитопатогенное действие вируса, но не видел вирусные частицы. Макс Шлезингер первый наблюдал и подсчитал частицы бактериофагов Bacillus megatherium (1933), а Гельмут Руска опубликовал в 1941 году первые сделанные с помощью электронного микроскопа снимки бактериофагов [98, 99].
История исследования бактериофагов берёт начало от описания Ф.В. Твортом в 1915 году колоний микрококков, «стекловидно преобразованных», благодаря переносу агента заражения, а также описания «невидимого антагонизма дизентерийной бациллы» Феликсом д Эрелем (1917). Д Эрель продолжал свои исследования с 1919 по 1926 год, подсчитывая инфекционные частицы бактериофага по бляшкам, которые появляются на газоне чувствительных бактерий, обработанных лизатом.
Дальнейшие успехи в исследовании фагов были достигнуты Ф.М Барнетом. Он открыл (1929-1936) адсорбцию фагов на клетках бактерии-хозяина, размножение фагов в клетке хозяина и внезапное освобождение фагов, а также различие между явлениями иммунитета и резистентности у бактерий. Макс Шлезингер (1932, 1934) впервые использовал метод тёмного поля в микроскопии для учёта этих частиц и смог увидеть их и посчитать [99, 100, 101].
Современные исследования фагов были начаты Максом Дельбрюк вместе с Сальвадором Луриа, и одновременно с ними А.Д. Герши выделил мутантов фагов и исследовал их цикл развития, динамику популяций, а также генетические проблемы бактериофагии.
К наиболее значительным концепциям следует отнести вывод о том, что при инфицировании фагом бактериальной клетки в ней удаётся обнаружить только фаговую ДНК (Hershey und Chase, 1952). Позже были открыты и РНК-содержащие бактериофаги [99].
В 1936 г. Эжен и Элизабет Вольман пришли к заключению, что фаги могут иметь инфекционную и неинфекционную фазы, а также могут содержать часть наследственной структуры бактерии [124]. После 1945 года Андре Львов возобновил опыты Вольмана и показал с помощью микроманипулятора и культуры микроскопической капли, что клетки могут многократно делиться без обнаружения фага. Таким образом, было установлено, что в лизогенной бактерии фаги передаются по наследству в латентном состоянии (профаги). Эстер М. Ледерберг обнаружила (1951), что штамм E.coli, у которого Ледерберг и Татум (1946) открыли конъюгацию, является лизогенным и содержит умеренный фаг. Он был назван лямбда (X) [80, 81].
С конца 1960-х годов возросло число открытий, связанных с локализацией генов на плазмидах, переносимых фагами через конъюгацию (И.К. Гунсалюс, A.M. Чакрабарти, 1969-1973) [125, 131, 132, 136].
В отношении появления бактериофагов при производстве молочных продуктов среди учёных не существовало единого мнения. Так, одни исследователи (М.Р. Гибшман и Н.Н. Белоусова, 1956г; Д.А.Яковлев, 1962 и др.) считали, что первоисточником фага на производстве могут быть: сырое молоко, молочная сыворотка, воздух помещения и т.д. По мнению других — основным источником фага на производстве являются сами культуры (Л. Хьюитт, 1956; С. Луриа и др., 1970; Д.М. Гольдфарб, 1961; Я.И. Раутенштейн, 1971). Такие культуры называют лизогенными [88, 99].
К 1938 году бактериофаг в области медицинской микробиологии был уже хорошо изучен и получил широкое применение как лечебный препарат в борьбе с желудочно-кишечными и другими заболеваниями [41,61].
Впервые в области технической микробиологии бактериофаг был обнаружен в заквасках молочнокислых бактерий новозеландскими учёными Уайтхед и Коксом в 1934 году. Этими учёными впервые был выделен бактериофаг молочнокислых стрептококков, были изучены его свойства и впервые в области технической микробиологии дано описание явления бактериофагии в процессе сквашивания молока в сыродельном производстве [81, 82].
В 1936-1938гг явление бактериофагии было отмечено в практике молочного дела во Франции (Мазе), в Англии (Крослей) и Америке (Нельсон, Хаммер).
В отечественной литературе до 1937 года имелась единственная работа A.M. Скородумовой (1936г), в которой дано описание случая лизиса молочнокислых стрептококков при изготовлении заквасок, но феномена бактериофагии установлено не было.
Учение о бактериофаге в области технической микробиологии получает широкое развитие в послевоенные годы и продолжает углубляться в настоящее время во всех странах мира [99].
Применение электронного микроскопа (1946г) способствовало углублённому изучению бактериофагии [69, 89].
В настоящее время явление бактериофагии и бактериофаг больше всего изучены в молочной промышленности. Установлена исключительная распространённость фага, его выраженная терморезистентность, устойчивость к антисептикам, изучены другие свойства. Выявлены источники появления бактериофага в производственных заквасках, при этом установлено, что основным источником фага является сырое молоко.
Инфицирование заквасок через воздух капельной инфекцией, обсеменение заквасок бактериофагом через аппаратуру и прочее оборудование является незначительным [26, 62, 63, 64, 78].
Бактериофаги - это вирусы бактерий, паразитирующие в бактериальных клетках и вызывающие их лизис с выходом в среду огромного числа новых фаговых частиц. Этим объясняется присутствие гомологичных бактериофагов при наличии чувствительных штаммов бактерий [58, 67].
Скорость размножения бактериофагов настолько велика, что при благоприятных условиях (большое обсеменение бактериофагами исходного сырья, наличие фагочувствительных культур, плохое санитарно-гигиеническое состояние производства и др.) количество бактериофагов в молоке через два часа может увеличиться от 1 до 200000 частиц, тогда как количество клеток полезной микрофлоры за этот же период возрастает лишь в 16 раз. Возможность быстрого размножения бактериофагов приводит к чрезвычайно быстрому накоплению их в производственных цехах предприятий [92, 94, 102, 147].
Цикл развития бактериофагов в клетке включает в себя: адсорбцию; внедрение ДНК в клетку хозяина; формирование фаговых частиц; лизис клетки хозяина.
Прикрепление фага к бактериальной клетке осуществляется с помощью сцепления хвостового отростка бактериофагов с определёнными рецепторами на клеточной оболочке бактерий. Причём каждый тип фага может прикрепляться только к определённому рецептору бактериальной клетки [85].
Методы выявления лактофагов
При определении наиболее эффективного метода обнаружения лактококкофагов были исследованы: метод агаровых слоев, однослойный метод, тест на сквашивание. Материалом для исследования служили пробы, отбираемые для микробиологического контроля технологического процесса, санитарного состояния оборудования, воздуха, пищевых ингредиентов и готовой продукции. Удаление крупных частиц белка и бактериальных клеток производили механическим способом. Механический способ включал доведение рН образца до 4,5-4,8, подогрев до 40С, предварительное фильтрование - через бумажный фильтр. Фильтрование через специальную стерильную систему - шприц-фильтр с размером пор 0,45нм [1, 12, 14, 19, 20].
Метод агаровых слоев основан на том, что каждая частица вируса даёт потомство, определяемое визуально по наличию на газоне чувствительной культуры бактерий зон лизиса, получивших название негативных колоний, бляшек, стерильных пятен. Метод позволяет установить количество фаговых частиц, способных образовывать негативные колонии.
В чашку Петри заливали 15-30 см3 1,5% питательного агара. В пробирку, содержащую 2-3 см3 0,7% питательного агара и температурой около 45С, вносили 0,1-0,3 см3 бульонной культуры или смыва агаровой культуры чувствительного штамма. Затем в смесь добавляли фильтрат, предположительно заражённый фагом, в количестве 1 см . Перемешивали, выливали её на поверхность с 1,5% агаром, распределяли по его поверхности круговыми движениями. После застывания агара чашки переворачивали вниз крышками и инкубировали. Результат учитывали через 4-6 часов. Инкубировали при оптимальной для данных микроорганизмов температуре. В среднем учёт результатов проводили через 16-18 часов инкубации.
При работе с фагами применяли десятикратные разведения. Брали ряд пробирок с 4,5 см жидкой среды. В первую пробирку вносили 0,5 см фага (разведение 10" ), из этой пробирки 0,5 см переносили во вторую (разведение 10"2), из неё 0,5 см3 в третью и т.д. Каждое разведение делали отдельной пипеткой на 1 см3. Подсчёт негативных колоний производили аналогично подсчёту колоний бактерий. При титровании методом агаровых слоев параллельно засевали две чашки с фагом из одного и того же разведения. Титр фага определяли путём подсчёта числа негативных колоний на параллельных чашках и умножения среднего результата на показатель разведения.
Однослойный метод - на чашку Петри с гидролизованным агаром наносили 0,05 см3 бактериальной культуры, содержащей 107 клеток, затем 0,05 см3 исследуемой фаговой суспензии втирали шпателем на поверхность питательного агара и культивировали посевы при оптимальных режимах.
Чашку Петри с агаром делили на сектора восковым карандашом. Исследовали параллельно действие на культуры прогретого (при 90С в течение 10 мин) и непрогретого фильтрата. На поверхность агара наносили каплю культуры и распределяли по поверхности агара. Под углом 45 наносили на сектора по капле исследуемого фильтрата, с таким расчётом, чтобы капля, стекая от края чашки к центру, образовывала на поверхности агара след. Посевы выдерживали 16-18ч при 30С [12].
Если стерильные пятна образовывались в обоих случаях при воздействии прогретого и непрогретого фильтрата, то оценивали, что угнетающий фактор термостабилен и может быть отнесён к антибиотикам или продуктам обмена бактерий. Если же стерильные пятна обнаруживали только на чашках с непрогретым фильтратом, то предполагали наличие в фильтрате бактериофага [14, 20].
Тест на сквашивание используется в тех случаях, когда в состав закваски входят несколько видов культур.
Данный тест является результатом кислотного сквашивания молока под действием молочной кислоты, продуцируемой микроорганизмами. Он служит для непрямого (качественного) обнаружения бактериофага.
С целью дифференциации отклонений рН, вызванных наличием бактериофага и присутствием ингибирующих веществ, нагревали определённое количество стерильного фильтрата до 90С на протяжении 10 минут.
В пробирку, содержащую 9 см обезжиренного стерилизованного молока, вносили 1 см3 приготовленной культуры и перемешивали. Эту пробирку готовили для последующего разведения. з з Далее 1 см разведённой культуры (закваски) перемещали в 9 сзм обезжиренного стерилизованного молока и перемешивали. Эта пробирка являлась контролем. Количество последующих пробирок определялось количеством исследуемых заквасок и количеством исследуемых фильтратов (прогретых и непрогретых).
Разведённую культуру объёмом 1 см переносили в пробирку с 9 см стерильного обезжиренного молока и добавляли 0,1 см непрогретого фильтрата. Это был образец №1.В следующую пробирку добавляли 1 см3 разведённой культуры и 0,1 см3 прогретого фильтрата. Это был образец №2. Пробирки термостатировали на водяной бане при 30С 6 часов.
Момент окончания термостатирования и измерения величины рН определяли визуально по наличию сгустка в пробирке. Если значение рН в образце №1 (содержащем 9 см стерильного обезжиренного молока, 1 см3 разведённой закваски и 0,1 см3 непрогретого фильтрата) было больше чем 0,05Ед по сравнению с контрольной пробиркой (содержащей 9 см стерильного обезжиренного молока и 1 см разведённой закваски) и образцом №2 с прогретым фильтратом, то данная закваска была подвержена воздействию бактериофага. Если наблюдалась задержка кислотообразования в образцах №1 и №2, то это объяснялось присутствием в них термоустойчивых ингибирующих веществ [12].
Частота и интенсивность обсеменения сырого молока бактериями группы кишечных палочек
Состав и количество микрофлоры, используемой при выработке кисломолочных и других продуктов, играет важную роль в получении требуемых показателей качества. В молоке в результате развития микрофлоры происходит ряд биохимических превращений с образованием молочной и других органических кислот, спирта, ароматических соединений, углекислого газа и антибиотических веществ. Продукты жизнедеятельности заквасочных микроорганизмов определяют формирование вкуса, запаха, консистенции кисломолочных продуктов, рисунка сыра, повышение биологической ценности продукта, а также подавляют развитие посторонней нежелательной микрофлоры.
Одной из важнейших микробиологических причин снижения активности молочнокислого процесса при производстве молочных продуктов является поражение микрофлоры заквасок бактериофагами, которые широко распространены на предприятиях молочной промышленности.
Целью данного исследования было определение наиболее чувствительного метода выявления лактофагов и оценка подверженности заквасочных культур, используемых на производстве, воздействию лактококкофагов. Было отобрано 60 проб (30 фильтратов творога и 30 смывов). Для определения присутствия лактококкофагов применяли: тест на сквашивание, однослойный метод и метод агаровых слоев.
В качестве заквасок использовали 4 многоштаммовые заквасочные культуры серии Choozit Direct для молочной промышленности - Choozit 230, Choozit 240 (фирма «Danisco Deutschland GmbH», Германия), Lactina (LAT CW) (производство фирмы «Лактина», Болгария), закваску R-604 (фирма «Христофер Хансен», Дания) и 1 штамм чистой культуры Lac. lactis, выделенный из закваски для производства творога CHOOZIT 230 (фирма «Danisco» Deutschland).
Сравнительные данные эффективности методов выявления лактофагов с использованием закваски Choozit 230 Как следует из таблицы 8 и рисунка 10, чаще лактофаги выявляли в пробах творога, чем в смывах с танков.
Достоверных различий между выявлением бактериофагов с помощью теста на сквашивание и однослойного метода выявлено не было (р 0,05). При использовании закваски Choozit 230 для выявления бактериофагов из смывов с ферментационных танков, наиболее чувствительным методом оказался метод агаровых слоев (70,0%). В тесте на сквашивание положительные результаты получены в 43,3% случаев (р=0,037) по сравнению с методом агаровых слоев, а в однослойном методе - в 36,7% образцов (р=0,0097).
При исследовании творога на содержание бактериофагов наибольшее количество положительных проб определено методом агаровых слоев (73,3%), что достоверно отличается от результатов теста на сквашивание (46,7%, р=0,035) и однослойного метода (36,7%, р=0,0033). " Из-шолученных данных следует, что наиболее эффективным методом выявления лактофагов при использовании закваски Choozit 230 являлся метод агаровых слоев, при помощи которого лактофаги выявлялся в 70% и более исследуемых образцов. Таблица 9 Эффективность методов выявления лактофагов в смывах, твороге с использованием закваски Choozit 2 Образец Методы исследования Тест на сквашивание Однослойный метод Метод агаровых слоев Частота выявления лактофагов (%) Смывы с танков 13 (43,3±14,5%) 10(33,3±13,6%) 21 (70,0±13,1% ) Продукт (творог) 12 (40,0±14,2%) 13 (43,3±14,5%) 23 (76,7±11,7% ) Примечание: - достоверность различий р 0,05 по сравнению с другими методами. Как следует из таблицы 9, наиболее эффективным методом выявления лактофагов с использованием закваски Choozit 240 являлся метод агаровых слоев, при помощи которого лактофаги в исследуемых образцах обнаруживали в 70,0% - 76,7%. При использовании однослойного метода и теста на сквашивание, бактериофаги выявляли в 1,5-2 раза меньше, чем методом агаровых слоев.
С помощью теста на сквашивание и однослойного метода с использованием закваски Choozit 240 бактериофаги выявлены в смывах с ферментационных танков в 43,3% и 33,3% случаях соответственно.
При исследовании смывов методом агаровых слоев положительный результат получен в 70,0% проб (р 0,05.)
При исследовании продукта на содержание бактериофагов наибольшее количество положительных проб определено методом агаровых слоев (76,7%о), что достоверно отличается от результатов теста на сквашивание и однослойного метода (40,0%, р=0,0084 и 43,3%, р=0,004, соответственно). Примечание: - достоверность различий р 0,05 по сравнению с другими методами. Рис.11. Сравнительные данные трех методов эффективности выявления лактофагов с использованием закваски Choozit 240 Как следует из рисунка 11, достоверных различий между выявлением лактофагов с помощью теста на сквашивание и однослойным методом практически выявлено не было (р 0,05). Таблица 10
Эффективность методов выявления лактофагов в смывах, твороге при использовании закваски Lactina ( LAT CW) Образец Методы исследования Тест на сквашивание Однослойный метод Метод агаровых слоев Частота выявления лактофагов(%) Смывы с танков 10 (33,3±13,6%) 9 (30,0±13,06%) 18 (60,0± 13,06% ) Продукт (творог) 12 (40,0±14,2%) 11 (Зб,7±13,9%) 20 (66,7±13,6% ) Примечание: - достоверность различий р 0,05 по сравнению с другими методами. Как следует из таблицы 10 и рисунка 12, наиболее эффективным методом выявления лактофагов с использованием закваски Lactina (LAT CW), являлся метод агаровых слоев, при помощи которого в исследуемых пробах лактофаги обнаруживали в 60,0%-66,7% случаев. Тестом на сквашивание лактофаги выявляли в 33,3% - 40,0% случаев, однослойным методом лактофаги были обнаружены в 30,0%-36,7% исследованных образцов.
При использовании закваски Lactina (LAT CW) для выявления бактериофагов из смывов с ферментационных танков, наиболее чувствительным оказался метод агаровых слоев (60,0%), чем тест на сквашивание (33,3%, р=0,038) и однослойный метод (30,0%, р=0,019). При исследовании продукта на содержание бактериофагов большее количество положительных проб определено методом агаровых слоев (66,7%), что достоверно отличается от результатов теста на сквашивание (40,0%, р=0,038) и однослойного метода (36,7%, р=0,021).
Эффективность методов выявления лактококкофагов с использованием различных заквасочных культур
При сравнении содержания КМАФАнМ на различных участках было выявлено, что их достоверно больше на участке «транспортный коридор» -5266,7±375,6 КОЕ/м , чем на участке производства кефира, ряженки простокваши - 1969,3±198,2 (р=0,0015), участке производства йогурта -1113,3±56,9 (р=0,00039) и участке производства творога - 610,3±22,7 (р=0,000245). На участке производства кефира, ряженки, простокваши достоверно больше выявлено КМАФАнМ, чем на участке производства йогурта (р=0,0142) и участке производства творога (р=0,0024). А на участке производства йогурта достоверно больше, чем на участке производства творога (р=0,0012). При анализе содержания дрожжей на различных участках было выявлено, что их количество достоверно больше на участке «транспортный коридор» - 253,3±29,1 КОЕ/м3, чем на участке производства йогурта - 85,0±9,6 (р=0,0053) и участке производства творога - 61,0±8,2 (р=Ю,0031), а при сравнении с участком производства кефира, ряженки, простокваши различий выявлено не было - 160,0±26,5 (р=0,076). На участке производства кефира, ряженки, простокваши достоверно больше выявлено дрожжей, чем на участке производства творога (р=0,023), различия по сравнению с участком производства йогурта не достоверны (р=0,056). Так же не было выявлено различия в содержании дрожжей между участком производства йогурта и участком производства творога (р=0,13).
При сравнении содержания плесени на различных участках было выявлено, что их достоверно больше на участке «транспортный коридор» -703,3±29,1 КОЕ/м3, чем на участке производства кефира, ряженки, простокваши - 453,3±27,7 (р=0,0034), участке производства йогурта - 532,0±28,0 (р=0,013) и участке производства творога - 402,3±18,1 (р=0,00092). Различий в содержании плесени между участком производства кефира, ряженки, простокваши, участком производства йогурта (р=0,198) и участком производства творога не обнаружено (р=0,116). А на участке производства йогурта их достоверно больше, чем на участке производства творога (р=0,00177).
Выявлено, что содержание лактококкофагов достоверно больше на участке «транспортный коридор» - 246,7±24,0 БОЕ/м , чем на участке производства йогурта - 102,0±12,1 (р=0,0058) и участке производства творога -92,0±12,2 (р=0,0046), а при сравнении с участком производства кефира, ряженки, простокваши различий выявлено не было - 193,3±14,9 (р=0,13). На участке производства кефира, ряженки, простокваши достоверно больше выявлено лактококкофагов, чем на участке производства творога (р=0,0063) и участке производства йогурта (р=0,009). Так же не было выявлено различий в содержании лактококкофагов между участком производства йогурта и участком производства творога (р=0,59). Лактококкофаги
Различий по частоте положительных проб при определении КМАФАнМ и лактококкофагов между методами установлено не было.
Аспирационные методы выявили достоверно большее число положительных проб, чем седиментационный метод на транспортном участке, а на участке производства кефира, ряженки, простокваши достоверные отличия по частоте выявляемых проб обнаружены между седиментационным методом и аспирационным методом с помощью прибора MAS 100 Eco. Также с помощью седиментационного метода выявлено достоверно меньшее количество положительных проб на плесени, чем прибором ПУ-1Б и прибором MAS 100 Eco на участке транспортного коридора. Достоверных различий между участками по содержанию дрожжей, плесеней и лактофагов выявлено не было. Содержание КМАФАнМ достоверно больше на участке «транспортный коридор», чем на участках производства кефира, ряженки и простокваши (р=0,049), йогурта (р=0,021) и творога (р=0,0064). 3.1.9. Микрофлора и эффективность дезинфекции производственного оборудования
Целью данного исследования являлось определение эффективности дезинфекции производственного оборудования дезинфицирующим средством «Неосептал ПЕ - 15» (Германия). Данный препарат является водным раствором стабилизированной смеси перекиси водорода и надуксусной кислоты (НУК).
Объектами дезинфекции служили внешняя поверхность резервуаров молочных цистерн. В процессе исследования устанавливали наличие БГКП, Е. соН, дрожжей, плесеней, лактофагов, колифагов до и после проведения дезинфекции (по 80 смывов).
Для проведения эксперимента готовили рабочие растворы средства с концентрацией 0,09%; 0,12%; 0,15% по препарату и 0,015%; 0,020%; 0,025% по надуксусной кислоте (НУК) соответственно.
Для удаления белково-жировых загрязнений с поверхностей оборудования проводили механическую мойку тёплой водой (50-55С) в течение 5 минут. Затем осуществлялась обработка щелочным средством «Деомол - А» (Воскресенский завод химических реагентов) с температурой 70С в течение 5 минут, ручная механическая обработка поверхностей щётками, ополаскивание чистой водой с температурой 22-25С от щелочного средства в течение 5 минут. Далее на поверхности оборудования наносили растворы «Неосептал ПЕ 15» с температурой 15-45 С. Расход рабочих растворов составлял 0,3 дм3 на 1 м2, а экспозиция - Юмин. Удаление дезинфицирующих растворов производили путём ополаскивания чистой водой с температурой 22-25С в течение 10-15 минут.
Как видно из рисунка 2, обработка 0,09%-м раствором «Неосептал ПЕ -15» обеспечивала полную инактивацию БГКП, Е. соН и бактериофагов, и снижала частоту обнаружения дрожжей и плесеней в 14 и 4 раза соответственно. Использование растворов в концентрациях 0,12% и 0,15% приводило к полной дезинфекции поверхностей. Таким образом, наиболее эффективной и экономически обоснованной являлась дезинфекция с использованием средства в концентрации рабочего раствора 0,12% (0,020% надуксусной кислоты) с экспозицией 10 минут. Результаты изучения эффективности применения «Неосептал ПЕ - 15» в концентрациях 0,09%, 0,12%, 0,15% для дезинфекции молочного оборудования В результате проведённого микробиологического исследования смывов с оборудования, установлено, что до дезинфекции БГКП выявлены в 4 (5,0%) случаях, Е.соИ - в 3 (3,8%) случаях, дрожжи - в 28 (35,0%) случаях, плесени - в 15 (18,8%) случаях, лактофаг - в 11 (13,8%) случаях, колифаг - в 2 (2,5%) случаях.
После дезинфекции в результате проведённого микробиологического исследования смывов с оборудования были выявлены дрожжи в 2-х (2,5%) случаях, плесени в 4-х(5,0%) случаях при использовании рабочего раствора в концентрации 0,09% (0,015% НУК).
При использовании рабочего раствора в концентрациях 0,12% (0,020% НУК) и 0,15% (0,025% НУК) плесеней и других микроорганизмов выявлено не было.
Наиболее эффективным и экономически обоснованным явилась дезинфекция с использованием средства в концентрации рабочего раствора 0,12% (0,020% надуксусной кислоты) с экспозицией 10 минут.
Целью данного исследования было изучение динамики изменения микрофлоры на различных этапах производства творога.
Объектами исследования являлись предполагаемые основные источники обсеменения готового продукта микроорганизмами. Титры лактококкофагов определяли методом агаровых слоев, количество микроорганизмов в воздухе выявляли аспирационным методом при помощи прибора MAS-100 Есо. С каждого технологического этапа производства творога было отобрано по 100 образцов.
